酶类实验测定方法

《酶类实验测定方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、酶类实验测定方法验方李菁华2016.6法实一叶片相对含水量（RWC）采用烘干称重法测定将叶片称鲜重（Fw）等量两份，然后一份浸入去离子水8h后称其饱和鲜重（Tw）,将另一份材料于105°C烘箱中杀青30min，再在80°C下烘干48h至恒重记为干重（Dw）,按如下公式计算（Fw-Dw）叶片相对含水量（％）X100%（Tw-Dw）邹琦.植物生理学实验指导M.北京：中国农业出版社，2000二根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶

2、于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、试剂1）乙酸乙酯（分析纯）2)连二亚硫酸钠(Na2S2O4),分析纯，粉末，俗称保险粉。3)0.4%TTC(又名红四氮唑、2,3,5-氯化三苯基四氮唑)溶液：准确称取TTC0.4g,溶于少量水中，定容

3、到100ml。4)磷酸缓冲液(l/15mol•L,pH7.0):A液:称取纯Na2HPO4•2H2O11.876g溶于蒸馏水中成1000ml。B液：称取纯KH2PO49.078g溶于蒸馏水中成1000ml。用时取A液60ml，B液40ml混合即成。5)lmol*L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸5.5ml，边搅拌边加入盛有100ml蒸榴水的烧杯中，冷却定容至100ml。-1-1三、实验步骤1)TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml容量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红

4、色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25Pg、50Pg、100Ug、150Mg、200Pg的标准t匕色系列，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。2)取出大豆根系洗净，用滤纸吸干水分，称取lcm长的根尖样品0.2g，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml,把根充分浸没在溶液内，在37°C下暗保温1〜3h(2h),此后

5、加入lmol*L硫酸2ml，以停止反应。(与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，lOmin后其他操作同上)。3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出TTF。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2-3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色，以空0实验作参比读出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮畦还原量-1四、结果计算四氨卩坐还原强度（mg*g根鲜重h）=四氨哩还原量（mg）/根重（g）X时间（h）王晶英，敖红，

6、张杰，曲桂琴.植物生理生化实验技术与原理M.哈尔滨:东北林业大学出版社，2003.7-1-1三氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）一、原理SOD是含金属辅基的酶。高等植物含冇两种类型的SOD:Mn-SOD和Cu.Zn-SOD,它们都催化下列反应：由于超氧0由基（02）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子02—..一，当加入NBT后，在光照条件下,与超氧自由基反应生成单甲臜（黄色），继而还原生成二甲

7、臜，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和02,从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲臜生成速度减慢。通过+在反应液屮加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。二、试剂1.0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8)：A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO4*12H2O(分子量358.14)71.7g；B

8、母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O(分子量156.01)31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS(pH7.8)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。2.14.5mM甲硫氨酸溶液:称取1.0818gMet用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至500ml。3.3mMEDTA-Na2溶液:称取0.