细胞的衰老与凋亡

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细胞的衰老与凋亡离体培养细胞的衰老现象细胞在体内条件下的衰老细胞的衰老衰老细胞结构的变化细胞衰老的机制细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞的凋亡细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡的分子机制细胞衰老一、离体培养细胞的衰老(senescence)现象Hayflick界限Hayflick通过观察人的正常二倍体成纤维细胞在体外连续培养的状况，发现无论怎样完善培养条件，正常细胞的分裂增殖能力都是有限的，不能无限分裂。另外，细胞的分裂代数与细胞供体本身的年龄呈反比，取正常人胚胎的成纤维细胞传代培养，能分裂繁殖40~60代，如果取自青年人或老年人的成纤维细胞进行培养，细胞的分裂代数明显减少。细胞衰老(cellularaging)：即原来具有分裂能力的细胞随着整体年龄增长而减缓或停止分裂的现象。按照Hayflick的观点，细胞在失去分裂能力之前，细胞分裂传代整个过程所包含的时间是生物的生命极限有细胞水平的表现。实验证明：是细胞核而不是细胞质决定细胞衰老的表达。对于细胞来说，衰老是不可避免，衰老的原因在于细胞本身。在生活有机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生。例如蝌蚪发育时尾和鳃的消失就是通过细胞的死亡而实现的。但体内细胞类型不同，其增殖状况各异。神经元及心肌细胞在发育的早期即已停止分裂，成为固定的有丝分裂后细胞，尔后它们逐渐衰老和死亡。人脑在衰老时神经元的不断丧失即是一个明证。正常情况下，终生保持分裂的细胞如骨髓细胞、上皮细胞的分裂能力是否随着有机体年龄的增高而降低？它们会不会衰老？有人研究过不同年龄BCFl小鼠小肠腺窝上皮细胞的周期长度，发现随着年龄的增高，细胞周期长度明显延长。2月龄小鼠细胞周期总长度为10.1h，而27月龄者竟达15.2h，延长50％。可见衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长。二、细胞在体内条件下的衰老细胞周期的延长，即细胞分裂能力的下降的原因是什么？通过皮肤移植实验表明：引起细胞在体内衰老的主要是体内环境。三、衰老细胞结构的变化(一)细胞核的变化体外培养细胞，细胞核的大小是倍增次数的函数，分裂次数增加，核不断增大。衰老细胞的核膜出现内折凹陷，而且细胞衰老程度越高内折越明显；核的整个体积变大，核中染色质凝集——固缩化，甚至出现异常多倍体；核仁裂解为小体。(二)内质网的变化糙面内质网量减少，内质膜电子密度增高，膜结构变厚。此外内质网排列不规则，或出现肿胀和空泡。糙面内质网总量似乎减少。(三)线粒体的变化细胞中线粒体的数量随年龄增大而减小，而其体积则随年龄增大而增大。线粒体的变化在细胞衰老过程中是很重要的，细胞衰老时，一方面线粒体数目减少，另一方面线粒体的结构也发生变化，其内膜形成的嵴呈萎缩状。在低氧或缺氧的条件下，衰老的线粒体更早出现肿胀→形成空泡→ 破裂崩解。由于线粒体数量的减少和结构的变化，细胞产生ATP的能力下降，线粒体呼吸酶的活性下降。(四)致密体的生成——色素聚集致密体(densebodies)是衰老细胞中常见的一种结构，绝大多数动物细胞在衰老时都会有致密体的积累。致密体是由溶酶体或线粒体转化而来。多数致密体具单层膜且有阳性的磷酸酶反应，这和溶酶体是一致的。少数致密体显然是由线粒体转化而来，因为可以看到双层膜结构，有时嵴的结构也依稀可见。脂褐质通常产生自发荧光，它是自由基诱发的脂质过氧化作用的产物。(五)膜系统的变化细胞膜结构的特征之一就是具有流动性，膜脂与膜蛋白可在膜中以一定方式流动，这是保证细胞膜正常功能的结构基础。衰老细胞膜结构发生变化，使膜的流动性减弱，脆性增加，这将明显影响到膜中蛋白质和脂类分子的生物学活性。细胞膜的通透能力降低，对一些离子和分子进出细胞的控制能力减弱，细胞膜的受体分子减少，细胞质膜受损伤后不易修复，除此之外，受体与配体的亲和力、受体与配体结合后对信号的转导都发生一定程度的变化，以至于不能有效地接受和转导胞外信号。四、细胞衰老的机制(一)染色体端粒复制假说端粒是具有特殊DNA序列并以一种特殊方式复制的染色体末端结构。