干扰素综述课件

《干扰素综述课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因原核表达产物的ELISA试剂盒南京农业大学陈溥言

1病毒血清型与基因型PRRSV至今未发现有不同血清型，但来源于不同地理位置的毒株间核苷酸序列变异较大。所以又将PRRS分为2个不同的地理群或亚群，或者基因型（genotype）：欧洲基因型（简称A群或A亚群）原型病毒为LV株；和美国基因型（简称B群或B亚群），原型病毒为ATCCVR-2332株。

2我国分离到的毒株都属美洲型，尚末发现欧洲型。

3猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展临床诊断病原学检查病毒分离与鉴定抗原检测血清学试验IPMA、IFA、SN、ELISA分子生物学诊断方法

4PRRSV结构模式图GP5MGP2,GP3,orGP4NssRNA(+)LipidbilayerAAA

5

6ORF2ORF3ORF4ORF5ORF6ORF7AnORF1abAn15.1kbGP2GP3GP4GP5MN771bp765bp537bp603bp525bp372bpPRRSVVR2332病毒基因结构

7PRRSV基因组组成结构示意图

8PRRSVPRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒,在其结构蛋白基因中,编码核衣壳蛋白(N蛋白)的ORF7基因相对保守。N蛋白是非糖基化蛋白,分子质量约为14—15KD,N蛋白具有强碱性，其C端在维持蛋白质构象上发挥重要作用。其N-端的半段是由Arg、Lys、His三种氨基酸组成，在组装核衣壳蛋白的过程中可能促进N蛋白和RNA基因组的相互结合，这是两种血清型毒株所共有的特点.

9N蛋白在病毒粒子中含量较高，约占病毒蛋白总量的20-40%，具有极强的免疫原性。试验表明，感染PRRSV后约9—11天左右，机体首先产生针对该蛋白的抗体，随后产生的才是对其它蛋白的抗体，该抗体最长可维持一年以上，但是不具备中和活性。根据N蛋白的这种特性，现在更多地被用于本病诊断方法的研究。因此,N蛋白可作为检测PRRSV抗体的首选抗原蛋白。

10根据GenBank上公布的PRRSVATCCVR2332株的核衣壳蛋白基因(N基因)的核苷酸序列,设计并合成了一对引物：上游引物P15′GCGGATCCATGCCATCTAACAAC3′；下游引物P25′AGCTCGAGTCAGGCTAGGGATGA3′。并应用RT-PCR方法扩增出了VR2332resp株的目的N蛋白基因片段.

11N蛋白基因片段连接进pET-32a（+）质粒，经双酶切鉴定，构建了重组质粒pETN。转化大肠杆菌BL21，运用IPTG进行诱导表达，并对诱导条件进行了优化，使核衣壳蛋白得到高效表达。应用His-bind树脂层析柱纯化重组核衣壳蛋白，纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定其纯化效果，并用Western-blot检验其特异性。

12Western-Blot分析重组N蛋白的反应原性图7重组N蛋白诱导表达分析1,3,5诱导后3小时2,4,6未诱导7.中等分子量标准蛋白质图8重组N蛋白Western-Blot分析1.经IPTG诱导的pRSET-N2.经IPTG诱导的pRSETA123456M12

13SDS-PAGE分析纯化蛋白质的纯度重组N蛋白纯度分析

14.蛋白质浓度测定OD595蛋白质含量蛋白质浓度（ug/ul）10.42810.900.21820.47416.150.32330.45615.350.30740.45312.90.258

15在此基础上，利用重组N蛋白作为包被抗原，优化ELISA反应条件（如抗原的包被，作用时间及底物的选择）后，确定了判定标准，建立了检测猪繁殖与呼吸综合征血清抗体的重组N蛋白—ELISA方法。

16在获得PRRSV高效表达产物的基础上，对其采用His-bind树脂亲和层析柱纯化，达到良好的纯化效果。应用Western-blot试验检验了PRRSV的重组N蛋白具备良好的反应原性，为随后建立诊断方法提供了重要依据。建立了PRRS抗体检测的重组N蛋白-ELISA方法，证明该方法具有良好的特异性、敏感性及可重复性。此方法与美国IDEXX公司ELISA试剂盒的检测符合率为96%。大大降低了检测成本，有着良好的应用前景。

17试剂盒组成ELISA板条。20×洗涤液（W）。20×血清稀释液（D）。酶标二抗反应液（E）。显色液（A）。双氧水（H2O2）。2mol/L硫酸终止液（S）。PRRSV标准阳性血清（P）。PRRSV标准阴性血清（N）。

18使用步骤用蒸馏水依次将W液和D液稀释好后备用。用D液将待检血清1：40稀释后依次加入96孔ELISA板条1~93孔，每孔100mL。在最后3孔依次加入P、N和D各100mL。37℃孵育1小时。洗板：每孔加入300mLW液，静置5分钟后弃去。再重复3次后板条在吸水纸上拍干。ELISA板上1~95孔各加入E液100mL，第96孔加D液100mL37℃孵育1小时。洗板：每孔加入300mLW液，静置5分钟后弃去。再重复3次后板条在吸水纸上拍干。将45mLH2O2加入A液混匀后依次加入板条各孔100mL，室温避光反应15~30分钟。每孔加入S液100mL终止用酶标仪在490nm测定OD值：检测样品OD490/已知阴性血清OD490＞2.1且已知阳性血清OD490＞1.0,即可判为阳性。

19美国学者证明猪繁殖与呼吸综合征血清抗体的重组GP5蛋白—ELISA方法可区分猪繁殖与呼吸综合征强毒株和疫苗毒株.反映真实的免疫水平。

20基因工程抗菌肽的研制南京农业大学陈溥言

21目前混合感染十分普遍,病毒与病毒的混合感染,细菌与细菌的混合感染,病毒与细菌的混合感染等等。使疾病的防治越来越困难.生物安全提到更重要地位。

22抗菌肽(antibacterialpeptides,ABP)抗菌肽(antibacterialpeptides,ABP)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子小肽,是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止,已在许多生物包括昆虫、鸟类、动物、植物及原核生物中发现2000多种抗菌活性肽。

