tunel细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤

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1、TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤--------------------------------------------------------------------------------　凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL法）细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是；细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。大量DNA片段暴露出的3羟基在末断转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)或DNA多聚酶的作用下，与生物素或地高辛标记的核苷酸结合，最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合

2、的荧光素或HRP，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。TUNEL细胞凋亡试剂盒由美国罗氏公司提供试剂1：酶浓缩溶液（EnzymeSolution）试剂2：标记溶液（LableSolution）试剂3：转化剂-POD（Converter-POD）酶标记抗荧光素抗体（即用型）试验所需其它试剂：非石蜡切片:·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液（PBS）·阻断溶液:0.3%H2O2甲醇溶液·固定溶液:4%多聚甲醛（溶剂pH7.4新鲜配制的PBS溶液）·渗透液:0.1%Triton甔-100（溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液）TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚

3、)名：曲拉通X-100，乳化剂OP分子式：C34H62O11石蜡切片:·二甲苯和乙醇（100%、95%、90%、80%、70%用蒸馏水稀释）·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液（PBS）·蛋白酶K工作液10~20mg/ml溶于10mMTris/HCl（pH7.4~7.8）根据需要选择:·渗透液:0.1%TritonX-100（溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液）·胃酶溶液（0.25%-0.5%溶于HCl，pH2）或胰酶·0.1M枸橼酸缓冲液，pH6，微波修复材料：微波炉，微波输出功率850W-2000W2.选用中性甲醇固定的活检及实验动物标本，常规脱水，二甲苯

4、透明，石蜡包埋。操作步骤抗原微波修复（供参考）1.组织经福尔马林固定后会产生广泛的蛋白质交连，因此石蜡组织进行凋亡检测时要进行预处理。经我公司科研人员的长期研究认为：TUNEL染色时蛋白酶K的作用有可能引起内源性核酸内切酶的释放，造成假阳性反应，同时过量的蛋白酶K处理可破坏组织的结构，用微波技术替代上述处理可避免上述弊端的出现。2.微波已被愈来愈多地作为免疫组织化学和原位杂交的预处理过程，经一定温度的微波处理可修复因固定和包埋造成的抗原破坏，打断氨基酸的肽键结合，促进抗原决定簇的暴露，恢复细胞膜的空间结构，增加穿透效应，加速组织处理及染色过程。我们在

5、作TUNEL染色前进行微波修复，可以达到蛋白酶K的功效，取得较为理想的效果，背景染色很浅，凋亡细胞阳性颗粒与背景染色对比非常鲜明。3.蛋白酶K作用的条件严格，消化度常因组织的不同而在操作中不便掌握。同时蛋白酶K的价格昂贵，而微波已作为一种常用仪器用于免疫组织化学染色中。(1)切片常规脱蜡入水(2)将一烧杯盛200ml的0.01M、pH6.0的柠檬酸缓冲液，加热至90～95℃，迅速放入切片，使用680W(80%功率)、微波照射1min，加入双蒸水(20～25℃)80ml作迅速冷却，将玻片移至PBS(20～25℃)。(3)PBS洗5min×3次。(4)加

6、20%正常牛血清室温30min。(5)将TUNEL反应混合液加在切片上，37℃温育90min(阴性对照片、TUNEL混合液中不加TDT)。(6)PBS洗5min×3次。(7)3%H2O2甲醇液室温阻断10min。(8)37℃温育90min。(9)加POD转化剂，37℃温育30min。(10)PBS洗5min×3次。(11)DAB/H2O2显色。(12)苏木素淡染，常规脱水，透明，中性树胶封固。结果：细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞，结合形态特征，可确立凋亡细胞。阴性对照片无棕色颗粒。细胞凋亡的检测技术简介（供参考）一.凋亡细胞的形态学改变细胞表面：伪足,

7、微绒毛等消失细胞体形态：细胞皱缩，变形，体积变小细胞核：染色质浓缩，早期染色质聚集于核膜边呈新月形或环形，晚期碎裂细胞器：密集但形态及结构完整，早期内质网短暂扩张细胞膜:完好，晚期包裹细胞器或核碎片，形成凋亡小体在组织中表现：常常以单个细胞散在发生周围组织反应：凋亡细胞或小体被邻近巨噬细胞，上皮细胞吞噬，降解，不发生炎症反应发生条件：属于基因控制的程序性细胞死亡，多发生于器官萎缩，细胞介导的免疫杀伤机制，小剂量毒素作用以及多种病理生理状态二.细胞凋亡的形态学检测方法(一)凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测1.制片(1)常规组织学切片，进行脱蜡和水化。(2

8、)培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎,所以应采用低速离心制片(250g,离心5min)