端粒是由简单的富含T和G的DNA片段的重复序列组成。人类端粒结构染色体末端重复上千次的TTAGGG序列组成。DNA聚合酶不能完成线粒体末端DNA的复制，也就是说在线粒体染色体复制时，DNA聚合酶一定留下染色体末端的一段DNA（一段端粒）使其不被复制。因此真核细胞染色体末端的端粒就会随着细胞分裂而缩短。这个缩短的端粒传给子细胞后，随着细胞的再次分裂进一步缩短。这样，染色体末端端粒随着每次细胞分裂而逐渐缩短，直至影响分裂走向衰老。人类种系细胞一生中维持分裂、不断增殖的原因是该细胞表达端粒酶。在单细胞生物、多细胞生物的种系细胞中都显示弱的端粒酶活性，而在人类正常组织的体细胞均无端粒酶活性。离体培养细胞的衰老(senescence)现象。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成。端粒酶RNA是合成端粒DNA的模板，而端粒酶的反转录酶亚基则催化端粒DNA的合成。(二)线粒体自由基假说线粒体是细胞内的动力工厂，自由基是高活性分子（通常由氧产生）。在其外围常有不配对的电子。这种状态的分子遇到任何化合物倾向破坏性的氧化。线粒体通过产生ATP提供给细胞生活活动所需能量，但与此同时，线粒体从营养物中获取能量的同时作为副产物形成自由基，如超氧自由基O2·-(点代表不配对的电子，超氧化自由基本身有破坏作用，还能转变成H2O2。虽然H2O2不是自由基但可形成氢氧自由基(OH·–)。自由基一旦形成就能损伤细胞内的蛋白质、脂类和DNA，其中线粒体中合成ATP的呼吸链的各种成分、线粒体DNA、线粒体内膜以及线粒体的核蛋白体更易受到自由基的损伤。这是因为线粒体DNA处于自由基产生的邻近部位，易被氧化攻击，此外线粒体DNA不像核中的DNA那样与蛋白质结合受到一定的保护，因而线粒体DNA比核DNA更易受氧化损伤。线粒体自由基假说认为，自由基引起的线粒体损伤最终干扰了ATP产生的效率并增加了自由基的输出，自由基加速了线粒体氧化损伤，因而进一步抑制了ATP的产生。同时由于线粒体增加了自由基的输出，故加剧了对线粒体以外的组成成分的攻击，从而进一步损伤了细胞的功能，随之，由细胞组成的组织和器官的功能逐渐衰退，机体不能应付稳定性的挑战。细胞凋亡一、细胞凋亡的概念及生物学意义细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以也常常被称为细胞编程性死亡(programmedcelldeath，PCD)。PCD最初是发育生物学中提出的概念，其含义是发育过程中(例如幼虫发育为成虫)发生的某类细胞(例如肌肉细胞)的大量死亡，而这种细胞死亡要求一定的基因表达。细胞凋亡的生物学意义 细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。通过细胞凋亡，有机体得以清除不再需要的细胞，而不引起炎症反应。另一方面，细胞凋亡的失调包括不恰当的激活或抑制会导致疾病，例如Alzheimer氏病、各种肿瘤、艾滋病以及自身免疫病等。二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征(一)细胞凋亡与坏死在多细胞生物中，细胞死亡有两种不同的形式：细胞坏死(necrosis)它是由某些外界因素比如局部贫血、高热以及物理、化学损伤和生物侵袭等造成细胞急速死亡，是一种意外性、被动性死亡。细胞凋亡（apoptosis)或称程序性死亡(programmedcelldeaty,PCD)是由基因控制的自杀程序引起的主动性死亡，主要发生在胚胎发育过程中。细胞凋亡是在胚胎发育过程中程序性的死亡，或者是由于凋亡受体活化、缺少血清、受到辐射或化学药物诱导的细胞主动发生的自杀行为，这个过程是需要消耗能量的。二者在形态学和生物化学上有明显的不同：坏死细胞出现细胞膨胀，细胞质膜裂解，细胞器膨大，溶酶体破裂，水解酶释放到细胞溶质中使细胞内容物分解导致细胞崩解，DNA随机裂解成不规则的碎片，引起炎症，巨噬细胞和白细胞聚集在坏死细胞处并吞噬坏死细胞的碎片。凋亡细胞最主要的特征是细胞不膨胀，保存细胞内部结构，使正常分散的染色质凝集在细胞核被膜内侧呈环状或块状；细胞质膜完整；细胞器基本维持原状。细胞质膜和核被膜出泡，有时出泡的部分缢缩成凋亡小体并与细胞分开，凋亡小体中含有部分凝集的染色质。凋亡细胞被巨噬细胞或其周围细胞吞噬、消化而不出现炎症。