免疫共沉淀

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1、免疫沉淀（IP）推荐IPbuffer裂解细胞，加入适量IPbuffer（含蛋白酶抑制剂cocktail）吹打悬浮细胞，置于冰上裂解30min。配上超声裂解效果更佳。如果是CO-IP实验，建议慎用RIPA裂解液，尤其是RIPA（强）裂解液。裂解充分后，离心收取上清。离心条件为：4℃、12000g、10-20min。加入适量的IP抗体，推荐条件：500ul细胞裂解液上清加2-6ug抗体。4℃、旋转孵育、2-4h或室温、旋转孵育、2h。注：IP抗体要求抗体本身特异性、亲和性较高，特异性高减少后期非特异性

2、结合。取适量磁珠加入已经孵育完抗体的细胞裂解液上清中，一般推荐量（25-50ulproteinA/Gbeads）翎因4℃、旋转孵育、2-4h或室温、旋转孵育、2h。孵育结束后将EP管置于磁力架上静置10s，待磁珠贴附关闭后弃上清，加入新的预冷IPbuffer1ml或者预冷PBS1ml。4℃、旋转孵育10min。重复上一步。洗三次左右。弃上清，加入适量loadingbuffer，100℃、10min，即可进行后续的WB实验。注：如无磁力架，推荐低速离心：4℃、1000rpm、5min。or：

3、也可以先进行抗体与磁珠的孵育，再加入细胞裂解液上清or或者同时将磁珠、抗体与细胞裂解液上清4℃、旋转孵育、6h或室温、旋转孵育、4h注：第三种相对省去一些步骤、但是效果未必最佳。WB检测IP:Anti-FlagMagneticbeads