DB41∕T 2371-2022 猪冷冻精液生产技术规范(河南省).pdf

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ICS65.020.30CCSB4341河南省地方标准DB41/T2371—2022猪冷冻精液生产技术规范2022-12-22发布2023-03-21实施河南省市场监督管理局发布 DB41/T2371—2022目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14基本要求...........................................................................25稀释液配制.........................................................................26品质检查...........................................................................27精液冷冻...........................................................................28解冻检测与储存.....................................................................39冷冻质量要求.......................................................................310生产记录..........................................................................411运输..............................................................................4附录A（资料性）猪冷冻精液生产仪器设备表.............................................5附录B（资料性）冻精生产相关稀释液配制...............................................6附录C（资料性）精液离心和稀释.......................................................7附录D（资料性）猪冷冻精液生产记录样式...............................................8I DB41/T2371—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由河南省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：河南省农业科学院畜牧兽医研究所、河南省畜牧技术推广总站、河南精旺猪种改良有限公司、牧原食品股份有限公司、漯河市畜牧工作站、北京田园奥瑞生物科技有限公司。本文件主要起草人：邢宝松、张家庆、王献伟、卢清侠、原黎伟、葛位西、胡波、徐泽君、李彦朋、吕玲燕、蒋凡、申明、和小娥、高彬文、蒋立云、任巧玲、陈俊峰、王璟、马强、牛刚。II DB41/T2371—2022猪冷冻精液生产技术规范1范围本文件规定了猪冷冻精液生产与保存的基本要求和技术要求。包括精液采集、稀释液配制、品质检查、精液冷冻、解冻品质检测、冻精包装、储存及运输等内容。本文件适用于猪冷冻精液生产。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4143—2008牛冷冻精液GB/T5458—2012液氮生物容器GB/T23238—2021种猪常温精液GB/T25172—2020猪常温精液生产与保存技术规范GB/T30396—2013牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输NY/T1234—2018牛冷冻精液生产技术规程NY/T2077—2011种公猪站建设技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1种公猪体型外貌和性能质量符合种用标准要求的公猪。3.2冻精细管用于分装精液的耐冻、无毒的聚氯乙烯复合塑料细管。3.3冷冻精液经特殊方法处理经超低温冷冻并可在液氮中（-196℃）长期保存的精液。简称冻精。3.4细管冷冻精液冷冻细管装入精液经液氮冷冻所形成的产品。3.5细菌数每剂量精液经培养后观察到的细菌菌落数。1 DB41/T2371—20223.6活力在37℃下呈直线前进运动的精子占总精子数的百分率。3.7畸形率畸形精子占总精子数的百分比。4基本要求4.1种公猪应符合NY/T2077—2011中8.2.1的要求，其他应符合GB/T25172—2020中4.1的要求。4.2原精液应符合GB/T25172—2020中5.2.2的要求。4.3操作环境应符合NY/T2077—2011中7.3的要求。4.4采集量地方品种≥50mL,其他≥100mL。4.5环境精液采集室、精液检测室的环境条件应符合NY/T2077—2011中7.4～7.5的要求。4.6仪器设备4.6.1仪器设备的配置应满足猪冷冻精液生产的要求(生产仪器设备见附录A)。4.6.2仪器设备运行正常，定期进行维护保养。4.6.3计量仪器（电子天平、恒温箱等）、超纯水仪、恒温热台、高压锅等应定期校准或维护保养。4.6.4用品、器具等应按要求进行清洗和消毒。清洗和消毒应符合NY/T1234—2018附录A中的规定。5稀释液配制5.1配制稀释液用水应为新鲜无菌的蒸馏水、重蒸水或超纯水。稀释液所用化学试剂应为分析纯以上级别，所用卵黄应来源于无特定病原体鸡场的新鲜鸡蛋，配制方法见附录B。稀释液配制需现用现配，化学试剂需精确称量，配制稀释液灭菌容器需要进行标记，配制完成后需在瓶上标记日期、名称、保存时间等。5.2使用商品稀释液应严格按照使用说明书的要求操作。6品质检查精液品质检查应按照GB/T23238—2021附录A中的规定执行。7精液冷冻2 DB41/T2371—20227.1预稀释及平衡经过质量评估合格的精液，用等温预热且与精液温度一致的预稀释液（配制见附录B）按照1:1～1:1.2比例稀释，稀释后的精液于室温（25℃）静置1h，转入17℃恒温冰箱，平衡2h～3h。