霍乱弧菌的分离与鉴定

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霍乱弧菌的分离与鉴定1标本的收集病人粪便、呕吐物、肛拭子为必取标本。水样便或呕吐物采样量一般为1ml～3ml，成形便采取指甲大小的粪量；肛拭子可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm～5cm处旋转后取出，置增菌液或运送培养基送检。2标本的送检采得的标本应立即接种于培养基。不能立即接种的，应放入碱性蛋白胨水或文腊二氏保存液或插入Cary-Blair半固体保存培养基中送检。标本与保存液的比例约为1∶5。3分离培养3.1增菌后分离培养：所有标本均应接种碱性蛋白胨水培养基置37℃增菌6h～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于强、弱选择性培养基各一个置37℃培养18h-24h。必要时进行二次增菌培养。3.2直接分离培养：对急性期病人水样便标本在进行增菌培养的同时可取一接种环或用肛拭子直接接种在选择性培养基上置37℃培养18h-24h。3.3常用强选择性培养基包括庆大霉素琼脂、TCBS琼脂和四号琼脂等。弱选择性培养基一般使用碱性营养琼脂等。3.4不同分离培养基上生长的霍乱弧菌典型菌落特征不同，常见分离培养基的37℃18h～24h培养物的菌落特征如下：

13.4.1碱性营养琼脂：霍乱弧菌在碱性营养琼脂上生长的菌落呈现为无色、圆形、透明或半透明、表面光滑、润湿、扁平或稍凸起、边缘整齐，菌落直径一般约为2毫米。3.4.2庆大霉素琼脂和四号琼脂：菌落特征与碱性营养琼脂上生长的菌落相似，但透明性略差，多呈半透明状，由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深。3.4.3TCBS琼脂：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。4菌株鉴定4.1菌株初筛：包括玻片凝集实验、氧化酶试验。4.1.1玻片凝集实验从分离培养基上挑取疑似菌落接种于非选择性培养基进行纯培养（37℃18h～24h），取纯培养物与O1群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或O1群多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或诊断血清做玻片凝集试验进行O1群和O139群霍乱弧菌的初筛。玻片凝集试验使用的血清效价范围应为1∶32～1∶64。如玻片凝集试验在1分钟内出现肉眼可见的明显凝集块，但在生理盐水中不产生凝集的培养菌判为凝集阳性，应立即保存菌株做复核与分型鉴定；在1min内不出现凝集块者判为凝集阴性。生长在碱性营养琼脂、庆大霉素琼脂及四号琼脂上的疑似菌落如足够大，可直接挑取疑似菌落与O1群霍乱弧菌多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验进行初筛。但生长在TCBS培养基上的疑似菌落常因培养基中蔗糖的影响造成难于乳化，不能直接进行玻片凝集试验，应先以非选择性培养基纯培养后再作玻片凝集。

2要注意同一标本存在O1群和O139群等多个血清群霍乱弧菌混合的可能，每份标本至少挑选5个以上的疑似菌落逐一进行鉴定。4.1.2氧化酶试验试剂：1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液。试验方法：取生长在非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加上述试剂，如培养物在lmin～2min内出现粉红—紫红—紫蓝色，有的最后呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性；培养物不显色判为阴性。4.2菌株复核经初筛阳性或可疑阳性的菌株，在发出初步鉴定报告的同时，应尽快送当地疾病预防控制中心（CDC）进行复核鉴定。复核结果符合O1群或O139群霍乱弧菌的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将菌株上送省级或以上CDC（参比实验室）进行确认分析。菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：血清凝集试验与血清分型、革兰氏染色、粘丝试验、氧化酶试验、动力试验。对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应不典型的菌株应增做试管凝集试验。霍乱弧菌系统生化鉴定详见表1。表1部分弧菌科细菌的系统生化鉴定项霍乱弧拟态弧副溶血创伤弧溶藻弧河弧菌弗尼斯海鱼弧霍利斯麦氏弧辛辛那鲨鱼弧

3目菌菌弧菌菌菌弧菌菌弧菌菌提弧菌菌最适生长温度（℃）氧化酶粘丝试验硝酸盐还原靛基质V-P试验尿素酶L-赖氨酸L-鸟氨酸L-精氨酸葡萄糖产气乳糖麦芽糖D-甘露醇蔗糖L-阿拉伯糖纤维二糖37+++++/--++---/++++--37++++--++--+/-++---37++/-++--/+++---++-+-37++++--++/---+++/--/+-+37+++++/--++/----+++--37+++-----+--++++-/+37+++-----++-++++-/+25++/-+-+++/--+-/+-+----25,36++++/-----------+-37-+++/----/+-+/--+/-+++--25,35++/-+-+-+----+-+++37+++++/-+----++/-+/---水杨素---+------+-

4明胶素+++++++-----在不同盐量胨水中生长试验0%NaCl3%NaCl6%NaCl8%NaCl10%NaClO/129敏感性10μg150μg+++/---S①S①+++/---SS-+++-RS-++/---SS-++++/-RS-++/---RS-+++/--RS-++--SS-++/---RS-+++/--SS-++--RS-++--S①部分O139群霍乱弧菌为抗性（R）。