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1、2008年第4期中国甜菜糖业2008No42008年12月CHINABEET&SUGARDec2008转RIPs基因甜菜的分子检测和抗病性鉴定*马天婕,孙亚卿,史树德,张少英(内蒙古农业大学甜菜生理研究所,内蒙古呼和浩特010018)摘要:对利用农杆菌介导法转化的经卡那霉素筛选的转核糖体失活蛋白(RIPs)基因甜菜植株进行PCR和RT-PCR检测,并对分子检测呈阳性的转基因甜菜植株接种甜菜褐斑病菌,接种20d后,发现75%植株具有抗病性。关键词:转基因甜菜;RIPs
2、基因;分子检测;抗病性中图分类号:S5663文献标识码:A文章编号:1002-0551(2008)04-0001-03病害是甜菜生产中影响其产质量的主要因素(2)PCR反应:以质粒DNA作为反应正对照,之一。甜菜病害包括细菌、真菌以及病毒引起的立H2O作为负对照。根据RIPs基因序列设计引物,枯病、根腐病、褐斑病、蛇眼病、黄化病毒病和丛根扩增片断长度为953bp。25L反应体系如下:病等多种病害,这些病害对甜菜的产量和质量都造PCRmix125L;ForwardPrimer05L;Reverse成了严
3、重的危害,成为甜菜生产和制糖业发展的障Primer05L;模板DNA2L;加ddH2O至终体积碍。对于甜菜诸多病害的防治,选育抗病品种是最25L。有效的途径,通过基因工程手段获得抗病品种是有反应条件:94预变性5min,94变性50sec,效的解决途径之一。目前甜菜基因工程存在的主55复性50sec,72延伸1min,30个循环,72延要问题是研究中所用到的目的基因单一、受体系统伸10min,4结束反应。转化率低、基因型依赖性强、操作方法不够简便等。反应完毕后,取5L反应扩增产物在1%琼脂核糖体失活蛋白(R
4、IPs)是一类具有抑制病菌生长糖凝胶中电泳检测,确定阳性植株。增殖能力的蛋白质之一,对真菌、细菌、病毒等具有122RT-PCR检测广谱抗性。本项研究是通过农杆菌转化法将RIPs(1)甜菜组织总RNA的提取:利用UNIQ-10基因导入甜菜,对经卡那霉素筛选的转基因植株进柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(上海生工生物工程行PCR和RT-PCR检测,并对其进行抗病性鉴定技术服务有限公司)按其说明书提供的方法进行。及其他性状的进一步观察,从而筛选出抗病性兼具(2)RT-PCR反应:PolyAmRNA第一链反转录其他优良性状的转基
5、因株系,为甜菜抗病育种提供采用RNAPCR体系(TOYOBO)。反应体系如下:5基础材料和依据。RTbuffer2L;dNTP(10mM)1L;OligodT-adap-torprimer05L;TotalRNA05g;RNaseinhibitor1试验材料与方法(40u/mL)05L;AMVReversetranscriptase05L;RNasefreeH2O至10L。11植物材料42反应45min,95反应5min后,置于4。转RIPs基因的甜菜植株。反转录产物(或稀释10倍)后可直接用
6、于PCR检12转基因甜菜植株的分子检测测,以甜菜actin作为内对照,校正RT-PCR反应121PCR检测的模板量;PCR反应循环数依照不同基因的表达强(1)甜菜组织总DNA的提取:以改进的植物弱而定。DNA小量法提取移栽成活的甜菜小苗叶片DNA进13转基因甜菜植株的抗病性检测行PCR检测。131甜菜褐斑病菌培养(1)培养基的配制:PDA培养基。收稿日期:2008-03-17(2)病菌的分离纯化:病菌分离采用组织分离基金项目:国家自然科学基金(30440048)、内蒙古自然科学基金法,剪取甜菜叶上4~5mm含
7、病斑的方块组织,经(200408020303)表面消毒和灭菌水洗后移在PDA平板上。28恒作者简介:马天婕(1980-),女,内蒙古赤峰市人,内蒙古农业大温培养箱中培养3~5d,即可见方块组织的刀口边学甜菜生理研究所,在读硕士,研究方向为甜菜生理。缘处有菌丝长出,挑取单菌丝尖端转移纯化。*通讯作者:张少英,内蒙古农业大学甜菜生理研究所,教授。132转基因植株接种选择生长健壮甜菜植E-mail:syzh36@yahoocomcn株,取PDA培养基上生长旺盛的菌株制成孢子悬2中国甜菜
8、糖业第4期液;傍晚喷雾接种,保持湿度和温度。20d后记载株及对照植株的cDNA为模板,以RIPs基因的特异发病情况,共处理8株。野生型甜菜作为对照。引物进行PCR扩增反应,转基因的甜菜植株中扩增出特异条带,而野生型植株未出现阳性条带
