细胞色素C

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细胞色素C小组成员：潘炯琛、吕武燕、汪晨蕴、臧月梅、蔡晨、郦元

1细胞色素C：包括多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素C是呼吸链中极重要的电子传递体。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。

2理化性质细胞色素C：分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，为碱性蛋白。等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。

3理化性质细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分失活。细胞色素C粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物, 在测定含量时, 要加入联二亚硫酸钠, 使混合物中的氧化型转变为还原型，还原型细胞色素C水溶液在波长520nm 处有最大吸收值。

4临床应用细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。如：一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。

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6单击此处添加标题匀浆提取液新鲜猪心氨水、PH6、过滤滤液氨水PH7.2过滤人造沸石水、NaCl、硫酸铵洗脱液硫酸铵盐析滤液TCA沉淀、离心沉淀物蒸馏水细胞色素C粗品溶液硫酸、PH4

7细胞色素C的制备和测定

8材料与试剂新鲜（冷冻）猪心样品（200g）1mol/LH2SO4：500mL1mol/LNH4OH：500mL12%BaCl2：250mL25%(NH4)2SO4：500mL0.2%NaCl：500mL20%三氯乙酸（TCA）：100mL人造沸石：白色颗粒，40-60目联二亚硫酸钠细胞色素C标准液（3mg/ml）

9仪器绞肉机，电磁搅拌器，离心机，分光光度计，烧杯（1000ml，500ml，200ml，50ml各若干），量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃棒，纱布，滤纸，容量瓶，试管，离心管

10步骤步骤1.猪心预处理与提取2.中和3.吸附与洗脱4.盐析5.TCA沉淀6.标准曲线的制备

111.猪心预处理与提取。1.新鲜或冷冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。2.称取猪心碎肉200克，加蒸馏水300毫升3.用电磁搅拌器搅拌提取，再用1mol/L的硫酸调PH=4.0，（需要不断调整）搅拌提取1.5小时。用1mol/L的氨水调PH=6.0，停止搅拌。4.四层纱布挤压过滤，收集滤液。

122.中和用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5，静置20~30分钟，使沉淀沉下。过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm,15min）。合并得到的红色清夜，测量体积。

133.吸附与洗脱吸附：加10％人造沸石—→磁力搅拌器搅拌吸附1h—→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→蒸馏水洗3次—→滤出人造沸石待用洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液

144.盐析为了进一步提纯细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，（即100ml洗脱液加17g硫酸铵）边加边搅拌，放置30分钟，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。

155.TCA沉淀按8%体积滴加TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。

166.标准曲线的制备以细胞色素C的浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度A520nm为纵坐标制作标准曲线，按表绘制细胞色素C含量的标准曲线

17纯度检测因为细胞色素C属蛋白质，所以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所的样品分子量大小以及纯度，从而评价所的样品的质量。 具体操作：预先配置聚丙烯酰胺凝胶，样品和标准品分别混合缓冲液点样，再点上标准屏，在恒定电压作用下，达到分离的目的。后用考马斯亮蓝染液对蛋白质进行染色，后同脱色液脱去多余染液，得到电泳图。

18Thankyou