7.2离心称量离心瓶重w（0g），将离心瓶预冷至17℃，然后将17℃平衡好的精液装入离心瓶进行离心（17℃条件下，800g离心10min），弃上清液，称重w1（g）。7.34℃平衡用17℃预冷的冷藏保护液（Ⅰ液）（配制见附录B）重悬精子,重悬后置于盛有17℃水的500mL烧杯中，于4℃冰箱或低温操作柜中缓慢降温至4℃～5℃（2.5h～3h）。按1:1加入冷冻保护液（Ⅱ液）（配制见附录B）混匀，在4℃下继续平衡0.5h～1h,然后在低温操作柜中进行灌装。7.4冷冻7.4.1程序冷冻在灌装的同时开启程序冷冻仪，选定冷冻曲线，待冷冻仪温度稳定在初始温度（4℃～5℃）后，迅速将摆放好细管的托架放入冷冻室中，启动冷冻程序。待冷冻曲线走完后，将托架迅速取出放入装有液氮的泡沫箱中，液氮深度至少浸没所有细管。7.4.2熏蒸冷冻将液氮倒入深度50cm以上的专用冷冻箱预冷10min,保持冷冻支架上的细管在液氮面之上2cm,熏蒸冷冻8min,最后将冷冻样品浸入液氮中。7.4.3分装将细管支架升到液氮面上1cm～2cm，然后将细管冻精装入拇指管（每管12支），再将拇指管装入纱布袋（每袋6管），在纱布袋或拇指管上标记或贴上打印好的标签。8解冻检测与储存8.1冻后抽检每份原精液制作的细管冻精至少抽取3支进行检测。细管从液氮罐中取出后在空气中停留2s～3s，迅速置于50℃水浴中解冻16s，擦干表面水分后，将精液移入5mL离心管中，用预热到37℃的解冻稀释液（配制见附录B）作10倍稀释。在37℃水浴中维持10min～15min，然后在显微镜下检测解冻后精子活力，如活力合格，即可将冻精转入液氮罐中长期保存。8.2包装外包装上标明生产场、品种、种公猪号、生产日期和支数等。8.3储存储存方法应符合GB/T30396—2013中的要求，容器质量应符合GB/T5458—2012中的规定。9冷冻质量要求3 DB41/T2371—20229.1精子活力≥40%。9.2精子畸形率≤20%。9.3细菌数≤1600个/mL，按GB/T4143—2008附录B中规定的方法进行细菌数测定。10生产记录做好猪冻精生产相应记录，参见附录D。11运输应符合GB/T30396—2013中8.1～8.3的要求。4 DB41/T2371—2022AA附录A（资料性）猪冷冻精液生产仪器设备表猪冷冻精液生产仪器设备见表A.1。表A.1猪冷冻精液生产仪器设备表名称规格及用途采精架（假台猪）采精用，可升降、调角度防滑垫环保橡胶，不含滑石粉添加剂，（采精室地面防滑）恒温水浴锅数显式控温，控温精度±1℃电热恒温培养箱数显温度、可控温度34℃±1℃磁力搅拌器可恒温、调速电子精密台称精液、稀释粉称重电子天平0～300g±0.01g，化学试剂称量pH计0.0～14.0±0.1，测定精液、稀释液的pH值血球计数板测定精液中精子数量超纯水仪稀释液用水离心机单孔200mL～750mL液氮容器（不同型号）贮存液氮，精液冷冻和保存微量移液器50uL～100uL微量移液器100uL～1000uL温度计温度测量，0℃～60℃磁力搅拌器可恒温、调速采精保温杯600mL量筒500mL、1000mL，量取液体三角烧杯50mL、100mL、250mL、500mL精子密度测定仪精液中精子密度的测定,亿/mL精子质量分析系统40X～600X；有相差镜头，观测精子数、活力和畸形率显微镜恒温台（板）数显温度，加热恒温提高精子活体观察的准确性细管精液分装机封装细管精液低温平衡柜稀释后的精液平衡，细管精液封装精液冷冻程控仪细管精液冷冻，控温范围30℃～180℃5 DB41/T2371—2022BB附录B（资料性）冻精生产相关稀释液配制B.1预稀释液主要成分：Tris、柠檬酸、葡萄糖、半胱氨酸。取2L量杯和2L加厚采精袋各1个，将采精袋套在烧杯内部，取一袋猪冻精试剂A（预稀释剂），全部加入采精袋内，然后将烧杯放到天平上，归零，加入1000g水，用橡皮筋扎紧袋口，混匀，置水浴锅预热至35.5℃左右备用。B.2基础营养液主要成分：葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠、HEPES钠、Tris、EDTA‑2Na、碳酸氢钠、半胱氨酸。取2L量杯和1L加厚采精袋各3个，每个量杯套一个采精袋。往其中一个采精袋中加入1000g水，再加入整瓶猪冻精试剂B（基础营养剂），混匀，为基础液。B.3Ⅰ液（冷藏保护液）将250mL蛋黄加入到1L基础营养液中，为冷藏液，使用前置于恒温箱内17℃保存。B.4Ⅱ液（冷冻保护液）主要成分:葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠、HEPES钠、Tris、EDTA‑2Na、碳酸氢钠、半胱氨酸、甘油、SDS。取I液276mL置于500mL的烧杯中，用注射器抽取18mL猪冷冻试剂C和移液器吸取6mL猪冷冻试剂D(冷冻保护剂)加至其中，混匀，为冷冻液，置4℃备用。B.5解冻液主要成分：葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠、HEPES钠、Tris、EDTA‑2Na、碳酸氢钠、半胱氨酸、茶碱。称取适量（2mL/0.5mL冷冻细管）猪冻精试剂E（解冻剂）置于玻璃试管中，然后加入蒸馏水以1:20比例混匀，置30℃备用。6 DB41/T2371—2022CC附录C（资料性）精液离心和稀释C.1精液离心C.1.1离心前应准确称量离心管净重（g）,做好标记。C.1.2降、恒温后精液在17℃环境条件下800g离心10min,弃上清，称重。精子体积按式（C.1）计算：(v0=(????1−????0)1.04)·····························································(C.1)式中：v0——浓缩后精子体积，单位为mL；????1——离心瓶加精子重，单位为g；????0——离心瓶重，单位为g；1.04——浓缩后精液比重估计值。C.2稀释C.2.1浓缩后精液稀释总倍数：N=P0每剂有效体积/每剂总精子数量-1（有效体积按0.45mL计）C.2.2第一稀释倍数N1=（N+1）/2-1（稀释后体积为冻前体积的一半）C.2.3Ⅰ液用量（mL）V1=N1V0C.2.4Ⅱ液用量（mL）V2=（N1+1）V0C.2.5最终可分装细管数=（N+1）V0/0.57 DB41/T2371—2022DD附录D（资料性）猪冷冻精液生产记录样式猪冷冻精液生产相应记录样式见表D.1。表D.1猪冷冻精液生产记录样式日期公猪号采精量采集员颜色活力密度检查员预计生冷冻后冷冻数操作员备注mL亿/mL产支数活力量8