11 呋喃西林检测细则

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福建森宝食品集团股份有限公司企业标准Q/JCWI0211—2013动物源性食品中呋喃西林残留标示物残留检测酶联免疫吸附法2013-08-01发布2013-08-01实施福建森宝食品集团股份有限公司发布

1Q/JCWI0211—2013前言本标准按照GB/T1.1《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草本标准由公司检测中心提出并审核本标准起草单位：检测中心本标准起草人：罗凤娇本标准批准人：黄金兰本标准于2013年8月1日首次发布。1

2Q/JCWI0211—2013修改履历表章节修改人修改日期版本修改内容或记录号批准人实施日期条款（起草人）（发布日期）A/0全新发布罗凤娇黄金兰2013.8.12013.8.12

3Q/JCWI0211—2013动物源性食品中呋喃西林残留标示物残留检测酶联免疫吸附法1范围本标准规定了动物可食性组织中呋喃西林残留标示物残留量，酶联免疫检测方法的制样和检测方法。本标准适用于猪肌肉、鸡肌肉呋喃西林残留量的测定。2试验原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的SEM经衍生化后和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃西林代谢物衍生物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物SEM的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中呋喃西林代谢物的残留量。3交叉反应率呋喃西林代谢物………………………………………100%呋喃西林………………………………………………25%呋喃唑酮代谢物…………………………………小于0.1%呋喃它酮代谢物…………………………………小于0.1%呋喃妥因代谢物…………………………………小于0.1%呋喃唑酮……………………………………………小于1%呋喃它酮……………………………………………小于1%呋喃妥因……………………………………………小于1%4设备及试剂以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合GB/T6682规定的二级水。4.1设备——微孔板酶标仪450/630nm——旋转蒸发仪/氮气吹干装置——均质器——振荡器——涡旋仪——离心机——天平：感量0.01g3

4Q/JCWI0211—2013——刻度移液管：10ml——洗耳球——玻璃试管：10ml——容量瓶：100ml、1L——聚苯乙烯离心管：2ml、50ml——微量移液器：单道20～200l、100～1000l多道250l4.2试剂——甲醇（分析纯）——正己烷（或正庚烷）（分析纯）——三水合磷酸氢二钾（分析纯）——浓盐酸（分析纯）——氢氧化钠（分析纯）——去离子水5试剂盒提供的材料与试剂5.196孔酶标板×1块（包被有偶联抗原）5.2标准品×6瓶：（1ml/瓶）0ppb，0.05ppb，0.15ppb，0.45ppb，1.35ppb，4.05ppb5.3高浓度标准品：（1ml/瓶）100ppb5.4酶标二抗浓缩液1ml5.5抗体工作液7ml5.6底物液A液7ml5.7底物液B液7ml5.8终止液7ml5.920×浓缩洗涤液40ml5.102×浓缩复溶液50ml5.112-硝基苯甲醛15.1mg6溶液的配制配液1:衍生化试剂向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加入10ml甲醇溶解混匀（浓度为10mM）。配液2:0.1M磷酸氢二钾溶液称取22.8g三水合磷酸氢二钾加入1L去离子水溶解混匀。4

5Q/JCWI0211—2013配液3:1M盐酸溶液量取8.3ml浓盐酸加入去离子水中定容至100ml，混匀。配液4:1M氢氧化钠溶液称取4.0g氢氧化钠加入100ml去离子水溶解混匀配液5:复溶工作液用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶，复溶工作液在4℃（39.2℉）环境可保存一个月。配液6:洗涤工作液用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃（39.2℉）环境可保存一个月。7样本前处理步骤7.1样本处理前须知处理任何样本时，都必须注意：a)实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。b)实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。c)磷酸氢二钾溶液可于2-8℃（36-46℉）保存三个月。d)盐酸溶液可于室温（20-25℃/68-77℉）保存三个月。e)氢氧化钠溶液可于室温（20-25℃/68-77℉）保存三个月。f)处理好的样本可于2-8℃（36-46℉）避光环境中保存24小时。7.2样本前处理方法——用均质器均质样本；——称取1.0±0.05g均质后的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，分别加入4ml去离子水、0.5ml1M盐酸溶液（见配液3）和100l衍生化试剂（见配液1），用振荡器振荡2min，混匀；——在37℃（98.6℉）过夜孵育（大约16h）；——分别加入5ml0.1M磷酸氢二钾溶液（见配液2）、0.4ml1M氢氧化钠溶液（见配液4）和5ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s；——3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心10min；——取2.5ml乙酸乙酯相至10ml洁净干燥玻璃试管中，于50-60℃（122-140℉）水浴氮气流下吹干；——加入1ml正己烷（或正庚烷），用涡旋仪涡动30s，再加入1ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪涡动1min，混匀；——3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心10min；——除去上层有机相，取下层水相50µl用于分析。8检测步骤8.1测定前应须知：8.1.1使用之前将模具内底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液放实验桌回温至室温（20-25℃/68-77℉）(标准品、抗体、酶标二抗浓缩液和酶标板不需回温，可直接使用)。5