23研究背景许多畜牧兽医成就是建立在抗生素应用的基础上的。抗生素的滥用，不仅导致了严重的病原菌耐药性问题，而且也造成了药物残留等公共卫生隐疾。

24为了消除抗生素应用所带来的负面影响，减少和杜绝耐药菌株的出现和传播，世界卫生组织呼吁各国采取紧急措施。

25美国（国家疫病控制和预防中心）、英国等许多国家都制定了相应的策略；欧盟拟定于2005年取消抗生素在动物添加剂中的使用.我国亦有此趋势,为进一步完善兽药管理法规，使我国兽药管理工作与国际接轨，农业部出台了一系列关于“兽药使用监督和兽药残留监控”、“出口动物及动物产品防疫检疫”等多项整改措施。

26针对于此，“无毒、无残留、无耐药性”是新一代抗菌制剂的发展趋势和要求。抗菌肽不但广谱抗菌，能抑杀耐药性菌株，而且它的杀菌机制使病原菌不易产生耐药性突变，从而成为新型抗菌剂的首选。

27CompanyPeptideClinicalindicationStageofdevelopmentMagaininPharmaceuticalsMSI-78(α-helical)ImpetigoAbandonedafterphaseⅢ(1997)MSI-78TopicaltreatmentofdiabeticfootulcersPhaseIII(1997)AppliedMicrobiology/Astra/MerckNisin(lantibiotic)GastricHelicobacterinfection/ulcersEarlyclinicaltrails(1997);PhaseI(1998)AppliedMicrobiology/Nippon/ShojiNisinvariantsVancomycin-resistantenterococci(parenteral)Preclinicalresearch(1997)MicrologixBiotechMBI-11CN+Gram-positiveinfectionPreclinicalresearch(1997)MBI-20series(α-helical)Gram-negativeinfection;enhancersofconventionalantibioticsResearchanddevelopment(1997)IntrabioticsIB367(β-sheet)Topicaltreatmentoforalmucositis(muothulcerations)Preclinicalresearch(1997);PhaseI(1998)XomaMycoprex(BPI-derived)Systemiccandidiasis;enhanceroffluconazoleactivityPreclinicalresearch(1997);PhaseⅡcompleted，PhaseⅢinitated(1998已经批准上市的抗菌肽产品

28最初，人们把这类具有抗菌活性的多肽称为“antibacterialpeptides”。后来发现有些“antibacterialpeptides”还具有抗真菌等其它微生物的功能，便称之为“antimicrobialpeptides”。随着研究的深入，人们相继发现这类多肽还具有抗寄生虫、病毒、癌细胞等功能，随着这类多肽物质在医药学上的应用，许多学者倾向于称之为“peptideantibiotics”。

29抗菌肽作用机制抗菌肽的作用机制与传统抗生素有相当大的不同,抗菌肽分子的构成氨基酸中大多数为带正电荷的氨基酸,具有两性电解性质。分子通过正电荷与细菌胞浆膜磷脂分子上的负电荷形成静电吸附而结合在脂质膜上,继之,抗菌肽分子中的疏水段借助分子中连接结构的柔性插入到质膜中,进而牵引整个分子进入质膜,扰乱质膜上蛋白质和脂质原有排列秩序,再通过抗菌肽分子间的相互位移而聚合形成跨膜离子通道抗菌肽作用模式图。

30图2　肽抗生素与细胞膜的相互作用(Ａ)人肽抗生素ＨＮＰ3分子,带阳离子,黑色区域为疏水区,其余区域为亲水区。(Ｂ)肽抗生素分子与脂质双层膜相互作用。(Ｃ)肽抗生素分子插入脂质双层膜中。(Ｄ)肽抗生素分子聚集而形成跨膜离子通道。抗菌肽作用机理演示图一般地讲，细菌的胞浆内是高渗性的，革兰氏阳性菌的胞内渗透压高达20～25个大气压,革兰氏阴性菌亦达5～6个大气压。在质膜上形成跨膜离子通道后,胞内离子大量流失,细菌不能保持其正常渗透压而死亡。

31抗菌肽的结构特征大多数抗菌肽的相对分子质量较小，仅仅为4kD左右。抗菌肽的一级结构都比较相似：N端富含赖氨酸、精氨酸等阳离子类氨基酸。C端富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸。

32图1MatureCecropinA蛋白结构模式图Mw:4060.84;Ch:+5.91;PI:10.39;CecropinA(38AA)抗菌肽二级结构

33cecropinA蛋白1-12AA的两亲性螺旋轮在这里我们可以看到V、M、I、L等疏水性氨基酸在螺旋的一侧，K、R分布于螺旋的另一侧，具有较好的两亲性。这为抗菌肽的优化改造提供了理论参考和分析平台

34抗菌肽的来源天然资源提取固相合成基因工程生产由于抗菌肽基因一般都较小，故采用人工合成的方法来获得目的基因，再通过基因工程方法进行微生物发酵生产抗菌肽则更具有实际意义。成本高、得率低、工序繁琐相当昂贵，难于应用于实际

35

36抗菌肽的基因工程生产利用基因工程的方法生产抗菌肽是降低生产成本的一条有效途径。但抗菌肽对原核细胞的毒性限制了其在原核表达系统中的有效表达。为了克服抗菌肽对宿主细胞的毒性，可采用原核融合表达和真核表达策略。

37研究意义为抗生素滥用所致的耐药性、药残等公共卫生问题的解决或缓解提供物质依托。打破贸易壁垒，提高经济效益。在天然型抗菌肽研究已相当普遍化的情况下，对天然型基因工程药物进行分子修饰，避免了研究工作的重复及知识产权的侵犯，另一方面又为新型抗菌药物研究开辟更大的空间，使药物向高效、低毒、靶向及持久等多方面更合理地发展

38但由于抗菌肽由于抗菌肽N端序列对其抗菌活性有决定性作用，但原核融合表达产物须经化学裂解处理或酶解后才可获得有活性的抗菌肽单体，得率较低，工序繁琐。

39课题思路及设计防止对宿主菌的伤害保持天然N端C端酰胺化防止降解（分泌表达）便于纯化

40

41天然N端抗菌肽基因的设计与合成酶切位点Kex2F1F2酰胺末端终止子SOE(TD-PCR)

