行业标准：GBT 27532-2011 犬瘟热诊断技术.pdf

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1、ICS11．220B41固雪中华人民共和国国家标准GB／T27532--2011犬瘟热诊断技术Diagnostictechniquesforcaninedistemper2011—11—21发布2012—03—01实施宰瞀鹃鬻瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19刖昌GB／T27532--2011本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入

2、境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、袁小远、孙园园、马晶。犬瘟热诊断技术GB／T27532--20111范围本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT—PCR检测的操作方法。本标准适用于犬瘟热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR检测适用于犬瘟热的病原诊断。2试剂和材料2．1改良最低要素营养液(DMEM)培养基：配方参见

3、附录A。2．2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。2．3磷酸盐缓冲液(PBS)：配制参见附录A。2．4青霉素、链霉素：配方参见附录A。2．5CDV阳性血清：中和抗体效价1；1024。2．6CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清。2．7酶结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)。2．8底物溶液：配制参见附录A。2．9过氧化氢甲醇溶液：配制参见附录A。2．10盐酸酒精溶液：配制参见附录A。2．11胰蛋白酶溶液：配制参见附录A。2．12Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U／uL，一20℃

4、保存。2．13逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U／iLL，--20℃保存。2．14RNA酶抑制剂(40U／tLL)：一20℃保存。2．15dNTP：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol／L，一20℃保存。2．16引物：浓度为20tzmol／L，其序列如下：上游引物(CDVF)：5’CGAGTCTTTGAGATAGGGTT3’；下游引物(CDVR)：5’CCTCCAAAGGGTTCCCATGA37。2．17随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50ttm

5、ol／L，一20℃保存。2．18DEPC水：自配(参见附录A)，或购买商品化DEPC水。2．19Trizol试剂：4℃保存。2．20异丙醇：使用前预冷至一20℃。2．2175％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。2．221．5mL无RNA酶的Eppendorf管。2．230．2mL无RNA酶的PCR薄壁管。3器材和设备3．1细胞培养瓶(中号瓶)。3．2二氧化碳培养箱。3．3恒温水浴箱(5℃～100℃)。3．4普通光学显微镜。】GB／T27532--20113．50．45

6、“m微iL滤膜。3．6离心机。3．7PCR扩增仪。3．8水平电泳仪。3．940个小孔的室玻片。3．10冷冻切片机。3．11高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达120009以上。3．12凝胶成像系统。4I临床检查4．1I临床症状4．1．1病犬体温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状。4．1．2腹下可见米粒大丘疹。4．1．3病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。4．2病理变化4．2．1新生幼犬感染CDV表现胸腺萎缩；成年犬多表现结膜炎、

7、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。4．2．2表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。4．2．3中枢神经系统的病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。4．2．4犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性，位于胞浆内，直径lpm～5p-m，可在黏膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中发现，核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。4．3判定若临床症状符合4．1．1或4．1．3且出现4．2．4的病理变化，则可判定疑似犬瘟热，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用病毒

8、分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT—PCR检测等方法确诊。5病毒分离5．1样品采集和处理5．1．1活犬可采集泪液、鼻液、唾液、粪便，病死犬可采集肝、脾、肺等组织器官。5．1．2上述样品用无血清DMEM制成20％组织悬液，10000r／min离心20rain，取上清液，经0．45pm微孔滤膜过滤，滤液用于CDV分离。5．2操作方法5．2．1细胞培养用含8％新生牛血清的DMEM培养基在细胞培养瓶(中号瓶)培养Vero细胞，置37℃二氧化碳培养箱，单层细胞长至80％～90％时，接种