db22t 2078-2014 鹿源结核杆菌基因分型 mlva 法

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1、ICS11.220B41备案号：42280-2014DB22吉林省地方标准DB22/T2078—2014鹿源结核杆菌基因分型MLVA法MLVAMethodforGenotypingofMycobacteriumTuberculosisfromDeer2014-05-04发布2014-06-01实施吉林省技术质量监督局发布DB22/T2078—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出

2、入境检验检疫局、吉林农业大学、吉林省中韩动物科学研究院。本标准主要起草人：王春雨、杨莉、李忠平、石建平、王全凯、孙磊、宋立品、孔德鑫。IDB22/T2078—2014鹿源结核杆菌基因分型MLVA法1范围本标准规定了鹿源结核杆菌MLVA分型方法。本标准适用于鹿源结核杆菌MLVA基因分型。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范

3、3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1MLVA:多位点可变数目串联重复序列分析3.2DNAmarker：脱氧核糖核酸分子标记3.3SDS:十二烷基硫酸钠3.4PCR:聚合酶链式反应3.5Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液3.6EDTA：乙二胺四乙酸4生物安全要求操作过程的生物安全措施应遵守GB19489和SN/T2025的有关规定。5原理多位点数目可变串联重复序列分型(multiplelocusVNTRsanalysis，MLVA)以PCR扩增为基础，利用PCR方法扩增散在于菌株基因组中的不同独立位点可变数目串联重

4、复序列(VNTR)，对扩增产物进行DNA分析确定长度，根据不同位点重复序列单拷贝长度计算出拷贝数，由不同位点拷贝数组成菌株基因型。6材料与试剂6.1实验用水：本实验用水为符合GB/T6682要求双蒸水。6.250bpDNAmarker1DB22/T2078—20146.310%SDS：10g的SDS粉末溶解于70ml双蒸水中，定容到100ml。6.4PCR扩增预混液6.51MTris-HCl(pH8.0):称取Tris碱6.06g，加双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至8.0，定容至50ml。6.60.5MEDTA(pH

5、8.0):称取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加双蒸水35ml，搅拌，用NaOH调pH至8.0，定容至50ml。6.7苯酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25；24；1）6.8三氯甲烷6.9CTAB裂解液：2％CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA(pH8.0)。6.10CTAB沉淀液：0.5％CTAB，0.04mmol/LNaCl。6.11TE缓冲液:称取1MTris-HCl(pH8.0)1ml和0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml，加

6、加双蒸水定容至100ml。6.12PCR引物本规程选择13个MLVA位点作为扩增位点，各位点引物见表1，引物保存于-20℃，临用前取出用双蒸水稀释为10pmol/μl，置-20℃保存。表1MLVA位点扩增引物位点名称引物名称序列(5'to3')碱基数QUB-11baCGTAAGGGGGATGCGGGAAATAGG24QUB-11bQUB-11bbCGAAGTGAATGGTGGCAT18MIRU4aGCGCGAGAGCCCGAACTGC19MIRU4MIRU4bGCGCAGCAGAAACGCCAGC19MIRU40aGGGTT

7、GCTGGATGACAACGTGT22MIRU40MIRU40bGGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA24MIRU31aACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA24MIRU31MIRU31bGTGCCGACGTGGTCTTGAT19Mtub4aCTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT25Mtub4Mtub4bGGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC23ETRAaAAATCGGTCCCATCACCTTCTTAT24ETRAETRAbCGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTT24Mtub3

8、0aCTTGAAGCCCCGGTCTCATCTGT23Mtub30Mtub30bACTTGAACCCCCACGCCCATTAGTA25Mtub21aAGATCCCAGTTGTCGTCGTC20Mtub21Mtub21bCAACATCGCCTGGTTCTGTA20QUB-26aAACGCTC