杜仲叶提取物中绿原酸的纯化及其体外抑菌效果的研究

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1、杜仲叶提取物中绿原酸的纯化及其体外抑菌效果的研究摘要本研究旨在确定杜仲叶提取物中绿原酸的纯化工艺，并通过指纹图谱的建立来对产品的质量进行控制，再考察其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌的体外抑菌效果，为临床应用提供试验依据。试验所采用的纯化方法是大孔吸附树脂法，首先通过絮凝沉淀法来对样品进行预处理，然后再用高效液相色谱法建立绿原酸的指纹图谱；抑菌试验主要采用滤纸片法和连续梯度稀释法来观察和确定其抑菌效果和最小抑菌浓度；试验过程中绿原酸的含量测定则采用紫外分光光度和高效液相

2、色谱两种方法。试验结果表明：絮凝沉淀的最佳工艺条件为，10mLpH=5的样品液中添加1%醋酸壳聚糖溶液1mL，在60℃的水浴中搅拌4min，放置在4℃的环境中静置4h，过滤后得到澄明度高的样品溶液；试验选取NKA-Ⅱ树脂，最终得到工艺条件为，样品溶液的pH=4，稀释倍数为6，上样速度为2BV/h。洗脱剂为70%的乙醇，洗脱速度为2BV/h，用量为2倍柱体积；抑菌试验结果为，6种细菌的抑菌环直径分别为13.44、18.12、13.56、14.00、13.66、13.00mm，其中药液对金黄色葡萄球菌高度敏感，对其它5

3、种细菌中度敏感；前4种细菌的最低抑菌浓度为0.25g/mL，溶液中绿原酸含量为3.58mg/ml，其它两种的最低抑菌浓度为0.5g/mL，溶液中绿原酸含量为7.20mg/mL；试验最终成功建立了杜仲叶绿原酸分离物的指纹图谱，通过相似度分析，得出其对照指纹图谱与每批样的相似度均大于0.9，表明生成的对照指纹图谱可以代表10批样品的共同特征，可以作为应用本试验方法及条件分离纯化出的杜仲叶中绿原酸成分的指纹图谱。综上所述，絮凝沉淀法和大孔吸附树脂法的连用可以有效的从杜仲叶绿原酸提取物中分离纯化出绿原酸，且分离出的物质对大

4、肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌均具有抑菌作用。关键词：杜仲叶；绿原酸；絮凝沉淀；大孔吸附树脂；指纹图谱；抑菌效果第一章文献综述两千多年以前在我国的医药著作《神农本草经》中就已经有了关于杜仲的记载[1]。在中医的传统中杜仲以干燥的皮入药，然而剥皮极易导致树木的死亡，再加上树木成长速度有限，这两点就成为了杜仲药材资源缺乏的主要原因。因而，人们从大量废弃的杜仲叶入手，开始了以叶代替皮入药的研究。经研究发现杜仲叶与杜仲皮除个别化学成分外，其他有效成分基本一致[2]，其中杜仲叶中绿

5、原酸的含量可达1-5.5%[3]，明显高于杜仲皮中绿原酸的含量。绿原酸是一类缩酚酸，主要是由咖啡酸和奎尼酸通过化学反应而得到。从国内外学者关于绿原酸的研究报道中知道，绿原酸具有提高机体免疫功能的作用[4]，还可以清除机体内的自由基，抑制氧自由基对机体的损失[5-6]。另有一些研究发现，绿原酸还具有降血糖、抗癌、抗病毒、抗菌等作用[7-10]。可见绿原酸具有很多的药理活性，再加上高纯度绿原酸更是难得，也就难怪其被称为“植物黄金”[11]。因此如何开发和利用低成本，高纯度的绿原酸就具有重要意义。1.1杜仲概述1.1.1

6、引言杜仲是杜仲科杜仲属的落叶乔木。16世纪在李时珍的著作《本草纲目》中写到“昔有杜仲（人名）服此得道，思仲、思仙皆有此义”。通过李时珍的介绍让我们后人了解到杜仲名字的由来。关于杜仲药效的阐述，在我国第一部药物专著《神农本草经》中早有了记载。后来的《本草纲目》及《本草备要》等著作中对杜仲的药理及药效进行了较详细阐述，如“味甘而辛，能入肝而补肾，能使筋骨相著”等。到了20世纪中期，很多国家包括我国、美国、日本等，通过关于杜仲的药理与临床应用的研究，最终证明了杜仲为天然高效的降压药物[12]。20世纪80年代，开始了关于

7、杜仲叶医疗保健作用的系统研究，通过研究发现杜仲叶与杜仲皮的化学成分及作用相似，其中杜仲叶活性成分绿原酸的含量还高于杜仲皮[13-14]。而且研究还发现杜仲叶在抗衰老、抗疲劳、降压等方面具有更佳的效果。1.1.2杜仲叶的化学成分杜仲叶含有木质素类化合物27种，环烯醚萜类化合物18种，黄酮类化合物6种，酚类化合物16种，氨基酸15种，挥发性成分35种，除此之外还含有大量的维生素、微量元素、杜仲胶、生物碱、多糖等[15]。在16种酚类化合物中有一种是抗癌、抗病毒、抗菌、提高机体免疫力的主要成分，该成分就是绿原酸。绿原酸在

8、植物中分布广泛，目前我国多数是从金银花中分离得到绿原酸。随着对绿原酸的开发和利用的加大，人们在多种植物中均分离得到了绿原酸，如杜仲叶[16]、野菊花[17]、烟草[18]、咖啡豆[19-20]等。其中杜仲叶中绿原酸含量在0.8-2.9%[21]，还有文献报道其含量有的高达1-5.5%[22]。杜仲叶中绿原酸的含量虽不如金银花高，但是其资源的广泛及价格的低廉，