42TD-PCR结果　　2缺失酶切位点鉴定结果天然N端ABP基因的合成、表达载体构建及鉴定105bp89bpAMB

43天然N端抗菌肽cecA-mil重组酵母表达菌株的PCR鉴定（自设计引物）,天然N端magainin重组酵母表达菌株的PCR鉴定略天然N端cecA-mil重组酵母菌PCR鉴定

44重组酵母菌摇瓶发酵条件优化图1cecA-mil1重组酵母的生长曲线Fig.1ThegrowthcurveofrecombinantpichiapastorispICZα-A-ABP-1/X-33图2pH对cecA-mil重组酵母表达的影响Fig.2TheeffectofpHontheexpressionofcecA-milbyrecombinantpichiapastorispICZα-A-ABP-1/X-33

45图3甲醇浓度对重组酵母表达的影响fig.3TheeffectofmethanolconcentrationontheexpressionofcecA-milbyrecombinantpichiapastorispICZα-A-ABP-1/X-33图4诱导时间对重组酵母菌表达的影响Fig.54TheeffectofinductiontimeontheexpressionofcecA-milbyrecombinantpichiapastorispICZα-A-ABP-1/X-33

46图5诱导温度对重组酵母表达的影响Fig.5TheeffectofinductiontemperatureontheexpressionofcecA-milbyrecombinantpichiapastorispICZα-A-ABP-1/X-33

47在追加甲醇的同时补加营养液，可提高抗菌肽的表达量，未加营养液时发酵上清在48h时表达量为125μg/mL，补加营养液时则为137μg/mL。抑菌活性也得到提高，抑菌直径为1.4cm,比未补加营养液时提高约10%。从实验结果来看，在诱导表达时添加酪蛋白水解物对抗菌肽的表达量及抑菌活性没有明显影响。

48优化参数当种菌密度OD600为5-6时转接发酵培养基，酵母增殖快，ABP-1表达量高。甲醇诱导初期BMMY培养基pH为6.0时最有利于重组酵母菌生长，表达后期将BMMY培养基pH值控制在3.0。可获得最高蛋白表达量。0.5%浓度的甲醇足于诱导抗菌肽表达，补加甲醇的同时补加营养液，可提高cecB-1抗菌肽的表达量。低温有利于表达抗菌肽活性的提高。发酵48h抗菌肽cecB-1表达量达到高峰。

49优化表达后的magainin抗菌肽Tricine-SDS-PAGE电泳结果电泳结果光密度扫描分析（表达量195μg/mL）

50抗菌肽纯化工艺的初步摸索一种蛋白质能够被纯化，是由于其独特的理化性质。cecB-1抗菌肽分子量为3.96kD，pH7.0时携带正电荷数6.91，pI为10.71，所以在纯化时就可以优先考虑超滤浓缩（或透析浓缩）和阳离子交换层析。

51离心(12000r/min×10min)MWCO1000D的透析袋（SP132640）PEG浓缩sephadexG-25凝胶过滤(sephadexG-50)浓缩纯化样品

52表达抗菌肽cecB-1的活性测定纯化后的抗菌肽ABP-1在倍比稀释后进行抑菌活性测定，原浓度为1750μg/mL。稀释至55μg/mL时仍可观察到明显的抑菌圈。抗菌肽B对G－菌的杀菌效果　　　　　（DH5alpha）

53抗菌肽1对CowanⅠ的抑菌活性　　　抗菌肽1对AMP+抗性菌抑菌活性

54抗菌肽的抗菌特性研究广谱抗菌活性抗菌效价热稳定性酸碱稳定性对耐药菌株的杀伤活性对正常肠道菌群的影响

55抗菌肽cec-mil的广谱抗菌活性

56抗菌肽cec-mil的抗菌效价结果显示：在表达上清加入量大于40μL（≥9.8μg）以后，OD值从开始的OD650=0.075下降到OD650≤0.025，也即加入9.8μg重组cecA-mil就可以抑制260μLLB培养基中含有40μL的E.coliDH5α(OD650=0.75)的生长。随着抗菌肽量的增多,OD650值越来越小，结果表明抗菌活性与抗菌肽的量有一定关系。

57重组杂合肽CecA-mil的酸稳定性结果显示，pH2~7时，抑菌直径较原来无明显变化，pH8~12时，随着pH值增高，抑菌直径逐渐减小。说明此抗菌肽对酸具有稳定性，而高pH对其抗菌活性有抑制作用。

58重组杂合肽CecA-mil的热稳定性结果显示，煮沸1h的cecA-mil抑菌圈与未煮沸的抗菌肽的抑菌圈大小无明显区别，煮沸2h和3h之后，其抑菌直径略有减小。表明抗菌肽具有很强的热稳定性。

59对耐药菌株的杀伤活性对于实验室内携带有不同抗性的质粒转化菌，cec-mil显示很好的抑杀作用。对于氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性的鸡致病性大肠杆菌（O1）、鸡白痢沙门氏菌（Salmonellapullorum），cec-mil具有明显的抑杀作用。

60长效抗菌肽设计及基因改造蛋白质药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用方式在体内被清除。其中，分子量小于20kDa的多肽类药物在代谢过程中易于由肾小球滤过，并在通过肾小管时被蛋白酶部分降解而从尿中排出，半衰期很短。近年来，各国学者纷纷着手长效多肽药物的研究，并取得了一定成效，改造方法主要涉及到化学修饰、基因融合、点突变以及制剂改造等。

61思路设计通过基因融合在抗菌肽C端引入多肽载体蛋白基因，增加多肽药物分子量或改变与受体的亲和性等原理延长药物半衰期。猪IgGFc片段细胞因子（ChIFN、PoIFN）干扰素

62融合猪IgGCH3抗菌肽基因的拼接CM/CH3、Mag/CH3基因的拼接，基因全长分别为460bp和480bp左右，其中CH3基因约为420bp，如右图所示。左图为其重组载体的酶切鉴定。1　2　3200010007505002501001　2　3　M　4　5

