生物实验免疫共沉淀

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1、完成《WB实战桁南》后，朋友曾央分享点免疫井沉淀方而的咚咚；当时不得不回绝。因为，wb指南是基于这些年的

2、叫复的汇总，基木上力jy血血的问题都存提及，以需要做些串联；而论及COIP,目前在国内还不太普及，尽管它已经是牛.化领域最基本的技术之一。因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今大是个特殊的日子，凑凑热闹吧。——人，如果在某些方而成功了，必然在兒外一面柯亏欠，也许这就是上帝的公允吧。——在£1己最擅长的地方找点成功的感觉吧，当然我的失败也只足因为没奋史多的吋间。。。哎！扯远了玩COIP也玩了5年多了，因为上手就是最难的B蛋D结合量多少的变化（假

3、定IPA蛋111）而非检测B饭0的奋无，说句吹牛皮的话，在我们这个小领域三家最强的lab唯奋我们敢于通篇基于这种检测T•段，所以，对于colP算是非常得存心得了。以K论述基于最难的巳缶白结合水平变化的检测，所以部分实验操作非常苛求；学会这个，K他就是小菜了：所以，这也算一个进阶篇。一.样品的制备。如《wb指南》，在这里我最强调从制备样品幵始的•致性。如果不触及细胞的凋亡或死r:,那么任何处理组样品和Ctrl最后的终体积应该保持••致；如果细胞有人M凋亡或死亡，可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定S后冉加裂解液，一般可以把误差控制在WB的检出范ffl以下，基木保•持样品的

4、均•一；组织样品可以通过称重添加相成体积比的裂解液。裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的，原配A如K:20mMTris/HCI,pH7.6,100mMNaCI,20mMKCI,1.5mMMgCI2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors（0.5MPMSF）此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的colP分析。“不过”用它做colP冇明显的缺陷；耍理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在colP实验中“作伪”。伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者，从技巧上来讲，如果要想获得设定、预想的相互作用结果，可以从几个角度着手——此类结果可重笈。a.在

5、低盐离子裂解液屮进行IP。很多蛋GS合体对盐浓度敏感，似敏感性有强弱之别。通常來说，真实存在着的缶0复合体能耐受生理盐（0.15M）或史高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。M•体如，某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以I*.的高盐ifu不解体，即使其抑制蛋闩CKI能耐受0.6M以I:尚盐。因此，了解一个缶G复合体对盐浓度的耐受，既足一个帮助判断缶0复合体楚否真实存在的一个重要依拋，更是一个非常秉要的生化数裾；对某些体外生化反成的缶门原料的纯化制备也足很重要的辅助依裾。例如，纯化冇生物活性的CDK和Cyclin，如果采用盐浓度漂洗，赃最低需0.6M以上以

6、解离CKI。所以，在生化领域的colP分析中，很多实验体系的盐浓度是比牛.理盐浓度更高的。当然，不排除菜些弱相力:作川需要牛理盐浓度，似这种情况不多见；也各易跟瞬吋的相作川混裕，某些实验屮的弱相4:作川实际是巾丁•生化反应的瞬时性，且缺乏有效的截留、富集手段，诸如酶和底物。很多非生化领域的，离欢在生理盐或更低盐浓度下进行colP,这人人增加/假阳性的儿率——很多蛋白问非特异性的黏粘被Id录下来。这也成为了获得“设定的”相互作用的有效手段。b.过表达。现4:已经存世的相h多的实验论文和数据，其蛋白艾合体相互作用的数据是通过过表达，其至原核GSTpulldown获得的；笔者认

7、为，在阅读这类文献时，人家要特别小心，多长一个心眼_即始终抱怀疑的态度。并非说一走不可取，但是冇一点很明确，这样的数据送到我们手里，首先我们会要求对方补充内源性蛋白相互作用的证据，否则该结果•律不采信。在《WB指闹》里血我提过，血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别（其实也是一种相互作川），那么同理尚丰度的两种或多种缶白人为拼凑到-起，为什么不川'以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用呢？W此，如果想要“特定”的相互作用，可以考虑过表达所存的蛋A，就是核蛋A结合胞浆蛋A甚至膜表面受体也不稀奇。a.不添加NP40—类表而活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗。NP40除可以在脱上穿孔

8、外，也可以科效的拮抗非特异性的蛋门相互作用，提高colP的特异性。因此，减少或不添加NP40也可以辅助“预期”0的。实阮上，掌握a、b两点技巧，ffi本上可以“尤往而不胜”_彻底搞定一•切“想要的”相互作用。基于以I•.的原因，如果想获得切实讨靠的相丸作川数据，那么裂解液的选取相3讲究。1.首先盐浓度至少0.15M或以上。盐浓度主要指Na盐浓度。冇人会问为什么不足钾盐？因为钾盐会更容易跟某些试剂（或离f）形成沉淀，诸如SDS,因此在某些情况下，钾盐会对肜续的某些实验带来米知的麻烦，所以一般盐浓度指Na盐。盐浓度过低对某些句染色