NYT684-2003犬瘟热诊断技术.pdf

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1、ICS11.220841中华人民共和国农业行业标准NYJT684-2003犬瘟热诊断技术Diagnostictechniquesforcaninedistemper2003-07-30发布2003-10-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T684-2003月吐青本标准的附录A为规范性附录本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位:农业部兽医诊断中心本标准主要起草人:田克恭、王宏伟、遇秀玲、陈西钊、王传彬。NY/T684-2003犬瘟热诊断技术1范围本标准规定了犬瘟热(CD)的临床诊断、犬瘟热病

2、毒(CDV)的分离与鉴定、免疫酶试验和免疫酶组织化学方法等诊断技术本标准适用于犬瘟热的诊断2临床诊断要点2.1临床症状CD的临床表现多种多样，与CDV的毒力，环境条件，宿主的年龄、品种及免疫状态有关。病犬体温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状，腹下可见米粒大丘疹。病程长的犬足枕角质层增生。病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。2.2病理变化CDV为泛嗜性病毒，对上皮细胞有特殊的亲和力，因此病变分布非常广泛。新生幼犬感染CDV通常表现胸腺萎缩。成年犬

3、多表现结膜炎、弃炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。表现神经症状的犬通常可见鼻和脚垫的皮肤角化病。中枢神经系统的大体病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。CDV的包涵体通常呈嗜酸性，位于胞浆内，直径1t}m-5km，可在粘膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中发现。核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。3病毒分离与鉴定3.飞材料准备3.1.1试剂3.1.1.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基，配方见第A.1章。3.1.1.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。3.1

4、.1.3标准阳性血清:CDV单克隆抗体，中和抗体效价1，1024.3.1.1.4标准阴性血清:无CDV感染的犬血清。3.1.1.5新生牛血清处理:用无血清DMEM洗涤细胞两次，加人培养液二分之一量的新生牛血清37℃吸附1h。吸附后的新生牛血清分装，置一20℃备用3.1.1.6青霉素、链霉素。3.1.2器材a)细胞培养瓶;卜)吸管;c)二氧化碳培养箱;d)370C恒温水浴箱;e)普通冰箱及低温冰箱;f)离心机及离心管;9)研磨器械;h)普通光学显微镜;NY/T684-2003i)微量加样器，容量51,1^-

5、501,1,501,L-V2001,l;j)0.451,m微孔滤膜。3.1.3样品CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清DMEM制成20%组织悬液，3OOOr/min离心30min，取上清。10000r/min离心20min，取上清用于CDV分离。3.2操作方法3.2.1细胞培养用含8%已处理的新生牛血清的DMEM培养基，在37℃培养Ver。细胞。每3d-4d传代一次，细胞长成单层时，用于CDV分离3.2.2病料接种将。.1m工处理好的组织悬液接种Ver。细胞

6、，33℃吸附1h，加人无血清DMEM继续培养5d-7d，观察结果3.2.3结果观察CDV感染Vero细胞4d-5d表现为细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形成巨细胞和合胞体，并在胞浆中出现包涵体。若第一次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变，则判为CDV检测阴性。3.2.4CDV的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物，按第4章的方法制备细胞涂片，用CDV单克隆抗体进行鉴定。4免疫1N试验4.1材料准备4.1.1试荆4.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.2章。4.1.

7、1.2杭原涂片的制备:将CDV接种Vero细胞，接种后5d^-7d，病变达50环-75%时，用胰蛋白酶消化分散感染细胞，PBS洗涤三次后，稀释至1X10`个细胞/mL。取印有10个~40个小孔的室玻片，每孔滴加10JA。室温自然干燥后，冷丙酮(40C)固定10min.密封包装，2-20℃备用。4.1.1.3标准阳性血清:CDV单克隆抗体，中和抗体效价1:1024,4.1.1.4标准阴性血清无CDV感染的犬血清。4.1.1.5酶结合物:HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA).4.1.1.6底物溶液:配制见第A

8、.3章。4.1.2器材a)普通光学显微镜;b)印有10个~4。个小孔的室玻片;c)微量加样器，容量5川~50pL;d)37℃恒温培养箱或水浴箱。4.1.3样品采集被检犬血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS作10倍稀释。4.2操作方法4.2.1取出抗原涂片，室温干燥后，滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清，每份血清加