63融合poIFN、ChIFN抗菌肽基因的拼接CM/PoIFN、Mag/PoIFN、CM/chIFN、Mag/chIFN融合基因的设计合成及表达载体构建。左图为chIFN、poIFNPCR扩增结果。右图是重组载体pPICZ-CM/PoIFN、pPICZ-Mag/PoIFN、pPICZ-CM/chIFN、pPICZ-Mag/chIFN的PCR鉴定结果,所用引物为自设计引物，鉴定抗菌肽基因是否正确插入。1　2　M20001000750500250100

64重组CM/CH3、Mag/CH3的SDS_PAGE１　　２　　３　４　５　M

65CM/CH3、Mag/CH3长效肽的体外抗菌活性重组抗菌肽CM/CH3、Mag/CH3经浓缩15倍后体外抗菌活性可达到cecA-mil杂合抗菌肽浓缩10的杀菌活性。如右图所示。其中CM/CH3较Mag/CH3活性高。

66干扰素综述

6730年代,人们发现机体感染某一病毒后,会对另一种抗原性毫无关系的病毒发生干扰现象。英国科学家Isaacs和Lindemann于1957年发现的。将56℃加热1h灭活的流感病毒加入到鸡胚绒毛尿囊膜碎片中，孵育后发现此膜能抵抗活流感病毒的感染，并向外周释放具有干扰活性的因子，离心后吸取的上清液能使别的鸡胚绒毛尿囊膜碎片获得对病毒的抗性,他们将该物质称为干扰素。

681980年，国际干扰素命名委员会正式将其定名为interferon,简写为IFN，干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受到细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。现在，干扰素一般指脊椎动物受到干扰素诱生剂作用后合成的一类具有细胞功能调节作用的蛋白。

69动物机体内一般情况下不产生干扰素，即使在病毒的诱导下也仅仅产生极微量的干扰素，难以提纯。因此，开发高效生产干扰素的体系是干扰素研究和应用的基础。80年代以来，人的干扰素基因克隆表达成功后应用到临床，获得了抗病毒的显著效果。美国FDA在1986年批准Roche公司的基因工程α-2a干扰素和Schering公司的基因工程α-2b干扰素上市，当年的市场销售额就达1.5亿美元。基因工程β、γ干扰素分别在1990年、1993年批准上市。1992年，我国第一个基因工程药物a-1b干扰素获得国家一类新药证书。目前60多个国家批准基因工程干扰素上市，成为医药生物技术产品业的重要产品。

701986年，英国食品药品管理委员会(FDA)首先批准基因αIIα和αIIβ干扰素投放市场，基因工程β、γ干扰素也相继于1990年、1993年获准投放市场。目前已有57个国家批准干扰素上市，治疗约30多种疾病。、卫生部上海生物制品研究所、卫生部长存生物制品研究所和中国药品生物制品检定所等单位共同研制开发的人αIβ型、αIIα型基因工程干扰素已经国家新药审评委员会专家审议通过，投放市场。它是我国第一批经国家正式批准的基因工程高技术药物，其中人αIb型基因工程干扰素系我国首创。

71我国已经批准上市的基因工程干扰素都是人用基因工程干扰素rhuIFNα1b（外用）长春生研所1989试生产,治疗病毒性角膜炎.rhuIFNα1b上海生研所,深圳科兴,1996正式生产,抗HBV，HCV感染等.rhuIFNα2a长春生研所,长生药业,三生药业,新大洲药业,1996正式生产,抗尖锐湿疣，疱疹HBV，HCV感染等.rhuIFNα2b里亚哈尔,华立达,安科,华新1996正式生产,1997正式生产,抗HBV，HCVHBV，HCVHBV感染等.rhuIFNγ上海生研所,克隆,丽珠生物工程1994试生产,抗类风湿.

72近年来，干扰素在动物疾病防治中的应用也得到了高度的关注。1.Labonnardiere在1990年曾报道猪干扰素对传染性胃肠炎等病毒的抑制作用。2.四川省世达生物技术有限公司在1997年就对应用猪血白细胞研制猪干扰素以及猪白细胞干扰素在控制猪流行性腹泻等传染病的作用进行了研究，并推广应用。3.猪Alpha/beta干扰素对口蹄疫病毒具有显著的抑制作用，可以利用表达猪Alpha/beta干扰素的复制缺限腺病毒免疫猪群来有效预防和治疗口蹄疫。---------JarasvechChinsangarametalNovelviraldiseasecontrolstrategy:adeenovirusexpressingAlhpainterferonrapidlyprotectsswinefromFootandMouthdiseaseJournalofvirology2003,p1621-1625

73，80年代初，人的干扰素基因克隆成功以后各国的学者相继开展了动物干扰素的研究。1987年以来，猪、鸡、鸭等动物的干扰素基因先后被克隆报道。Hiummler等于1987年首先开始了犬干扰素-基因的研究。1992年Zucker等和Devos等研究小组几乎同时克隆了犬干扰素-基因（CaIFN-）,而且Zucker等将CaIFN-基因在中国地鼠卵巢细胞（CHO）中进行了表达。1996年，Akira等克隆了犬干扰素-基因。最近，Nishikawa等和Okano等又分别利用痘病毒和重组杆状病毒表达了CaIFN-并进行了犬重组干扰素（rCaIFN-）抗病毒感染和提高MHC11表达等试验。

74干扰素是一个大的家族,一种重要的细胞因子，涉及抗病毒、细胞生长调节和免疫激活,多功能的分泌蛋白。也是研究病毒感染机制的重要指标。SARS流行期间,干扰素作出重要贡献.目前已知所有的哺乳动物均可产生IFN。根据来源动物的不同，可将IFN分为人干扰素（HuIFN）、小鼠干扰素（MuIFN）、猪干扰素（PoIFN）等。干扰素保护作用具有种属特异性。干扰素的理化性质较稳定，60℃1h不被破坏，在PH2-11范围内不变性。

75抗细菌、寄生虫作用干扰素对于宿主防止多种寄生虫病起着重要的作田。大部分抗寄生虫活性似乎是通过干扰素增强了细胞毒效应细胞的活性来调节。可是，研究证明干扰素还起着更直接的作用。目前以证实，IFN-γ疗法使靶细胞内池色氨酸耗竭，因此使锥形虫繁殖受到抑制，。在另外的研究中，干扰素疗法对于靶细胞似乎是以防止沙门氏菌侵入的方式使反应细胞的细胞膜发生改变。致病菌（志贺氏菌）可能也包括着一个相似的机理---即干扰素调节的防止细胞渗透的作用

