DB15∕T 2555—2022 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法(内蒙古自治区)

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ICS65.020.30CCSB40□B15内蒙古自治区地方标准DB15/T2555—2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法

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2DB15/T2555—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、崔新洁、赵濛、云伏雨、张春华、羿静、康长清。I

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4DB15/T2555—2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法1范围本文件规定了乳汁分离法培养鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞的术语与定义、材料、仪器和试剂耗材、操作步骤等技术要求与规范。本文件适用于从奶牛乳汁中分离培养和鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.13.23.34.14.2

5DB15/T2555—20225仪器和试剂耗材5.1仪器生物安全柜，CO2培养箱，高压蒸汽灭菌锅（137℃，0.25MPa），普通光学显微镜，超低温冰箱（-50℃～-86℃），PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，低速冷冻离心机（2000g，-8℃～10℃），低温高速台式离心机（20000g，-8℃～10℃），酶标仪，恒温水浴锅，倒置荧光显微镜（40x～640x）。5.2试剂与耗材5.2.1试剂PBS缓冲液，0.25%胰蛋白酶，细胞冻存液，0.4%台盼蓝，MTT(0.5mg/mL)，二甲基亚砜(DMSO)，总RNA提取试剂盒，DNA水解酶，反转录试剂盒，PCR试剂盒，Taq酶，琼脂糖，4%多聚甲醛，山羊血清（10%），兔抗人角蛋白8多克隆抗体，FITC标记的山羊抗兔IgG，DAPI（10μg/mL），秋水仙素（5μg/mL），0.2%TritonX－100，10%Giemsa染色液等。5.2.2配制溶液组分完全培养液：10%FBS+DMEM/F12+100U青链霉素双抗+氢化考的松（1μg/mL）+孕酮（1μg/mL）+转铁蛋白（5μg/mL）+胰岛素（5μg/mL）+谷氨酰胺（200mmol/L）+EGF（10ng/mL）。核型分析固定液：甲醇：冰醋酸为3:1。6.16.2

6DB15/T2555—2022待细胞长至80%汇集时，吸弃培养液，用PBS清洗细胞两次；T25培养瓶加1mL胰酶消化液，37℃消化10min，普通光学倒置显微镜下观察到细胞变圆脱落后，加入至少200μL胎牛血清终止消化，反复吹打细胞，使细胞完全脱落，300g离心5min，弃上清，将收集的细胞按1:3的比例接种于新培养皿中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔48h换液，待长至80%汇集时，继续传代培养或将细胞冻存备用。6.3冻存和复苏6.3.1冻存上述方法消化细胞，用血清终止反应，用血球计数板计数后，300g离心5min，弃上清，根据细胞6数量计算冻存支数，沿管壁缓缓加入冻存液使细胞密度为2×10/mL，用吸管轻轻吹打，令细胞处于重悬状态。分装入无菌冻存管中，每瓶1mL细胞悬液。标记冻存日期、细胞名称、培养代数等信息，放入程序降温盒中，快速置于-80℃超低温冰箱中冻存，24h后转入液氮罐中保存。6.3.2复苏将冻存管从液氮罐中小心取出，迅速浸没在40℃温水的恒温水浴锅中解冻，解冻时间尽量控制在1min左右。用培养液重悬离心以清洗冻存液，保护细胞。用移液枪吸出细胞悬液，缓慢移入加有完全培养液的细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，待长至80%汇集时，可继续传代培养或冻存。6.4细胞生长曲线测定采用MTT法，参考文献1。6.56.6

7DB15/T2555—2022加一抗（兔抗人的细胞角蛋白8多克隆抗体100倍稀释，空白对照试验用PBS代替）于37℃下振荡孵育1h或4℃过夜孵育，用PBS清洗细胞3次，每次5min～10min；加入二抗（50倍稀释的FITC标记的山羊抗兔的IgG）并于室温下避光振荡孵育30min，用PBS清洗细胞3次，每次5min～10min。6.6.4鉴定加入DAPI染色液于室温避光孵育10min，荧光显微镜下观察结果。正常奶牛乳腺上皮细胞会呈强阳性，发出绿色荧光，核为蓝色荧光；空白对照组的细胞检测呈阴性。参照图见附录C。6.7染色体中期分裂相制备与组型分析6.7.1细胞复苏培养与消化复苏步骤同6.3.2，生长到80%汇集时，向培养液中加入秋水仙素使其终浓度为0.1μg/mL，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养3h～4h；消化步骤同6.2。6.7.2分裂相制备缓缓加入5mL低渗KCl（0.075M，37℃预热），并轻吹细胞使其悬浮，37℃孵育30min，加入1mL新鲜配制的核型分析固定液预固定3min，300g离心5min，弃上清，加入新鲜配制的核型分析固定液6mL，并轻吹细胞使其悬浮，室温孵育30min，重复固定细胞2次并离心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5mL固定液，轻吹细胞使其悬浮。6.7.3制片染色

8DB15/T2555—2022AA附录A（规范性）PCR扩增反应引物牛基因序列设计引物见表A.1。表A.1PCR扩增反应引物GeneBank序列号基因引物序列(5’-3’)产物长度F:TGGAAGGGCTGACTGATGAGNM_001033610.1角蛋白8540bpR:GCTTCCTGTAGGTGGCAATCF:CAGGGCGAGAAGGAGACCATNM_001192095.1角蛋白18504bpR:TAAGGTCCTGAGGTTTGGGGF:ATCCCTAACAGCCTCCCACNM_181008.2β-酪蛋白303bpR:AGAAAGGGACAGCACGGAC5

9DB15/T2555—2022BB附录B（规范性）PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系见表B.1。表B.1PCR扩增反应体系无酶水7.2μL上游引物（10μmol/L）0.4μL下游引物（10μmol/L）0.4μLＴＭSYBRPremixExTaqⅡ(2×)10μLcDNA模板2μL总计20μL6

10gXX6282LZ92S2r«^^^\fstst^4nzzzz\z说6181l\如M必UM\)V供如（Al91siHnZ\II016w\hA)叫00VA/^U00VO8Z9S£Zl^OUWWIiMWhtMJl)。C.1是普通光学显微镜拍摄见图D是荧光显微镜拍摄，细胞核呈蓝色，C：对照组，其中D、C拍摄；是普通光学显微镜B是荧光显微镜拍摄，细胞发出绿色荧光，A：正常奶牛乳腺上皮细胞，其中B、A鉴定及染色体组型分析参照图8-CK奶牛乳腺上皮细胞（资料性）C附录CC2022—DB15/T2555

11DB15/T2555—2022参考文献[1]JingjingWang,ChangmingGuo,ZhengkaiWei,etal.Morinsuppressesinflammatorycytokineexpressionbydownregulationofnuclearfactor-κBandmitogen-activatedproteinkinase(MAPK)signalingpathwaysinlipopolysaccharide-stimulatedprimarybovinemammaryepithelialcellsJDairySci.2016,99(4):3016-3022.8