T∕CVMA 96-2022 猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光RT-PCR检测方法

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ICS11.220B41团体标准T/CVMA96—2022猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光RT-PCR检测方法DuplexrealtimeRT-PCRdetectionmethodforclassicalswinefevervirusandAfricanswinevirus2022-08-12发布2022-08-12实施中国兽医协会发布

1T/CVMA96—2022目次前言.......................................................................................................................................................................II1范围...................................................................................................................................................................12规范性引用文件...............................................................................................................................................13术语和定义.......................................................................................................................................................14缩略语...............................................................................................................................................................15仪器和设备.......................................................................................................................................................26试剂和材料.......................................................................................................................................................27病料采集和处理...............................................................................................................................................28病毒总核酸的提取...........................................................................................................................................29荧光RT-PCR反应.............................................................................................................................................210生物安全要求.................................................................................................................................................4附录A（资料性）病原基因参考序列..............................................................................................................5附录B（资料性）引物和探针序列.................................................................................................................6附录C（资料性）病毒核酸提取步骤.............................................................................................................7I

2T/CVMA96—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国海关科学技术研究中心提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、禾旭（郑州）生物技术有限公司、聊城市畜牧兽医事业发展中心、沈阳海关技术中心。本文件主要起草人：史喜菊、赖平安、杜思乐、刘艳华、李秀梅、陈金海、刘近、任彤、赵相鹏、张伟、耿庆华、刘全国、蒲静、高志强、任雪建、吕园园、杨转。II

3T/CVMA96—2022猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光RT-PCR检测方法1范围本文件规定了猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重荧光RT-PCR检测操作规程。本文件适用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒鉴别诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541动物疫病实验室检验采样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1双重荧光RT-PCRDuplexrealtimeRT-PCR双重荧光反转录-聚合酶链式反应。3.2Ct值Cyclethreshold每个反应孔内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CSFV：猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）6-FAM：6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein)Cy5：荧光发光基团BHQ：荧光淬灭基团1

4T/CVMA96—20225仪器和设备多通道荧光PCR仪、生物安全柜、冰箱（2℃～6℃和-20℃）、台式冷冻离心机、组织匀浆机、漩涡震荡器、微量可调移液器（10μL、200μL和1000μL）。6试剂和材料6.1病毒总核酸提取试剂TIANampVirusDNA/RNAKit或其他等效核酸提取试剂。6.2Multiplexone-stepRT-PCRkit或其他等效多重荧光RT-PCR试剂。6.3无水乙醇（分析纯）和75%乙醇（用新开启的分析纯无水乙醇和DEPC处理水配制）及实验用水按照GB/T6682规定使用，-20℃预冷。6.4阳性对照猪瘟病毒5‘UTR基因体外转录的非感染型RNA片段、非洲猪瘟病毒VP72基因重组质粒、片段序列见附录A。6.5阴性对照猪瘟病毒阴性样品、非洲猪瘟病毒阴性样品。6.6引物和探针序列引物和探针序列见附录B。7病料采集和处理病料采集和处理，请遵照NY/T541《动物疫病实验室检验采样方法》有关规定进行操作。8病毒总核酸的提取见附录C。9荧光RT-PCR反应9.1双重荧光RT-PCR反应体系双重荧光RT-PCR反应体系的配制见表1。表1双重荧光RT-PCR反应体系（20uL）体积终浓度混合液组份uLnM2×MultiplexRT-PCR缓冲液101×2

5T/CVMA96—2022表1双重荧光RT-PCR反应体系（20uL）（续）体积终浓度混合液组份uLnMMultiplex酶混合液11×引物混合物1.6400CSFV探针（Cy5标记）0.4200ASFV探针（FAM标记）0.4200病毒总核酸5DEPC水补齐至总体积20注：1.引物混合物指的是2种病原的所有引物。2.此反应体积以Path-IDTMMultiplexone-stepRT-PCRkit为例，如果使用其他等效试剂，请遵照试剂说明书配制。将混合液充分混合后，最后加入模板，简短离心，按照下列反应程序进行荧光RT-PCR反应。9.2荧光RT-PCR反应程序荧光RT-PCR反应程序见表2。表2荧光RT-PCR反应程序48℃10min95℃10min95℃15sec44个循环60℃45sec9.3结果描述及判定9.3.1质控标准所有阳性对照（FAM和Cy5）均有S形扩增曲线，阴性对照（FAM和Cy5）均无扩增曲线且Ct≥40或者无值。满足此条件，视为此次实验有效。9.3.2结果判断和鉴别有扩增曲线，且Ct≤35，判定为核酸检测阳性；有扩增曲线，35