(二)细胞凋亡的形态学特征在形态学上可分为三个阶段：①凋亡的起始。②凋亡小体的形成。③凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化。①凋亡的起始细胞表面的特化结构如微绒毛的消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整，未失去选择透性；细胞质中，线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。②凋亡小体的形成。首先，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围。从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状突起。以后，逐渐分隔，形成单个的凋亡小体；③凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化。从细胞凋亡开始，到凋亡小体的出现才数分钟，而整个细胞凋亡过程可能延续4~9h。(三)细胞凋亡的生化特征在caspase家族半胱氨酸蛋白酶在凋亡中的关键作用(见后)发现以前，人们所认识到的细胞凋亡的最主要特征是DNA发生核小体间的断裂，结果产生含有不同数量核小体单位的片段，在进行琼脂糖凝胶电泳时，形成了特征性的梯状条带(DNAladders)，其大小为180~200bp的整数倍。梯状条带是鉴定细胞凋亡最可靠的方法。催化DNA降解的是依赖于Ca2+/Mg2+的核酸内切酶。而Zn2+则抑制其活性。凋亡细胞的另一个重要特征是tTG(组织转谷氨酰胺酶（tissuetransglutaminase）的积累并达到较高的水平。tTG催化某些蛋白质的翻译后修饰，主要是通过建立谷氨酰胺和赖氨酸之间的交联以及多胺掺入蛋白质而实现的，其结果导致蛋白质聚合。这类蛋白聚合物不溶于水，不为溶酶体的酶所降解，它们进入凋亡小体,有助于保持凋亡小体暂时的完整性，防止有害物质的逸出。tTG是依赖Ca2+的酶，Ca2+浓度升高，从而使tTG活化。(四)诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子大致可分为两大类：(1)物理性因子：包括射线(如紫外线、γ射线等)，较温和的温度刺激(如热激、冷激)等。(2)化学及生物因子：包括活性氧基团和分子(如超氧自由基、羟自由基、H2O2)、钙离子载体、VK3、视黄酸、细胞毒素(如fumonisins和AAL毒素)。DNA和蛋白质合成的抑制剂(如环己亚胺)、正常生理因子(如激素、细胞生长因子等)的失调，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，抗Fas/Ape-1/CD95抗体等。(五)细胞凋亡的检测1．形态学观测染色法观察形态学特征2．DNA电泳细胞凋亡过程中，DNA发生特征性的核小体断裂，产生180~200bp整倍的大小不同片段，凋亡细胞中提取的DNA在进行常规的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭进行染色时，这些大小不同的DNA片段就呈现出梯状条带。绝大多数凋亡细胞中DNA 的断裂都表现出这种特征。3．TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法末端脱氧核苷酸转换酶介导的dUTP缺口末端标记测定法。这一方法对DNA分子中3′-OH断裂缺口进行原位标记。凋亡细胞的核DNA中产生的3′-OH末端可借助一种可观测的标记物，进行观察。4．彗星电泳法将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳。凋亡细胞形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案。5．流式细胞分析根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙锭使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。三、植物细胞的凋亡1994年发表的关于拟南芥的过敏反应中出现细胞程序性死亡的报道。