5fu对sw480细胞musashi1基因表达的影响

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1、5FU对SW480细胞Musashi1基因表达的影响【关键词】结直肠癌细胞株Susashi1基因；肿瘤干细胞；5氟尿嘧啶　结直肠癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率有逐渐上升趋势。关于其发病机制存在众多假说，其中一种是“肿瘤干细胞假说”。该假说认为肿瘤中存在一小群具有干细胞功能的肿瘤细胞，被称为肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSCs），这些CSCs的存在可能是肿瘤发生的根本原因，同时也可能是肿瘤耐药的重要原因以及复发或转移的起源。已有研究证实正常肠道中存在隐窝干细胞，同时还证实Musashi1是其特异性的标记物。本实验将结直

2、肠癌常用的化疗药物5氟尿嘧啶（5FU）作用于结直肠癌细胞株Susashi1表达改变。　　1材料和方法　　1.1材料人结直肠癌细胞株SI1640细胞培养基（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT）、Hoechst33342(Sigma公司)，Trizol裂解液、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒（TaKaRa公司）。光学显微镜，CO2恒温箱细胞培养，生物超净工作台，酶标仪，流式细胞分析（FCM）仪，PCR仪。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养与实验分组SI1640培养液中，置于37℃、5%的CO2

3、培养箱中，每2～3d传代1次，实验时取对数生长期细胞。浓度为7.5、15、30mg·L－1的5FU处理48h后的STT法计算抑制率将STT孵育4h，自动酶标仪上测定OD570值。抑制率=（1－实验组平均OD570值/对照组平均OD570值）×100%。　　1.2.3FCM仪检测侧群（sidepopulation,SP）细胞比例[1]A、B、C及D组细胞均分置于两管中，分别记为1、2管，800r·min－1离心5min；两管中均加入Hoechst33342及2%胎牛血清的RPMI1640培养液，使Hoechst33342的终浓度为5μg·ml－1；仅

4、在2管内加入维拉帕米并使维拉帕米的终浓度为50μmol·L－1，37℃水浴90min。置于4℃以备FCM仪检测SP细胞比例。SP细胞比例＝1管中Hoechstlo比例－2管中Hoechstlo比例（这是由于SP细胞具有外排Hoechst33342的能力，而维拉帕米可以拮抗SP细胞该功能）。　　1.2.4FCM仪检测细胞表面分子CD34及CD44的表达将A、B、C及D组细胞以800r·min－1离心5min，分别加入20μlCD34、CD44单克隆抗体（B﹠D公司）（4℃，30min），冰PBS洗涤1次，在FCM上检测CD34＋CD44＋细胞比例。　　

5、1.2.5RTPCR半定量检测Musashi1Trizol法提取A、B、C、E、F、G及D组细胞的RNA，琼脂糖凝胶电泳初步评价RNA质量、分光光度仪测定总RNA纯度。按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RTPCR操作，根据RNA纯度将每组的RNA调至每个反应体系中含1μg。Musashi1引物上游序列为5′GGCTTCGTCACTTACATGGACCAGGCG3′,下游引物序列为5′GGAAACTGGTAGGTGTAG3′，扩增产物为542bp；内参为GAPDH，产物为216bp。对RTPCR产物进行琼脂糖电泳，数字成像系统

6、进行拍照分析。　　1.3统计学处理计量资料以x-±s表示，应用SPSS11.5统计软件，组间比较采用单因素方差分析(Oneg·L－1)5FU作用于Sg·L－1。　　表15FU作用后SW480细胞的生长抑制率（略）　　Tab1InhibitoryrateofSW480afterdealinge　　2.25FU处理后SP细胞比例的变化5FU处理引起的SP细胞比例变化见图1（图中已圈出SP细胞所在区域）。　　图15FU处理SW480细胞后SP细胞比例的变化（略）　　Fig1TheproportionofSPcellsg·L－1)for48h　　

7、D组(对照组)经Hoechst33342染色后，Hoechstlo细胞比例为1.33%（图1A），经维拉帕米拮抗后再行Hoechst33342染色，Hoechstlo细胞比例为0.69%（图1B），两者的差值即为SP细胞比例（0.64%）；B组直接行Hoechst33342染色，Hoechstlo细胞比例为3.6%（图1C），加维拉帕米拮抗后Hoechstlo比例为0.02%（图1D），SP细胞比例为3.58%。显示5FU作用后SP细胞比例明显增加。　　Tab2TheproportionofCD34＋CD44＋cellsRNA表达的变化　　图2为各

8、组细胞RTPCR的电泳图。　　图25FU作用对Musashi1mRNA表达的影响（略）　　Fig2Th