76免疫调节活性干扰素对于免疫系统的几个方面都起着调节作用：包括抗体反应的表达，细胞毒效应细胞功能和细胞表面抗原的表达。研究表明，干扰素对于肿瘤细胞的这些间接作用在其抗肿瘤活性方面起着重要的作用

77抗肿瘤和抗增殖活性许多动物试验研究表明，干扰素不仅对体外而且对体内恶性和正常的细胞增生都具有明显作用，它抑制了许多恶性和正常细胞的增生并具有胜似抗新生物化疗药物的作用。在许多抗自发性新生物，抗病毒诱发性新生物和抗转移瘤的动物试验中均证明了干扰索的这种抗肿瘤作用。

78相对的种属特异性IFN的活力具有相对的种属特异性,　IFN的活力具有相对的种属特异性,即某一种属动物(或组织细胞)产生的IFN只能对同种属或种属非常接近的动物或细胞有保护力,即IFN活力在同种细胞上高,在异种细胞上低。鸡IFN在鸡细胞上,1/4000的滴度即可抵御水泡性口炎病毒(VSV)的攻击,而在鼠细胞上,滴度1/30仍不能保护。但是这种特异性是相对的,不是绝对的,如猴细胞产生的IFN除对猴有保护作用外,对人和兔的细胞也有一定的保护作用。

79微弱的抗原性1975年有人报告,用鼠或鸡IFN免疫兔或豚鼠,每周1次,在第10次出现抗体,第18次以后抗体滴度稍高。也有人报告,用人和兔的IFN免疫豚鼠,每周1次,持续半年才获得中和抗体。。

80干扰素的分类一,根据其氨基酸、抗原性和细胞来源，可将其分为三类：IFN-α、IFN-β和IFN-γ.没有明显的结构同源性。然而由于诱导基因类型的广泛相似，表现出功能的相似性。目前已经清楚干扰素能诱导大量的基因转录。

81二,干扰素又可分为两类;Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素。Ⅰ型干扰素又主要包括IFN-α（白细胞干扰素）、IFN-β（成纤维干扰素）、IFN-ω和IFN-τ,他们具有相关的结构并享用同一类受体,前3种主要是对病毒感染的应答产生的,能诱导机体抗病毒蛋白的产生。它们有相似的生物学活性，结合同样的细胞受体，统称为I型干扰素.其中α干扰素为多基因家族，分为许多亚型，分别命名为α1、α2、α3……

82IFN在病毒感染反应中的重要性是建立在这样一个事实上：基因敲除IFN-α、IFN-β或IFN-γ受体的小鼠感染大量病毒也不能产生有效的免疫保护反应。

83通常针对不同病毒感染需要的IFN类型不同，在许多情况下干扰素的作用是必须的。任何一种IFN都可激发目标细胞进入抗病毒状态，通过细胞和病毒周期相关的一些酶来干扰或阻断病毒复制。两种类型的干扰素都可减缓目标细胞的生长或使他们发生凋亡，从而限制病毒传播。

84干扰素的诱导表达病毒感染成纤维细胞诱导IFN-β的表达是目前研究的热点，普遍认为诱导物是细胞内形成的双股RNA。IFN-β的诱导最初始于转录起始，其关键步骤是转录因子NF-κB从细胞质到细胞核的再分布。NF-κB在许多免疫调节基因的转录诱导起重要作用，如I型MHC和细胞黏附分子。NF-κB通常位于细胞质中与其抑制因子IκB结合而处于静止状态。在一系列广泛应激信号（如：脂多糖、TNF、IL-1和病毒dsRNA）作用下，IκB被一特异的多亚基复合物—IκB激酶磷酸化。磷酸化的IκB被一种E3泛肽连接酶泛肽化，泛肽化的IκB本身就是蛋白酶体降解的目标。一旦抑制因子IκB被破坏，与其联结的NF-κB就会从被抑制状态获得自由进入细胞核激活转录。

85IFN-γ启动子由两个不同的调控元件控制，比较而言，在CD8+T细胞只有远端元件被激活，产生远比在CD+4T细胞弱的反应。近端调控元件是被含有c-Jun和ATF-2复合物激活，而远端调控元件是被GATA和ATF-1复合物激活。有关IFN-γ基因被激活转录的机理还不清楚，但涉及P38和JNK2MAP激酶途径。IL-12、IL-18及抗原提呈细胞激活后产生的细胞因子显著提高抗原刺激后IFN-γ的产量。

86大多数IFN-α/β诱导基因的上游调控序列含有序列[GAAAN（N）GAAA称之为ISRE。IFN-γ诱导基因的上游调控区域含有一个独特元件-GAS，含共有序列TTNCNNNAA。

87γ-干扰素又称免疫干扰素，主要由激活的T细胞和NK细胞产生，抗原、细胞分裂素、IL-1、2等均可刺激其合成，但另一些白介素成员如IL-4和IL-10又能抑制γ-干扰素的产生。γ-干扰素的生物学活性具有高度的种属特异性。除了抗病毒、抗增生作用外，γ-干扰素与特异受体结合，显示独特的功能：激活巨噬细胞并促进其活性；促进多种细胞表达MHCI类和MHCII类分子；促进TH0细胞分化为TH1细胞，并抑制TH2细胞增生；促进CTL成熟及活性；促进B细胞分化，产生抗体及Ig类型转换；激活中性粒细胞功能和NK细胞杀伤活性，激活血管内皮细胞等。

88干扰素抗病毒作用干扰素的生物学活性的启动是IFN-α、β及γ结合到位于细胞表面的特异受体上，激活不同但相关的信号途径—Jak/STAT途径，信号转导激活那些原本处于静止状态或低水平表达的目标基因转录。干扰素诱导产物参与抗病毒作用中研究最为清楚的是PKR和2‘-5’寡腺苷合成酶，尽管目前清楚其它因子也参与抗病毒作用，如调节细胞周期和死亡，从而限制病毒的复制，在许多情况下，干扰素诱导的酶在病毒感染之前是没有活性的，以保证没有感染的细胞不会遭受过多的损伤。现认为活化干扰素诱导酶的病毒共作用因子是dsRNA。