6T/CVMA96—2022没有扩增曲线，或者Ct≥40，判定核酸检测阴性。FAM阳性荧光信号表示ASFV核酸检测阳性，Cy5阳性荧光信号表示CSFV核酸检测阳性，两种阳性荧光信号表示ASFV和CSFV核酸检测双阳性。10生物安全要求样品处理和核酸提取以及废弃物处理按照GB19489《实验室生物安全通用要求》规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物安全柜中进行，并做好个人防护。4

7T/CVMA96—2022AA附录A（资料性）病原基因参考序列A.1ASFV-VP72基因片段参考序列tccgggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaataccaacccagtggtcatattaacgtatccagagcaagagaattttatattagttgggacacggattacgtggggtctatcactacggctgatcttgtggtatcggcatctgctattaactttcttcttcttcagaacggttcagctgtgctgcgttacagtacA.2CSFV-5‘UTR基因片段参考序列gagcagaagcccacctcgagatgctatgtggacgagggcatgcccaagacacaccttaaccctagcgggggtcgctagggtgaaatcacaccacgtgatgggagtacgacctgatagggtgctgcagaggcccactattaggctagtataaaaatctctgctgtacatggcacatggagttgaatcattttgaactttta5

8T/CVMA96—2022附录B（资料性）引物和探针序列引物和探针序列见表B.1。表B.1引物和探针序列病原靶基因引物名称序列猪瘟病毒（CSFV）5’UTR基FP15’AGCCCACCTCGAGATGCTA3’因FP25’AGCCCACCTCGATATGCTATG3’FP35’AGCTCACCTCGAGATGCTATG3’RP15’CTATCAGGTCGTACTCCCATCAC3’RP25’TATCAGGTCGTACCCCCATCA3’Probe15’Cy5-ACGAGGGCAWGCCCAAGAC-BHQ13’Probe25’Cy5-ACGAGGGCACGCCCAAG-BHQ13’非洲猪瘟病毒VP72FP15’GCGATGATGATTACCTTTGCTTTG3’（ASFV）基因FP25’CGATGATGATTACCTTCGCTTTGA3’RP15’CGATACCACAAGATCAGCCGT3’RP25’CTGATACCACAAGATCAGCCGT3’RP35’GATACCACAAGATCGGCCGT3’Probe15’FAM-CACGGGAGGAATACCAACCCAG-BHQ13’6

9T/CVMA96—2022附录C（资料性）病毒核酸提取步骤C.1CarrierRNA溶液的配制C.1.1CarrierRNA储存液配制向装有310μgCarrierRNA冻干粉的管子中加入310μLRNase-FreeddH2O，将CarrierRNA彻底溶解，得到终浓度为1μg/μL的溶液，并分装，置于-20℃储存。C.1.2CarrierRNA工作液配制根据样品数量计算所需缓冲液GB和CarrierRNA溶液的体积（计算公式如下1和2），将缓冲液GB与CarrierRNA溶液颠倒混匀，即得到CarrierRNA工作液；为避免溶液出现起泡现象，请勿使用涡旋振荡。...........................................................................................(1)公式（1）中：y为需要加入缓冲液GB的体积（mL）；n为同时提取的样品个数；m=0.22mL。.........................................................................................(2)公式（2）中：z为需要加入CarrierRNA溶液的体积（μL）；y为需要加入缓冲液GB的体积（mL）；x=28μL/mL。C.2操作步骤C.2.1用移液器将20μLProteinaseK加入一个干净的1.5mL离心管中。C.2.2向离心管中加入200μL血浆/血清/病毒培养液或25mg组织匀浆（样品需平衡至室温），如果样本体积小于200μL，可加入0.9%NaCl溶液补充。C.2.3加入200μLCarrierRNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀。C.2.456℃孵育15min，简短离心，收集附着在管壁及管盖的液体。C.2.5加入250μL无水乙醇，涡旋振荡15sec，彻底混匀，在室温（15℃-25℃）放置5min。C.2.6简短离心，收集附着在管壁及管盖的液体。C.2.7将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2（吸附柱放在收集管中），盖上管盖，6000×g离心1min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。C.2.8小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，6000×g离心1min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。C.2.9小心打开吸附柱盖子，加入600μL溶液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，静置2min，6000×g离心1min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。C.2.10重复步骤2.9。C.2.11小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，6000×g离心1min，弃收集管中的废液。C.2.12将吸附柱放回收集管中，13400×g离心3min，使吸附膜完全变干，弃收集管中的废液。7

10T/CVMA96—2022C.2.13将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管（1.5mL）中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150μLRNase-FreeddH2O，盖上盖子，室温放置5min。C.2.1413400×g离心1min，收集到的即为病毒总核酸（DNA或RNA）。注：上述提取步骤以TIANampVirusDNA/RNAKit为例，如果使用其他等效核酸提取试剂，请遵照试剂盒使用说明书操作。B_________________________________8