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1、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）背景据估计，人体中大约总共可产生500,000种蛋白，而单个细胞可以产生10,000种。在这些蛋白中，80%不是以独立的方式存在的，而是存在于一个蛋白复合体中。蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中，我们形象地称之为通过节点（nodes）连接的枢纽（hubs）。蛋白的相互作用StandardTechniquesGlutathione-S-TransferaseFusionProteinsAffinityTagsTandemAffinityPu
2、rification(TAP)TagsStrep-TagIIIQuantitativeProteomicsChemicalCrosslinkingTwo-hybridYeastPhage-displayUniversalVerificationofInteractionTechniquesCo-ImmunoprecipitationConfocalMicroscopyBiophysicalVerificationofInteractionTechniquesFluorescenceResonanceE
3、nergyTransfer(FRET)GFP-ProteinProximityImagingMicroscopy(GFP-PRIM)MassSpectroscopy(MS)AtomicForceMicroscopy(AFM)SurfacePlasmonResonance(SPR)实验目的学习并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法，了解免疫共沉淀结果分析。了解与免疫共沉淀相关的实验及进展免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用
4、的有效方法。金标准用途：测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。概念及用途bindingwashelutionYYYYY当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。实验原理人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿，培养大约90%以上融合后，倒掉培养液，PBS洗3次；加入1mlLysisBuffer（20mMTris,150mMNaCl,1mME
5、DTA,1mMEGTA,1%TritonX-100,1mMβ-Glycerolphosphate,1mMNa3VO4,Cocktailproteinase，pH7.5），冰上放置30min，裂解细胞；实验步骤采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)。为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。Na3VO4作用为保护磷酸
6、化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min，14000g4℃离心15min；吸取上清液到新EP管中，每管加1μg对照兔IgG，同时加入ProteinAagarose，4℃转鼓转30min，4℃10000g离心5min；preclear及其作用一抗和相应来源的normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG中有相同或相似的成分(如无关IgG),用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和proteinA－agarose可以去除一抗中无关
7、IgG对蛋白裂解液中物质的非特异吸附,二是可以去除蛋白液中与proteinA－agarose非特异结合的物质。做preclear的IgG是不针对特异性抗原的。琼脂糖珠的选择SEPHAROSE是注册商品名,本身是agarose做的凝胶。转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000(250-1000)μg，用lysisBuffer将体积补齐至600-800μl。加入AKT兔抗人多克隆抗体10μl，4℃转鼓过夜(10min)；孵育液体积的控制：考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多
8、则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。加入35μlProteinAagarose，4℃转鼓转2h(10min)；1000g4℃离心5min，PBS洗3次，加入40μl2×SDSSampleBuffer（125mMTris•ClpH6.8,4%SDS,20%Glycerol,100mMDTT,0.02%溴酚蓝）沸水浴中煮沸5min；WesternBlot检测样品，剩余样品-20℃保存。抗体的选择：1.使用明确的