以后逐渐有报道证明，细胞凋亡在植物中也广泛存在，与动物—样，细胞凋亡存在于正常的植物发育(如导管的分化、通气组织的形成，、糊粉层的退化、绒毡层细胞的死亡、胚胎发育过程中胚柄的退化、单性植物中花器官的程序性退化等)、对环境胁迫的反应(如缺氧、高盐等)和病原体入侵引发的过敏反应中。五、细胞凋亡与衰老细胞凋亡与衰老的关系是一个相当复杂的问题，两者既有联系又不相同。一种观点：衰老是由于细胞凋亡的失调引起的。凋亡消除了细胞中误差的积累，从而保证了表型的保真度的维持。凋亡的失调，导致了衰老。事实上，细胞实现凋亡的能力随年龄增长下降，衰老伴随的肿瘤发病率的上升可能是细胞不能实现凋亡引起的，而限制热量(其结果表现为衰老的推迟和寿命的延长)的大鼠，其肝细胞凋亡率比对照组明显上升，而肝癌发生率明显下降。然而，对于某些组织器官来说，细胞凋亡又往往伴随着衰老，例如男人的心室肌细胞在正常衰老过程中丧失1/3，大部分是由于坏死，也有相当一部分是由于凋亡；大脑皮层的神经元在衰老时丧失10％，老年性痴呆病也伴随着神经元的大量丧失。另一方面，体外培养的成纤维细胞衰老时却不凋亡，因为BCL2未受到抑制，在体内就会造成衰老细胞的积累，它们可能产生某些有害的产物。总之，细胞凋亡与衰老的关系是一个复杂的问题，有待于进一步深入的研究。三、细胞凋亡的分子机制秀丽隐杆线虫是研究细胞凋亡的理想模型，因为每条线虫都无一例外地包括1090个体细胞，其中131个在发育过程中发生程序性死亡；此外，线虫整个身体呈透明状，易于观察。通过研究现已从线虫是分离出十几种细胞凋亡相关基因。其中研究得比较深入的基因是ced-9、ced-3、ced-4。ced-9抑制细胞凋亡，与人的bcl-2基因有同源性。这说明凋亡相关基因在进化上是很保守的，提示可以从线虫凋亡机理中认识人类细胞凋亡的机制。ced-3和ced-4则则促进细胞凋亡，ced-4与哺乳动物中AP-1基因同源，ced-3与哺乳动物的caspase基因具有同源性。推测在线虫细胞中ced-3、ced-4和ced-9的平衡从两个相反的方向调节细胞的生存状态。(一)caspase家族与凋亡1．caspase（胱天蛋白酶）家族是一类天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，caspase一词是从cysteineasparticacicspecificprotease的词头和词尾缩写衍生而来，反映了这个特征，而这种高度的特异性在蛋白酶中是很少见的。它们的一个重要特征是特异性断开天冬氨酸残基后的肽键，即其活性中心是半胱氨酸残基，水解蛋白底物的位点是Asp-X，即将底物中天冬氨酸残基之后的键断裂。根据caspase在级联反应中的位置，可将哺乳动物的caspase家族分为两类，上游起始caspase（类型1）如caspase2，8，9，10等和下游的效应caspase（类型2）如caspase3,6,7,14等。2．caspase的活化细胞中合成的caspase以无活性的酶原状态存在，以后经活化方能执行其功能。一般的蛋白酶活化时，只是将N端的肽段切除，而caspase的活化则需在两个亚基的连接区的天冬氨酸位点进行切割，结果产生了由两个亚基组成的异二聚体，此即具有活性的酶。凋亡起始者(caspase2，8和10)的活化属于同性活化(homoactivati-on)。caspase8和10 含有串联重复的“死亡效应子”结构域(deatheffectordomain，DED)，而caspase2和9则含有不同但类似的caspase募集结构域(caspaserecruitmentdomainCARD)，这两种结构域是募集caspase2，8和10所必需的。caspase8和10的活化要求下列成员的参与：(1) 配体/受体对，如FasL/Fas，TNF/TNF受体。(2)连接器或接头蛋白FADD(fas-associateddeathdomainprotein)。(3)修饰子蛋白：当凋亡信号由TNF/TNF受体途径传导时，则要求修饰子蛋白TRADD(TNFreceptorassociateddeathdomainprotein)的参与。(4)caspase2，8和10的酶原。当Fas(CD95)或TNF受体为其天然配体FasL或TNF所启动时，就形成了由Fas或TNF受体、连接器蛋白FADD和caspase2，8和10的酶原组成的死亡诱导信号复合物(death-inducingsignalingcomplex，DISC)。