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《穿膜肽引导的体外表达转录因子蛋白sox2进入红鳍东方鲀精巢细胞系》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、中国水产科学2014年11月,21(6):11651171JournalofFisherySciencesofChina研究论文DOI:10.3724/SP.J.1118.2014.01165穿膜肽引导的体外表达转录因子蛋白Sox2进入红鳍东方鲀精巢细胞系111211杨秀霞,侯雪宁,徐彬,郝萧,姜国建,樊廷俊1.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;2.北京协和医学院基础研究所,北京100005摘要:为了探索适用于体外培养的鱼细胞外源基因转入方法,本研究通过构建红鳍东方鲀(Takifugurubripes)转录因子S
2、ox2的重组表达载体pET32a(+)-Sox2-11R-6His,诱导表达并纯化得到了C末端连接多聚精氨酸(11R)的重组蛋白Sox2-11R-6His,以其与红鳍东方鲀精巢细胞系细胞共孵育12h后,光镜观察结合WesternBlot检测发现重组蛋白进入细胞的效率与浓度呈剂量依赖关系且最佳孵育浓度为8μg/mL,当重组蛋白质量浓度达到10μg/mL时,表现出明显的细胞毒性。对外源蛋白进行免疫荧光标记定位,发现重组蛋白分布于细胞质,部分进入到细胞核中。证明了穿膜肽11R可以有效运载转录因子重组蛋白至红鳍东方鲀的细胞系细胞中。本研
3、究旨在将广泛应用于哺乳动物的细胞基因递送载体穿膜肽应用于鱼类细胞系细胞。关键词:红鳍东方鲀;Sox2;穿膜肽;重组蛋白;精巢细胞系中图分类号:S917文献标志码:A文章编号:10058737(2014)06116507连续性细胞系是指能够连续传代的细胞。鱼是一类具有穿透细胞膜能力的短肽,通常不超过类细胞系最初是为研究鱼类病毒而建立的,后来30个氨基酸残基。能够携带多肽、蛋白质及核酸应用范围逐渐扩大,广泛应用到鱼类遗传学和功分子等生物活性物质进入细胞,并且导入后依然[3]能基因组学等学科领域。在对鱼细胞进行转基因保持生物活
4、性。Tamura等报道,将转录因子研究上,大多借鉴哺乳动物的研究方法,采用脂STAT-6抑制肽与HIV-Tat来源的PTD4(protein质体转染试剂及操作,其效率与受体细胞类型、transductiondomain,PTD)交联后,可以降低小鼠[1]细胞分化状态及细胞来源息息相关,因而在介体内卵白蛋白引起的炎症反应。而且穿膜肽导入的[2]导外源基因进入鱼细胞时效率不稳定。随着研细胞谱广泛,包括对DNA转染和逆转录病毒感染[4–6]究的深入,新的基因转入系统被开发,如Huang都不起作用的破骨细胞和外周血单核细胞。[2][7]
5、等构建了来自昆虫的杆状病毒载体系统,分别Kumar等报道,将狂犬病毒的糖蛋白RVG和含对斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)卵巢细胞等69个精氨酸残基的小肽交联组成的RVG-9R,不仅种鱼细胞系细胞进行基因转入研究,结果发现最能特异性地将siRNA递送进神经细胞中,并且[8]高效率几乎达到100%,但最低效率只有30%,说能穿过血脑屏障。Simeoni等证明穿膜肽MPG明该系统同样存在较强细胞偏好性。因而需要针能够以不破坏核膜的方式运送核酸,并且在原代对不同的鱼细胞开发各自适用的基因导入系统。及不分裂的细胞系中也可
6、获得很高的转入效率。细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides,CPPs)转录因子Sox2是SOX家族成员之一,SOX基收稿日期:2013-12-23;修订日期:2014-05-12.基金项目:国家自然科学基金资助项目(31001100).作者简介:杨秀霞(1976–),副教授.E-mail:xxyang@ouc.edu.cn1166中国水产科学第21卷因家族编码一组进化上高度保守的转录因子,包11R/R:5′-AATTCTTAACGGCGACGGCGACGGCG含HMG-box(highmobilitygro
7、upbox)框。在维持ACGGCGACGGCGACGGCCCGGGCTGCCACC[9][10]细胞多潜能性方面具有重要作用。Takahashi等GCCACCGCTTTCG-3′证明Sox2和Oct4等4个转录因子基因导入小鼠PCR反应条件为:94℃℃℃5min;9430s,58和人等哺乳动物成纤维细胞后,可以通过激活一30s,72℃90s,计30个循环;72℃10min。PCR系列胚胎干细胞相关因子,实现体细胞重编程,反应产物纯化并经限制性内切酶KpnⅠ和BamH获得诱导性多能干细胞。其中Sox2是必不可少的Ⅰ酶切后,与Bam
8、HⅠ和EcoRⅠ酶切后的穿膜肽因子之一,因而研究Sox2的基因功能对于了解体11R及KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的原核表达载体细胞的重编程机制具有非常重要的意义。pET32a(+)进行连接,后转化大肠杆菌BL21。重本研究旨在将已广泛应用于哺乳动物细胞的基组表达载
