_胡萝卜素加强的转基因水稻培育

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1、第３３卷第５期华中农业大学学报Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．５２０１４年９月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｅｐ．２０１４，１～７β－胡萝卜素加强的转基因水稻培育杜丽缺赵明超林拥军陈浩华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室／华中农业大学国家植物基因研究中心（武汉），武汉４３００７０摘要为了使水稻种子积累维生素Ａ的前体———β－胡萝卜素，将人工合成的来源于欧文氏菌的八氢番茄红素脱氢酶基因（ｃｒｔＩ）和来源于玉米的八氢番茄红素合酶基因（ｐｓｙ）导入水稻中，且在水稻胚乳中特异性表达。结合ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔ

2、ｉｎｇ的检测结果，从ｐｓｙ／ｃｒｔＩ转化植株中分离得到１个外源基因单拷贝插入且无选择标记（Ｍａｒｋｅｒ－ｆｒｅｅ）的纯合转基因家系ｋｙ１－４。通过热不对称交错ＰＣＲ（Ｔａｉｌ－ＰＣＲ）分离得到ｋｙ１－４的Ｔ－ＤＮＡ插入位点右边界的侧翼序列，结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测结果推测该插入位点位于水稻第１１号染色体上。超高效液相色谱（ＵＰＬＣ）分析结果表明，ｐｓｙ／ｃｒｔＩ转化水稻植株种子中β－胡萝卜素含量为（１．９９±０．１１）～（４．４１±０．３０）μｇ／ｇ，其中ｋｙ１－４家系β－胡萝卜素的含量为（３．１１±０．０８）μｇ／ｇ。关键词水稻；维

3、生素Ａ；八氢番茄红素合酶；八氢番茄红素脱氢酶；黄金米中图分类号Ｓ５１１；Ｑ７８５文献标识码Ａ文章编号１０００－２４２１（２０１４）０５－０００１－０７DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2014.05.025维生素Ａ是人体必需的微量元素，如果人体维期的中间产物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸，该产物在生素Ａ摄入量不足，临床症状常表现为夜盲症、眼八氢番茄红素合成酶的作用下，转化为胡萝卜素八［１］［８］球干燥、角膜软化，严重的甚至导致失明。研究还氢番茄红素。随着植物中类胡萝卜素生物合成途［２］发现，维生素Ａ缺乏导致人体免疫力降低，并伴径逐步被阐明

4、，人们开始探索在植物中调节各种相［３］［４－５］随腹泻、呼吸道疾病和麻疹等并发症。据估关合成酶的表达从而调控类胡萝卜素的代谢途径。算，全球约有１．２４亿儿童维生素Ａ摄入量不足，如例如，在油菜籽粒中超表达细菌八氢番茄红素合酶，果改善饮食条件每年可避免一百万至两百万儿童的结果显示番茄红素、α－胡萝卜素及β－胡萝卜素的含［５］［９］死亡。量显著增加。在水稻胚乳中特异性表达类胡萝卜人体自身不能合成维生素Ａ，需要通过饮食补素，八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶和番茄充。其中，类胡萝卜素是维生素Ａ的唯一前体，且红素环化酶（ｌｙｃｏｐｅｎｅβ－ｃｙｃｌａｓｅ）共

5、转化的植株中显是人类饮食中重要的植物色素。根据结构的不同，示类胡萝卜素积累量达１．６μｇ／ｇ，即Ｇｏｌｄｅｎ［１０］将其分为叶黄素和胡萝卜素两大类。胡萝卜素由植ｒｉｃｅ１。随后又报道Ｇｏｌｄｅｎｒｉｃｅ２，将玉米来源的物合成，但动物不能制造，它包括α－胡萝卜素、β－胡八氢番茄红素合酶和细菌欧文氏菌来源的八氢番茄萝卜素、γ－胡萝卜素等多异构体。其中β－胡萝卜素红素脱氢酶转化到水稻籽粒中，且在胚乳特异性谷在人体内与维生素Ａ共存在，是主要的维生素Ａ蛋白启动子的驱动下表达，数据显示类胡萝卜素总［６］源。１个分子的β－胡萝卜素经裂解形成２个分子量为３７．０μｇ

6、／ｇ，比“Ｇｏｌｄｅｎｒｉｃｅ１”中含量增加２３［７］［１１］的视黄酸，视黄酸是动物体内维生素Ａ代谢途径倍，且优先积累β－胡萝卜素。中国是个人口大中的中间产物。国，以水稻为主食，因此提高水稻胚乳中β－胡萝卜素在全球范围内，水稻是重要的粮食作物之一。的积累含量迫切需要。本研究将玉米来源的八氢番水稻籽粒中不能合成维生素Ａ，因此维生素Ａ缺乏茄红素合酶和细菌欧文氏菌来源的八氢番茄红素脱问题主要发生在以水稻为主食的贫困人群中。研究氢酶基因转化到水稻中，且在水稻胚乳中特异性地发现在水稻未成熟的胚乳中，含有合成维生素Ａ早表达，使得水稻籽粒中可积累促进人体健康的β－

7、胡收稿日期：２０１３－０４－２４基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（２０１１ＺＸ０８０１０－００２）杜丽缺，硕士研究生．研究方向：水稻基因工程．Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｕｌｉｑｕｅ＠ｗｅｂｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ通信作者：陈浩，博士，副教授．研究方向：水稻基因工程．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｃｈｅｎ＠ｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ２华中农业大学学报第３３卷萝卜素。公司合成。２个基因均在胚乳特异性谷蛋白启动子［１１］的驱动下表达，并在ｎｏｓ终止子作用下终止基因１材料与方法的转录。基因合成时，在ｃｒｔＩ基因两端加ＥｃｏＲⅠ１．１材料和ＫｐｎⅠ酶切位点，在ｐｓ

8、ｙ基因两端加ＨｉｎｄⅢ和大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）菌株ＴＯＰ１０和根ＳａｌⅠ酶切位点。转化受