89干扰素对病毒复制的抑制作用靶点病毒IFN诱导的抗病毒蛋白侵入、脱壳SV40、逆转录病毒未知转录流感病毒、VSV、HSVMx蛋白（+其他？）翻译微RNA病毒2-5（A）合成酶和RNaseL呼肠孤病毒、腺病毒dsRNA依赖性蛋白激酶痘病毒、VSV、流感病毒组装、释放逆转录病毒、VSV、HSV未知

90病毒逃避干扰素作用的策略干扰素系统是高等真核生物在进化过程中获得的最早的防御病毒感染的机制之一。不难理解宿主和他们的病原的经过百万年的共同进化导致了大多数的病毒都获得了至少某种程度上的抑制宿主干扰素系统的机制。有趣的是不同的病毒通过抑制干扰素激活的信号传导和抗病毒途径的不同环节来吉抗干扰素诱导的防御作用。

91许多病毒能控制细胞的蛋白质合成，通过条件性选择表达病毒蛋白阻碍细胞蛋白质的合成。关闭细胞蛋白质的合成，病毒可以更多的利用细胞的能量和物质来翻译病毒蛋白。另外，既然干扰素介导的抗病毒作用的诱导依赖于细胞因子的翻译，如干扰素自身，因此病毒诱导细胞蛋白质合成的关闭有助于抑制感染细胞干扰素的作用。况且通过eIF-2a磷酸化来抑制翻译是干扰素的抗病毒机制之一，一些病毒已经进化获得了不依赖eIF-2a的翻译起始机制来僻开细胞的防御。SV40通过一个未知的机理机制在表达SV40T抗原的细胞中eIF-2a磷酸化后翻译并没有被抑制。关闭蛋白质的合成

92产生干扰素合成的抑制物一些病毒编码的双股RNA结合蛋白抑制感染细胞内双股RNA激活途径。1型干扰素是由病毒感染过程中产生的双股RNA激发产生的。双股RNA被认为能活化细胞激酶，包括组成性表达的PKR，导致一些参与启动干扰素表达的转录因子激活，如IRFs，NF-κB和ATF-2/Jun。这样的病毒蛋白有呼肠孤病毒的σ蛋白、猪轮状病毒的NPS3蛋白、流感病毒的NS1蛋白等，如：缺失NS1基因的A型流感病毒可使其毒力致弱，因为其抑制1型干扰素系统的能力下降。

93一些病毒可能通过抑制干扰素合成的信号传导来阻碍干扰素的产生。如人8型疱疹病毒编码4种IRF同源物，通过负调控作用抑制IRF-1、IRF-3和IRF-7等功能。人16型乳多空病毒的E6蛋白直接与IRF-3结合并阻止其活化。腺病毒E1A蛋白与IRF-3竞争集合CBP/p300，CBP/p300是一个转录共激活因子，增强包括IRFs和STATs等转录因子的活性。人16型乳多空病毒的E6蛋白也以CBP/p300为作用目标。另外，非洲猪瘟病毒的A283L基因产物是I-κB的同源物能阻止转录因子进入细胞核抑制NF-κB的激活从而封闭NF-κB信号传导途径。

94产生干扰素的信号转导抑制物一些病毒能抑制干扰素信号转导的途径。所有的I型干扰素信号转导的主要组成物，如IFN-a/B的受体，JAKI、TYK2，STATI，STAT2和IRF9都是病毒抑制的主要目标。例如:痘苗病毒的分泌蛋白B18R与I型干扰素受体竞争结合I型干扰素。这种可溶性蛋白也出现在天花病毒中，能够结合许多种动物的I型干扰素，提供一个广泛宿主范围的保护体系。人的巨细胞病毒感染通过降低JAKI和IRF9的表达来抑制干扰素的活性。小鼠多瘤病毒大T抗原结合并抑制JAKI，这种抑制功能与其肿瘤诱导的特性是一致的。在仙台病毒感染过程中对于I型干扰素的信号转导必需的TyK2酪氨酸磷酸化被部分抑制，另外仙台病毒编码的C蛋白还显著影响STATI的丝氨酸磷酸化和稳定性。

95产生干扰素抗病毒途径的抑制物干扰素诱导的PKR酶在宿主的抗病毒反应中所起的关键作用被出现在大多数病毒中的特异性抗PKR酶基因减弱。例如疱疹病毒、痘病毒、丙肝病毒都编码多个蛋白参与抑制PKR酶的功能，这些蛋白可在病毒的感染过程中引退双股RNA的产生，因此阻碍PKR酶的激活。一些病毒编码小RNA产物，有效地与双股RNA竞争结合PKR但是不激活PKR酶活性，这些RNA抑制物包括腺病毒的VAIRNA、espitein-Barr病毒的EBERRNA、HIV的TARRNA。丙肝病毒编码的E2蛋白是PKR酶的假作用底物，与细胞内底物eIF-2α竞争抑制PKR激酶活性。杆状病毒的PK2蛋白、痘苗病毒的K3L蛋白和HIV的Tat蛋白也都被证明与eIF-2α竞争结合活化的PKR。单纯疱疹病毒的U11蛋白是一个RNA结合蛋白，能结合并抑制PKR。

96单纯疱疹病毒编码的ICP34.5蛋白可抑制PKR的抗病毒活性，但不抑制其激酶活性。ICP34.5蛋白募集细胞内磷酸化酶对eIF-2a进行去磷酸化，解除PKR造成的翻译障碍。有趣的是非洲猪瘟病毒编码的ICP34.5蛋白类似物也被认为具有相同的功能。单纯疱疹病毒的U11蛋白是一个RNA结合蛋白，能结合并抑制PKR。单纯疱疹病毒早期感染时表达的U11蛋白可补偿ICP34.5的损失。近来还发现一些病毒如脑心肌炎病毒和艾滋病病毒感染细胞后诱导细胞产生RNaseL的抑制物RLI，抑制OAS/RNaseL系统。