受体蛋白通过直接与连接器蛋白FADD作用(有时需要修饰子蛋白的中介)而使caspase2，8及10的酶原聚集在其附近，即细胞质表面。当酶原达到一定浓度时，它们就进行同性活化(homo-actiration)，在大小亚基之间进行切割，产生具有活性的酶。Caspase2，8和10活化以后，就通过异性活化(hetero-activation)，使下游的caspase包括caspase3和7活化，使其成为凋亡的执行者。(二)天然的caspase抑制剂细胞凋亡是生物体用来清除病毒、防止其进一步侵染的一种机制，而病毒也发展出一种对抗机制，来逃避或阻止凋亡的发生，即抑制caspase的活性。痘病毒蛋白-CrmA和杆病毒蛋白p35就是这样的天然的caspase抑制剂。CrmA能有效地抑制caspasel和8，但对caspase3，7和9的抑制作用很弱。p35则对大多数caspase有较强的抑制作用。病毒的其他抑制凋亡机制：v-FLIPs是一组受体介导的细胞凋亡机制，与其他结构域结合，阻止caspase8和10与连接蛋白的结合。哺乳类细胞中没有发现CrmA和p35的同源物。目前已知的哺乳类细胞内源的caspase抑制剂是编程性细胞死亡抑制因子(inhibitoro{apoptosis，IAP)家族，包括人细胞中的XIAP，cIAPl和cIAP2。(四)p53与细胞凋亡p53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。p53基因对细胞生长起负调节作用，它具有促使细胞凋亡的功能。在依赖于p53蛋白的细胞凋亡中，p53基因是通过调节Bcl2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。p53蛋白能特异地抑制Bcl2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，p53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，p53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。(五)细胞凋亡的信号传导1．Ras-PI3-K-Akt(PKB)抗细胞凋亡途径PI3-K是一种重要的细胞信号蛋白，是Ras的效应子之一，可为Ras所活化。PI3-K含有一个p85的调节亚基和一个p110的催化亚基，它催化磷脂酰肌醇PI(4，5)磷酸化生成PI(3，4，5)。这一反应的产物能活化Akt。活化的Akt能使caspase9酶原磷酸化，使其不能参与caspase3的活化。活化的Akt还能使Bad磷酸化，从而使其失去阻断Bcl2的功能。2.NF-kB与细胞凋亡NF-kB是一种调节基因转录的核因子。NF-kB的活化，引起细胞凋亡的抑制。NF-kB的活化能阻止处于caspase级联反应顶端的caspase8的活化，从而抑制细胞的凋亡。NF-kB的靶基因为TRAFl(TNFR结合因子1)，TRAF2，IAP(凋亡抑制剂)蛋白c-IAPl和c-IAP2。这些蛋白的协同作用，抑制了caspase8的活化，从而阻止了下游的caspases活化以及细胞的凋亡。3．ASKl-SAPK/JNK及ASKl-p38信号途径ASKl(apoptosissignalregulatingkinase)，在胁迫和细胞因子诱导的细胞凋亡中起着关键的作用。ASKl是一种哺乳类的MAPKKK，即MAP(有丝分裂原活化蛋白mitogen-activatedprotein)激酶激酶的激酶。MAP信号级联系统是一种保守的信号传导途径，由蛋白激酶家族的三类不同成员组成，即MAP激酶(MAPK)、MAPK激酶(MAPKK)、以及MAPKK激酶(MAPKKK)。MAPKKK磷酸化并活化MAPKK，后者又使MAPK磷酸化并活化。活化的MAPK 转入细胞核中，调节转录因子的活性，从而控制基因的表达。在哺乳类细胞中，通常有两套MAPK信号组件在起作用，即Raf-MAPKK-MAPK和MEKK-MKK4-JNK途径。ASKl能选择性地活化MKK4—JNK和MKK3—p38两种信号通路。在转染ASKl的COS7细胞中，ASKl的表达使MKK4和MKK3的活性分别升高7.0倍和11.8倍，JNK和p38的活性分别升高7.6倍和5.0倍；然而对MAPKK则无活化作用。