国家标准:gbt 27532-2011 犬瘟热诊断技术

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1、ICS11.220B41固雪中华人民共和国国家标准GB/T27532--20112011—11—21发布犬瘟热诊断技术Diagnostictechniquesforcaninedistemper2012—03—01实施宰瞀鹃鬻瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌GB/T27532--2011本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共

2、和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、袁小远、孙园园、马晶。标准分享网www.bzfxw.com免费下载犬瘟热诊断技术GB/T27532--20111范围本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT—PCR检测的操作方法。本标准适用于犬瘟热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR检测适用于犬瘟热的病原诊断。2试剂和材料2.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基:配方参见附录A。2.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。2

3、.3磷酸盐缓冲液(PBS):配制参见附录A。2.4青霉素、链霉素:配方参见附录A。2.5CDV阳性血清:中和抗体效价1;1024。2.6CDV阴性血清:无CDV感染的犬血清。2.7酶结合物:HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)。2.8底物溶液:配制参见附录A。2.9过氧化氢甲醇溶液:配制参见附录A。2.10盐酸酒精溶液:配制参见附录A。2.11胰蛋白酶溶液:配制参见附录A。2.12Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/uL,一20℃保存。2.13逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液:逆转录酶浓度为50U/iLL,--20℃保存。2.14RNA酶抑制

4、剂(40U/tLL):一20℃保存。2.15dNTP:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L,一20℃保存。2.16引物:浓度为20tzmol/L,其序列如下:上游引物(CDVF):5’CGAGTCTTTGAGATAGGGTT3’;下游引物(CDVR):5’CCTCCAAAGGGTTCCCATGA37。2.17随机引物:含有9个碱基的随机序列引物,浓度为50ttmol/L,一20℃保存。2.18DEPC水:自配(参见附录A),或购买商品化DEPC水。2.19Trizol试剂:4℃保存。2.20异丙醇:使用前预冷至一20℃。2.2175%乙醇:用

5、新开启的无水乙醇和DEPC水配制,使用前预冷至一20℃。2.221.5mL无RNA酶的Eppendorf管。2.230.2mL无RNA酶的PCR薄壁管。3器材和设备3.1细胞培养瓶(中号瓶)。3.2二氧化碳培养箱。3.3恒温水浴箱(5℃~100℃)。3.4普通光学显微镜。】标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T27532--20113.50.45“m微iL滤膜。3.6离心机。3.7PCR扩增仪。3.8水平电泳仪。3.940个小孔的室玻片。3.10冷冻切片机。3.11高速台式冷冻离心机:可控温至4℃、离心速度可达120009以上。3.12凝胶成像系统。

6、4I临床检查4.1I临床症状4.1.1病犬体温升高至40℃以上,鼻流清涕至脓性鼻汁,脓性眼屎,有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状。4.1.2腹下可见米粒大丘疹。4.1.3病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状,头、颈、四肢抽搐。4.2病理变化4.2.1新生幼犬感染CDV表现胸腺萎缩;成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。4.2.2表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。4.2.3中枢神经系统的病变包括脑膜充血,脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。4.2.4犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性,位于胞浆内,直径lpm~5p-m,可在黏膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶

7、质细胞和神经元中发现,核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。4.3判定若临床症状符合4.1.1或4.1.3且出现4.2.4的病理变化,则可判定疑似犬瘟热,其他临床症状和病理变化可作为参考指标;疑似病例可采用病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT—PCR检测等方法确诊。5病毒分离5.1样品采集和处理5.1.1活犬可采集泪液、鼻液、唾液、粪便,病死犬可采集肝、脾、肺等组织器官。5.1.2上述样品用无血清DMEM制成20%组织悬液,10000r/min离心20rain,取上清液,经0.45pm微孔滤膜过滤,滤液用于CDV分离。5.2操作方法5.2.

8、1细胞培养

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