97设计路线全血淋巴细胞的培养提取总的RNART---PCR扩增鸡的γ干扰素基因克隆到T—载体，确定其正确序列构建原核表达载体构建真核表达载体

98猪IFN-α（porcineinterferonalpha，poIFNα）分为2个亚型，至少有17个基因拷贝，分布于猪的1号染色体，目前只有部分被测序和表达。FrancoisLefevre等首先克隆了poIFNα1基因并将poIFN-α1成熟蛋白基因在大肠杆菌中进行了表达，具有较高抗病毒活性。猪α-干扰素研究背景

99干扰素活性检测微量病变抑制法(MDBK-VSV)水泡性口炎病毒(vsv)在MDBK细胞上产生病变猪干扰素作用后MDBK细胞接种VSV的对照

100重组猪α-干扰素活性测定结果测定结果（平均值，n=3）活性6.2×106U/mL含量0.23mg/mL

101猪β干扰素全基因为561bp，编码165个氨基酸的成熟蛋白和21个氨基酸的信号肽。其成熟蛋白部分含有三个半胱氨酸和三个N-糖基化位点。在氨基酸水平上，猪β干扰素与人类β干扰素的同源性为63%，而与猪α-干扰素的同源性只有32%。Southernblot分析表明猪β干扰素基因在猪基因组中只有单个拷贝。——ArturssonKetalMolecularcloningofageneencodingporcineinterferon-betaJInterferonRes.1992Jun;12(3):153-60猪β-干扰素

102DerbyshireJB利用ployI:C处理PK15细胞制备猪beta干扰素。在猪肾细胞上测试多种病毒对猪beta干扰素的敏感性。结果表明：猪3型腺病毒、猪流感病毒、凝血性脑炎病毒和轮状病毒对beta干扰素高度敏感；猪痘病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪肠道病毒对beta干扰素敏感稍低，但beta干扰素都能降低其增殖滴度。----DerbyshireJBTheinterferonsensititiveofselectedporcinevirusesCanJVetResJan;(1):52-55

103依据genBank上发表的猪β-干扰素基因(S41178)序列设计引物，参照Sambrook等方法从鲜新的猪肝组织中提取基因组DNA，PCR扩增出猪β-干扰素基因。测序结果表明克隆的序列与genBank上发表的猪β-干扰素基因(S41178)同源性为100%。MANKCILQIALLMCFSTTALSMSYDVLRYQQRSSNLACQKLLGQLPGTPQYCLEDRMNFEVPEEIMQPPQFQKEDAVLIIHEMLQQIFGILRRNFSSTGWNETVIKTILVELDGQMDDLETTLEGIMEEENFPRGDMTILHLKKYYLSILQYLKSKEYRSCAWTVVQVEILRNFSFLNRLTDYLRN猪β-干扰素在大肠杆菌中的表达

104原核表达的猪β-干扰素的活性测定测定结果（平均值，n=3）活性5.6×105U/mL含量0.16mg/mL

105猪β-干扰素在毕赤酵母中的表达及鉴定

106毕赤酵母表达重组猪β-干扰素活性测定

107猪γ-干扰素的克隆与表达猪γ干扰素基因含有两个内含子，其cDNAORF为501bp，编码23个Aa的信号肽和143个Aa的活性成熟蛋白。其活性形式是非共价形式的二聚体蛋白，分子内不含有二硫键。ConA可刺激体外培养的淋巴细胞表达IFN-γ。依据genBank上发表的猪γ-干扰素基因序列设计引物，提取ConA诱导培养的淋巴细胞总RNA作为模报，RT-PCR扩增出猪γ-干扰素ORFcDNA。测序结果表明与国外报道的猪γ-干扰素同源性为100%。

108猪γ-干扰素原核表达策略猪γ-干扰素原核单表达载体元件示意图猪γ-干扰素原核双顺反子表达载体元件示意图猪γ干扰素全基因亚克隆及大肠杆菌偏嗜性密码子改造载体构建猪γ干扰素成熟蛋白基因

109猪γ-干扰素活性测定结果测定结果（平均值，n=3）活性1.2×105U/mL含量0.12mg/mL

110猪beta干扰素对伪狂犬病毒的抑制作用正常对照MDBK细胞猪beta干扰素作用的MDBK细胞PRV-SH株在MDBK细胞上的病变

111猪β-干扰素对伪狂犬病毒的作用

112猪β-干扰素对伪狂犬病毒的作用

113

114poIFNγ+/GFP+/TK-重组伪狂犬病毒株的构建及其生物学特性的研究伪狂犬病是家畜和野生动物的一种重要传染病，对猪的危害最大，现已成为仅次于口蹄疫和猪瘟的主要疫病之一[1]。伪狂犬病毒（PRV）属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，疱疹病毒感染的一个共同特点是在感染的急性期后有一个潜伏感染期。PRV经口鼻感染后首先在上皮组织中复制，完成一个复制周期后子代病毒子大量增加导致对一级神经原的扩大感染。PRV主要潜伏在三叉神经节、嗅球和扁桃体内。在潜伏感染期中病毒DNA持续存在于感染部位但不产生感染性病毒子。应用敏感的检测方法如分子杂交和PCR方法可以检测到病毒基因组。潜伏感染的猪一直是使病毒活化、散毒并因此在易感猪群中传播的危险传染源，因为潜伏感染的病毒常可被一些应激因素（如冷、热应激）或某些生物活性化合物（如地塞米松、前列腺素等）所激活[3]。

115PRV潜伏在神经细胞中，就不可避免地与神经组织进行相互作用。虽然病毒DNA的复制对PRV建立潜伏感染和复活是必要的，但是宿主细胞因子在调节其潜伏和复发上也起着重要作用。潜伏和复发之间的转变是一个精细的病毒功能组合，涉及到病毒基因编码的蛋白的数量和复杂程度，还需要细胞因子及其周围环境的调节和影响。近年来，通过病毒感染功能缺失转基因小鼠以及表达细胞因子的重组病毒感染小鼠的研究发现：细胞因子在宿主神经系统抵御病毒感染中发挥重要作用。IFN-γ以及非炎性细胞因子IL-12和TNF-α在神经元中发挥天然抗病毒和免疫调节作用。

