贴壁细胞的免疫荧光染色方法

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1、贴壁细胞的免疫荧光染色方法Materials:1.PBSsolution2.4%Paraformaldehyde(PFAfixative):Dissolve4gparaformaldehydein100mlPBSsolution,stirat70℃todissolve;3.PBS-Tsolution:(0.1%TritonX-100inPBSsolution)4.PBS-Bblockingsolution:(4%BSAinPBSsolution)5.Primaryantibody:DilutewithPBS-Bsolu

2、tion,dilutionfactorsshouldrefertomanual,or,testfrom1:50~200,shouldbemoreconcentratethanapplicationinWesternblot;6.Secondaryantibody:DilutewithPBS-Bsolution,dilutionfactorsshouldrefertomanualProcedure:1.Culturedcells,letitattachtothecoverslipsin6-wellplate;2.Remo

3、vemedium,rinsewithPBStwice;3.Add2ml4%paraformaldehyde,incubateatroomtemperaturefor20minutes;4.Rinsewith2mlPBSthreetimes,rinsefor5minuteseverytime;5.Permeabilizecellswith2mlPBS-Tsolutionat4?Cfor10minutes;6.RemovePBS-Tsolution,rinsecellswithPBSfor5minutesatroomtem

4、perature;7.Blocknon-specificinteractionwithPBS-Bsolutionat37?Cfor30minutes;8.Addprimaryantibodysolution,incubateat4?Covernight;9.Removeprimaryantibodysolution,washwithPBSfor5minutes;10.Addsecondaryantibodysolution,incubateatroomtemperaturefor1hour;11.WashwithPBS

5、threetimes,5minuteseach;12.Addanti-fadeDAPIsolutionifneeded;13.Observation.细胞免疫荧光步骤1.细胞爬片；2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5%Triton穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于

6、37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/mlDAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂:2.5%DABCO(w/v)50mMTris(pH8.0)90%甘油作为荧光显微镜使用：（1）先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。（2）等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。（3）关闭显微镜光源，打开荧光通道。（4）需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。作为荧光显微镜使用：（1）先关闭荧光通道，再打开荧光激发器

7、电源，等待15分钟。（2）等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。（3）关闭显微镜光源，打开荧光通道。（4）需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5%Triton穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗

8、，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/mlDAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5%DABCO(w/v)抗淬灭封片剂50mMTris(pH8.0)90%甘油0.25gDABCO9ml甘油0.5ml1MTris(Ph8.0)70℃溶解，-20℃保存0.5mlddH2O2005-07-2520:25免疫荧光第一步的步