6Q/JCWI0211—20138.1.2使用之后立即将所有试剂放回2-8℃（36-46℉）。8.1.3在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。8.1.4在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。8.2操作步骤：8.2.1将所需试剂从冷藏环境中取出，按照上述方法进行回温，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。8.2.2取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋重新真空密封，保存于2-8℃（36-46℉）环境中。8.2.3编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。8.2.4抗体工作液与酶标二抗浓缩液混合：将抗体工作液与酶标二抗浓缩液按10：1体积比混合并混匀，在4℃（39.2℉）预先平衡30min（操作过程中应控制该步反应时间，即该步平衡30min开始加混合液）。8.2.5加标准品/样本和抗体工作液与酶标二抗浓缩液的混合液：加入标准品/样本50l到对应的微孔中，然后加入抗体工作液与酶标二抗浓缩液的混合液50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置4℃（39.2℉）避光环境中反应30min。8.2.6洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液（见配液6）250l/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。8.2.7显色：加入底物液A液50l/孔，再加入底物液B液50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃（77℉）避光环境中反应15min（见注意事项8）。8.2.8测定：加入终止液50l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。9结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含呋喃西林代谢物的含量成负相关。9.1用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.236，样本2的吸光度值为0.666，标准品吸光度值分别是：0ppb为1.949；0.05ppb为1.634；0.15ppb为1.139；0.45ppb为0.587；1.35ppb为0.357；4.05ppb为0.160。则样本1的浓度范围是1.35ppb-4.05ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中呋喃西林代谢物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.15ppb-0.45ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中呋喃西林代谢物残留的浓度范围。9.2定量分析9.2.1百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的平均吸光度值（双孔）除以第一个标准品（0标准）的平均吸光度值，再乘以100%，即6

7Q/JCWI0211—2013B百分吸光率（%）＝×100%B0B—标准品或样本溶液的平均吸光度值B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值9.2.2标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋喃西林代谢物标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋喃西林代谢物的实际浓度。样本稀释倍数动物组织样本稀释倍数:2倍10检测方法灵敏度、准确度、精密度10.1试剂盒灵敏度：0.05ppb样本最低检测限：动物组织…………………………………………………0.1ppb10.2准确度动物组织………………………………………………90%±20%10.3精密度试剂盒的板内、板间变异系数均小于10%。11注意事项11.1室温低于20℃（68℉）或试剂及样本的温度没有回到室温（20-25℃/68-77℉）会导致所有标准的OD值偏低。11.2在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。11.3每加一种试剂前需要将其摇匀。11.4反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。11.5不要使用超出有效期的试剂盒；也不要使用超出有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用超出有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。11.6储存条件保存试剂盒于2-8℃（36-46℉），不要冷冻，将不用的微孔板放回铝箔袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。11.7试剂变质的迹象7

8Q/JCWI0211—2013发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。11.8在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过25min。反之，则减短反应时间。11.9该试剂盒加入标准品、抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液后最佳反应温度为4℃（39.2℉），而加入底物后最佳反应温度为25℃（77℉），温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接影响检测结果。12贮藏条件及保存期贮藏条件：保存试剂盒于2-8℃(36-46℉)环境中。保存期：该产品有效期为12个月。_________________________________8