镍离子金属螯合亲和层析介质使用说明书(完全版)

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1、镍离子金属螯合亲和层析介质使用说明书（完全版）一、简介三、适用范围金属螯合亲和层析，又称固定金属离子亲和色分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、谱，其纯化原理是利用蛋白质表面的组氨酸与多种蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。2+2+2+2+3+过渡金属离子如Cu，Zn，Ni，Co，Fe形成四、E.coli表达可溶性his重组蛋白纯化操作说明配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋1.缓冲液配制白质，从而达到分离纯化的目的。因此，固定有这ò缓冲液A（平衡缓冲液）：10mMNa2HPO4，些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地纯化这1.8mMKH2PO4

2、，140mMNaCl，2.7mMKCl，类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。半胱用高浓度NaOHl调节pH值至8.0。氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组ò缓冲液B（洗脱缓冲液）：50mMNaH2PO4，氨酸残基，对纯化影响不大。300mMNaCl，500mMimidazole（咪唑），用纯泰特殊结构设计的镍离子金属螯合亲和层高浓度NaOHl调节pH值至8.0。析介质包括Ni-NTA和Ni-IDA两种配体，既具有特ò缓冲液C（咪唑浓度稀释液）：50mMNaH2PO4，异性好、螯合镍更稳定，镍离子脱落少，使用寿命300mMNaCl，用高浓度

3、NaOH调节pH值至8.0。长的优势，同时具有基础层析介质颗粒粒度均匀，注：如使用试剂盒，盒中提供10×缓冲液A、1×缓冲流速快的优点，并且物理和化学稳定性好，能耐受液B和10×缓冲液C的配制干粉。分别在缓冲液A和C更高浓度的还原剂、变性剂和去垢剂，批次重复性的盛装容器中加入双蒸水定容至100ml，得到缓冲好，质量稳定。本产品已经螯合好镍离子，使用更液A和C的10倍浓缩液，使用时根据需要取一定量进方便。行10倍稀释，即得到上述正常使用浓度的两种溶注：镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA螯合了四价，液。缓冲液B的每包配制干粉可配制1×缓冲液B剩余两价；

4、而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此500ml，配制时将一包干粉先溶于适量双蒸水中，Ni-IDAAgarose结合作用力要比Ni-NTAAgarose最后定容至500ml。每种缓冲液均应在稀释成正常强，在同样条件下Ni-IDAAgarose的载量要比使用浓度以后，再调节pH值。Ni-NTAAgarose高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用ò缓冲液D（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液B和缓的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTAAgarose更稳冲液C按不同比例配制，配制比例如下（100ml定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。具体总体积）：应用何种介质视个人

5、习惯以及纯化条件而定。咪唑浓度缓冲液C(ml)缓冲液B(ml)二、性能参数0mM1000特殊NTA、IDA结构设计，蛋白载10mM982特点量大，专一性高，使用寿命长20mM964基质6%的交联琼脂糖凝胶50mM90102+2+配体NTA-Ni/IDA-Ni60mM8812配体密度20~40μmol/ml100mM8020吸附载量≥30mg蛋白(60kda)/ml150mM7030介质平均粒径100μm最大流速600cm/h200mM60403~10，在位清洗时pH范围可到250mM5050pH范围2~11400mM2080保存温度+4~8℃各种溶

6、液配制完毕后，最好进行脱气处理，保存液体20%乙醇0.45μm滤膜过滤备用。2.样品预处理：按每克湿重菌体/4~5ml缓冲液A的比例充分悬_____________________________________________________地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路333号A505室邮编：201203电邮：order@purify.org.cn电话：021-50797319传真：021-50797322网址：www.purify.org.cn-1-浮离心收集的菌体，400w功率下，每个循环超声3s，合蛋白；冷却2s，共循环180次

7、破碎菌体；4℃、13000rpm离4)用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D心15m，收集上清液或用0.45μm滤膜过滤，并用高洗脱；浓度NaOH调节pH至8.0待上样。V最高纯度洗脱方案：用含0、60、100、150、200、250mM咪唑的缓冲液D分步洗脱，每3.装柱：个梯度2~3倍介质体积洗脱；ò聚苯乙烯层析柱V最高收率洗脱方案：先用5~10倍介质体积1)将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用5~10倍柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱。空气，先将垫片完全浸没

8、于水面下方，在保持注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方保持在0.5ml/