猪精液冷冻保存技术.ppt

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1、猪精液冷冻保存技术吉林省农业科学院李兆华内容猪精液冷冻保存的意义猪精液冷冻技术研究概况猪精液冷冻技术操作流程影响猪精液冷冻效果的因素如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力1、延长公猪使用年限；2、获得更大的遗传进展；2、取代活体公猪的引进；3、生物安全的保证。猪精液冷冻保存的意义从意大利人Spallanzani最早开始研究哺乳动物精液冷冻开始至己有200多年的历史。猪的精液冷冻研究是从1949年英国人Polge等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。1956年，他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作，并进行人工授精。1957年Hess等将猪冻精经子宫颈输入，

2、并产下仔猪。1975年，Pursel等发明了简便的猪精液冷冻和解冻方法，从此打开猪冷冻精液的商品化之路。（用颗粒状冷冻精液给23头青年母猪输精,48h后剖检11头,有5头受孕;25-30d后剖检另外12头,有10头怀孕）猪精液冷冻技术研究概况猪精液冷冻技术研究概况我国从70年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。1975年西安市草滩农场试配了8头母猪。1977年成立了全国猪冻精协作组。1986年冷冻精液累计配种母猪6万余头，近几年：甘肃农业大学张兆旺教授南京农业大学芮荣教授西北农林科技大学李青旺教授四川农业大学马恒东教授东北农业大学刘娣教授上海农科院张德福研究员猪精液冷冻

3、技术操作流程精液采集质量检测第一次稀释降温、平衡（15℃，5℃）第二次稀释平衡冷冻保存猪精液冷冻技术操作流程颗粒法冻精的冷冻程序1)新鲜精液在常温、等温条件下，用不含甘油的I液稀释，然后平衡0.5～2h;2)缓慢降温至15℃维持4h，再从15℃经1h降至5℃;3)用等温的含甘油的II液进行稀释。4)稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为1～2cm，待冷冻面充分预冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为-110～-125℃，滴冻时间控制在60s内完成，加盖熏蒸平衡3～4分钟后，浸入液氮中保存。细管法和塑

4、料袋法的冷冻程序1)新鲜精液在室温下，用稀释液将精液按比例等温稀释，然后平衡0.5～2h。2)将精液移入15℃条件下降温平衡3h。3)在15℃条件下离心(800g，10min),加入无甘油的I液，缓慢降到5℃，平衡2h，加入含甘油的II液，然后分装。4)程序冷冻仪冷冻：初始温度为5℃，以3℃／min从5℃降到-5℃，再于-5℃条件下保持1min结晶，然后以50℃／min从-5℃降到-140℃，然后投入液氮保存。5)液氮熏蒸冷冻：在广口液氮罐内，与液氮面距离5cm处，熏蒸20分钟，然后投入液氮保存。影响猪精液冷冻效果的因素个体的影响个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片

5、断长度多态(AFLP)分析控制精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究冻前处理的影响冷休克：可能原因是质膜中特别的组成成分所致。猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高胆固醇/磷脂的比例低，且胆固醇的分布不对称，外膜的分布量大于内膜离心：800g，10min影响猪精液冷冻效果的因素冷冻保存承载工具的影响承载工具：颗粒、0.25mL、0.5mL小型细管和扁平细管；5mL的大型细管5mL塑料袋。如FP(Flat-Pack，300mm×22mm×0.2mm)和MFP(amultipleFlat-Pack)。冷冻解冻程序的影响冷冻速率：3

6、0～50℃/min。解冻速率：1200～1800℃/min冷冻0.25mL微型细管：50℃/min、1.5％甘油浓度；0.5mL小型细管：30℃/min、3％甘油浓度；5mL大型细管：16℃/min、3.3％甘油浓度。解冻0.25mL、0.5mL细管：50℃，12s或37℃，20s；5mL细管：50℃，40s5mL塑料袋：50℃，13s影响猪精液冷冻效果的因素稀释液的组成大体上，包括糖，蛋白质，脂类，缓冲剂，冷冻保护剂和一些添加物质。渗透压的影响最佳渗透压：420～580mOsm/Kg为最佳渗透压糖的影响双糖（半乳糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等）顶体完整率；单糖（尤其

7、是果糖和木糖）精子冻后活率。配合使用效果比单一使用好影响猪精液冷冻效果的因素冷冻保护剂的影响常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、木糖醇、乙酰胺、阿东糖醇等。作用过程：（1）冲淡溶液中溶质盐浓度，细胞摄入盐量减少，由抗冻剂代替；（2）抗冻剂进入细胞，改变了胞内过冷状态，使胞内压接近胞外压，降低了细胞脱水皱缩程度和速度；（3）抗冻剂进入细胞，缓解了精子在解冻时的渗透性肿胀引起的损伤。效果：甘油保护效果最好，但有毒。方向：联合使用，最终除去甘油影响猪精液冷冻效果的因素添加物的影响缓冲：磷酸二氢钾、柠檬酸钠、T