116MikloskaZ研究发现IFN-γ对HSV从感染的神经元沿触突转移到上皮细胞具有抑制作用[MikloskaZ,JVirol2001;75:11821]。SeguinMC和CantinE研究发现IFN-γ可抑制三叉神经中潜伏感染的HSV的激活[SeguinMC,JExpMed1994;180:353¨C8.，CantinE,JVirol1999;73:3418¨C23]。GwendolynK等通过将表达鼠IFN-γ的Sindbis病毒感染免疫缺陷转基因小鼠发现IFN-γ在某些神经细胞非融细胞性清除该病毒起特异作用[GwendolynK.SCIENCEVOL29313JULY2001]。GhiasiH等研究发现表达IFN-γ的单纯疱疹病毒与其原病毒相比神经毒力显著变弱[GhiasiH,et.alVirology2002Oct10;302(1):144-54]。

117poIFN-γ+/GFP+/TK-伪狂犬病毒转移重组载体构建示意图

118poIFNγ+/GFP+/TK-rPRV在TK-143细胞上形成的病变（可见光）poIFNγ+/GFP+/TK-rPRV在TK-143细胞上形成的病变（紫外光）

119重组腺病毒表达干扰素,可产生高滴度干扰素。

120根据其理化和生物学特性可将其分为Ⅰ型和Ⅱ型。其中牛Ⅰ型干扰素又分为α、β、ω、τ四个类型，均为无内含子的单拷贝或多拷贝基因，并具有广谱抗病毒作用。而γ干扰素又称Ⅱ型干扰素，是一种由CD4+Th1型、CD8+T细胞以及NK细胞产生的细胞因子，它不仅具有Ⅰ型IFN的抗病毒和抗肿瘤活性，更重要的是它还具有促进MHCⅡ类抗原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强T细胞辅助抗体产生和细胞毒性T细胞产生的能力等诸多免疫调节活性。牛干扰素

121牛γ干扰素全基因为501个碱基，编码166个氨基酸,前23个Aa为信号肽,后143个氨基酸为活性成熟蛋白，其分子量为16.8KD

122全基因为570个碱基，编码189个氨基酸,前23个Aa为信号肽,后166个氨基酸为活性成熟蛋白，其分子量为19KD牛α干扰素

123Hiummler等于1987年首先开始了犬干扰素-基因的研究。1992年Zucker等和Devos等研究小组几乎同时克隆了犬干扰素-基因（CaIFN-）,而且Zucker等将CaIFN-基因在中国地鼠卵巢细胞（CHO）中进行了表达。1996年，Akira等克隆了犬干扰素-基因。最近，Nishikawa等和Okano等又分别利用痘病毒和重组杆状病毒表达了CaIFN-并进行了犬重组干扰素（rCaIFN-）抗病毒感染和提高MHC11表达等试验。夏春等1999年也克隆报道过德国牧羊犬IFN-基因序列，2002年进行了CaIFN-的CDNA克隆及其在鼠骨髓细胞中的表达。犬干扰素-

124按GenBank基因库中犬IFN-的基因序列，设计引物，该引物可扩增IFN-整个开放读码框架。上游引物序列5-CCTAACTCTCTGAAACGA-3，下游引物序列5-TTATTCCGATGCTCTGCG-3犬IFN-

125鸡α干扰素克隆区编码193个氨基酸，其中前93个核苷酸编码31个氨基酸的信号肽，其成熟蛋白的分子量约为19个KD鸡γ干扰素克隆区编码164个氨基酸，其信号肽由19个氨基酸组成。其基因组结构由4个外显子和3个内含子组成。Ⅰ型干扰素与哺乳动物的Ⅰ型干扰素的同源性有20%-24%，鸡γ干扰素与哺乳动物的γ干扰素的同源性约为30%左右。鸡α、γ基因编码特点

126鸡r干扰素基因结构鸡r干扰素的基因为单拷贝基因，全长6765个碱基，含有三个外显子和四个内含子。每个外显子编码的氨基酸数量与哺乳动物的相当，但仅第二个外显子编码的氨基酸具有显著的同源性。整个基因由四部分组成，依次为5’端非编码区、信号肽编码区、IFN结构蛋白编码区和3’端非编码区。其中，第一个外显子包括5’端非编码区和信号肽编码区，编码19个氨基酸的信号肽和成熟蛋白的前22个氨基酸，信号肽具有引导蛋白质分泌到细胞外的功能；结构基因编码区有492个碱基，编码164个氨基酸，成熟的鸡r干扰素由145个氨基酸组成，推导的分子量为16-20KD，有两个潜在的N糖基化位点，2个C端Cys；三个内含子的长度分别为1825、355、641碱基。鸡r干扰素

127鸡干扰素的生物学功能1抗病毒活性鸡干扰素的抗病毒活性具有广谱抗病毒活性：鸡的干扰素无论是天然的还是重组干扰素均具有较强的抗病毒的能力。其中鸡干扰素抗流感病毒和水疱性口炎病毒的能力最强，对新城疫病毒，传染性支气管炎病毒等传染性较强、危害较大的疾病均有不同程度的抵抗力

128干扰素在家禽肿瘤及病毒病治疗上的应用肿瘤性疾病病病毒性疾病马立克氏喉气管炎白血病新城疫网状内皮组织增殖病脑脊髓炎火鸡淋巴细胞增殖病流感病因不明的肿瘤病腺病毒感染痘病毒感染呼肠孤病毒感染传染性法氏囊病传染性支气管炎传染性贫血病毒性肝炎

129典型细胞病变，加入不足量干扰素后的细胞严重细胞病变，不加干扰素的细胞加入足量干扰素后的细胞

130与哺乳动物相比，鸭干扰素的研究起步较晚，直至1995年Schultz等才报道了鸭Ⅰ型IFN基因，1999年报道了IFN-γ基因。鸭干扰素-α开放阅读框架(ORF)有576个核苷酸，编码191个氨基酸，其中切除信号肽的成熟DuIFN-α由486个核苷酸组成，编码161个氨基酸。鸭干扰素-α

131由164个氨基酸组成，Ｎ端为含19个氨基酸的信号肽，成熟蛋白为145个氨基酸，分子量16.6kD，有3个糖基化位点，与哺乳动物相似。值得注意的是，尽管氨基酸序列与哺乳动物IFN-γ相比，只有21%-34%的同源性，但其三维结构却惊人的相似，且二者具有相似的生物学特性。鸭干扰素-γ

132谢谢!