微生物学硕士论文-应用重组钙离子敏感蛋白yc2[1].1研究裂殖酵母胞内钙离子浓度的分布

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1、南京师范大学硕士学位论文应用重组钙离子敏感蛋白YC2.1研究裂殖酵母胞内钙离子浓度的分布姓名：王少慧申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：袁生20060101＼盘塞监煎叁鬟蜒生錾堕延塞～；壹垂垩整绣矗王垫璺堑蠡翌旺．!堑篮鍪熊蘸鬟缒垂￡§彦芏婆蕉酋盈煎摘要YC2．1基因是1997年Tsien等人工构建的一个基困，它的表达器白⋯一YC2+I蛋白可以与钙离子进行可逆的结合反应，反应前后有荧光的变化。使用激光熬聚焦议嚣雏昭涌量活体细瓞囊钙离子的浓度和分毒。丽丑圣霹竣将Yc2．1基因和鬣位于不同细胞器的引导岸列融合进行细胞器内的定位表达，在最近几年里得到了迅速的推广应用。但是，用YC2．1蛋臼

2、来进行裂贿酵母细胞内钙离子分毒裁研究，鞫翦还设有文献报道。本文首先构建了含YC2．1基因的粟酒裂殖酵母表达质粒pESP．YC2．1。第一步，从p35S．YC2，1．Kan质粒上(适用于在植物绷胞中表达)把YC2．1基因切下，透过一端平末端，一翡帮牲来端的建国疆入将YC2。i基园导入捌pESP-3质较孛。该质粒含有启动子。起始密码子，YC2．1基因以及终止子序列。但是不合终止密码子。第二步使用OLIGO软件设计一个Linker，该Linker含有终止密码子，而且不论东淘插入还是菠f毒插入最终都会；

3、入终止密码子。通过鼙酶切粘链束端甭定向插入实验得到pESP．YC2．1质粮。将该质粒转化裂殖酵

4、母菌株sP-Q01，经过测序和荧光显微镜观察证实该质粒在胞质中可正常表达YC2．1蛋白。剩嗣YC2，l蛋螽研究和观察了裂殖酵母纲飘内钙离子的分奄倩况。激光共聚焦显微镜下可见，亵达的YC2．1蛋白指示的钙离子呈细胞周缘胞质较高浓度分布，商在细胞中部锊离子浓度相对低一些。与此相比较，用鬻规的钙离子荧先指示箭fluo．3染色的粟滔裂殖酵母维篷船稳内钙离子呈蠹部区域离靛钙离子荧光信号，而在周缘的胞质区相对较弱。众所周知，在裂殖酵母的细胞质内域充着大量的细胞器，如细胞棱，线粒体簿。用DAPI剥裂殖酵母的细胞核进行活体染色，发现缨穗梭确实占据了簏质的中闽区域，弱丽使得Yc2．1强自掰指示的缨隗胞质内的

5、钙离子主要熊中在细胞质的周缘区域，而不是整个细胞质全着色。因此Fluo．3荧光提示的裂殖酵母胞内钙离予的分布不能真实反映裂殪酵母胞内钙离子的分布，Fluo-3荧光绘掰豹是缀艟质和绸胞嚣游离钙离子浓度息的分书信息。利用YC2．1蛋白测定裂殖酵母胞内钙离子的方法优于以Fluo．3位代表的锻离子荧光探钟的方法，能够比较真实的反映细胞内游离钙离子的分韶情况。另外，本研究表嬲，当细瓿横隅出现对，在横隔附近显示的钙离子浓度较高。这提示钙离予可能目裂熵酵母细胞分裂有关，但是需要迸⋯步的实骑证明。蛊塞哑蒸占坐蠛±生焦堑窑重旦重塑登融E缝盛重鱼)里2：{l醚窿型壁嫠堡融杰!!盥王篷廑茧盘盔离子浓度坟商。这提

6、示钙离子可能与裂殖酵母细臌分裂有关，但是需要进一步的实验证弱。关键词：粟酒裂殖酵母，钙离子敏感蛰I刍YC2．1，细胞内游离钙离子，fluo-3壹直韪器盘堂璧圭堂壁鸷塞瘗照蘸塑篓矗王墼整爆鑫地』翌}基型壁鳇堡缒盎丛照王照塞煎垒生AbstractYC2，lgeneisaliartiflcalgenebyTsienetalin1997。It'Sexpressionproduct⋯一YC2．1proteincallcombine讯mcalciumreverselyandchmlgeits日uoresceoce．Itcanindicatecytoplasmcalciumdensityanddistr

7、ibutionusingeonfocalmicroscope．AswecarlfuseYC2．1genewithsignal—peptidesequence。theexpressionofYC2。lproteinCarlbeorientatedexactly．ThemethodusingYC2lproteintodetectcalciumisappliedrapidlyinrecentyears．ButthereisnoreportabouttheresearchusingYC2．1inSchizosaccharomycesporebe．Inthispaper，vceobservedthe

8、calciumdistributionGfcytoplasminSpombe。WetaketwostepstotransformtheYC2．1geneintotheS．pombe．Firststep，wemakeorientationinsertingbyonefiatendandonestickingendligation．AndwegetpESP-YC2．1’plasmid．T鞋sphsmidhaspromoter