at2受体对成年大鼠心肌成纤维细胞et1蛋白及其mrna水平的影响

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1、AT2受体对成年大鼠心肌成纤维细胞ET1蛋白及其mRNA水平的影响【关键词】心肌成纤维细胞；　AT2受体；　AT1受体；ET1　　1材料和方法　　1.1材料　　雄性SD大鼠，体质量230~250g（西安交通大学医学院实验动物中心提供）；血管紧张素Ⅱ（angiotensinII，AngⅡ），受体特异性阻断剂（PD123319）（美国Sigma公司）；氯沙坦（losartan，Los）（美国DuPontMerkPharmaceuticals公司）；RTPCR试剂（美国Promega公司）；内皮素1(endothelin1,ET1)放免试剂盒(解放军总医院科技开发中心

2、放免所)；兔抗大鼠AT2多抗(武汉博士德公司).　　1.2方法　　1.2.1大鼠心肌成纤维细胞的分离培养　　采用西安交通大学医学院生理学与病理生理学教研室已建立的胶原酶Ⅰ，胰蛋白酶消化及差速贴壁的方法分离培养原代心肌成纤维细胞(cardiacfibroblasts，CFs).细胞培养至亚融合状态经12h无血清预适应后,进行药物干预.　　1.2.2免疫组化测定　　AT2表达将细胞分为6组：对照组，1mol/LAngⅡ组，10mol/LLos组和0.1,1,10mol/LAngⅡ+10mol/LLos组.药物作用48h后进行常规免疫组化.　　1.2.3RTPCR检测　　

3、ET1mRNA水平将细胞分为3组：AngⅡ组，AngⅡ+Los组，AngⅡ+PD123319组.药物浓度均为10mol/L,作用48h后抽提细胞总RNA逆转录合成cDNA,进行30个循环的扩增（94℃变性，1min;65℃或57℃退火，1min;72℃延伸，1min）；72℃延伸5min.ET1引物：sense:5＇CAGGTCCAAGCGTTGCTCCTGCTCCTCC3＇;antisense:5＇CACCACGGGGCTCTGTAGTCAATGTGCTCG3＇,产物长度483bp.βactin:sense:5＇CCTGTACGCCAACACAGT

4、GC3＇;antisense:5＇ATACTCCTGCTTGCTGATCC3＇,产物长度211bp.琼脂糖凝胶电泳后扫描DNA条带灰度，以ET1与βactin的比值作为半定量指标.　　1.2.4放免法检测　　ET1的分泌将细胞分为4组：对照组，AngⅡ组，AngⅡ+Los组，AngⅡ+PD123319组，药物浓度均为10mol/L,48h后收集细胞上清液，按ET1放免试剂盒说明书进行测定，检测范围：10~2000pg/mL.　　统计学处理:数据以x±s表示,用SPSS10.0统计软件进行方差分析,P0.05为差异有统计学意义.　　2结果　　2.1AT2受

5、体的表达　　在6组细胞中，仅在10mol/LAngⅡ+10mol/LLos组观测到AT2受体呈现高表达，其余各组没有表达AT2受体，呈阴性结果.　　2.2ET1mRNA的表达　　半定量统计分析结果显示：ET1mRNA水平在AngⅡ组，AngⅡ+Los组和AngⅡ+PD123319组分别为0.883±0.031,0.881±0.023和0.860±0.040,与AngⅡ组相比较，Los阻断AT1受体和PD123319阻断AT2受体，对ET1mRNA的表达未见影响（n=6，P>0.05，图1）.　　2.3ET1的分泌　　ET1在对照组，AngⅡ组，AngⅡ+L

6、os组和AngⅡ+PD123319组细胞上清液中的水平分别为：（99.83±13.87）pg/mL，（166.30±14.56）pg/mL，（98.23±13.01）pg/mL和（112.47±15.93）pg/mL，统计分析结果显示：AngⅡ诱导可显著增加CFs分泌ET1；Los和PD123319均可下调ET1的分泌（n=9，P0.05）.与AngⅡ组相比，Los阻断AT1受体下调ET1的分泌约为25.1%；PD123319阻断AT2受体下调ET1的分泌约为14.2%（P0.05）.　　3讨论　　许多研究表明AngⅡ可促使CFs分泌ET1，ET1能刺激CFs增殖，

7、ET1作用于CFs还能诱导ET1基因自身的表达，且17betaoestradiol能抑制AngⅡ诱导的ET1基因的表达〔1〕.AngⅡ增加ET1的表达是其诱导CFs增殖和间质纤维化的关键因素〔2〕.AT2受体在成人机体仅限于几个器官的低水平表达，但在组织重塑和炎症中表达增强，蕴涵着可能的病理意义〔3〕.有研究发现AT2受体在信号转导机制上与AT1受体存在显著差异〔4〕.我们的研究表明：AngⅡ能使成年大鼠CFs分泌ET1显著增加；Los阻断AT1受体和PD123319阻断AT2受体，在ET1mRNA水平上都没有产生影响；但在蛋白质水平，两者都减少了ET1的分