免疫共沉淀实验方案.doc

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1、免疫共沉淀实验方案一、实验试剂和材料Dynabeads®ProteinG(novexbylifetechnologies)PBSpH7.4(含0.01%Tween-20)0.1MNa-phosphate(WashingBuffer)50mMGlycinepH2.8(ElutionBuffer)二、实验步骤(%1)准备磁珠1.将瓶子倾斜旋转5min左右，使瓶中磁珠悬浮；2.吸取50ul磁珠液于离心管中；3.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；4.从磁铁架上取下离心管；(%1)结合抗体1.加入200ul用PBS(含0.

2、01%Tween-20)稀释的抗体；2.室温旋转孵育lOmin;3.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；4.从磁铁架上取下离心管，用200ulPBS(含0.01%Tween-20)$AA和吹吸并重悬磁珠■抗体复合体；(%1)免疫沉淀抗原1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；2.从磁铁架上取下离心管，加入抗原样品并温和吹吸，重悬磁珠■抗体复合物；3.室温旋转孵育lOmin,使抗原结合到磁珠■抗体复合物上；1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清;2.用washingbuffer3次洗涤磁珠■抗

3、体■抗原复合物，弃上清;3.用lOOulwashingbuffer重悬磁珠■抗体■抗原复合物，并将磁珠悬浮液转移到干净的离心管中，以避免蛋白抗原粘附在管壁上。（四）洗脱抗原1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；2.加入200ulElutionBuffer至离心管中，温和吹吸并重悬磁珠■抗体■抗原复合物；（不要吹打出气泡）3•室温旋转孵育2min；4.将离心管置于磁铁架上，并将洗脱液（含有洗脱的抗原、抗体）转移到T净的离心管中，用于后续的SDS-PAGE蛋片凝胶电泳分析。