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《cell signaling technology(cst)常见问题回答》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、CellSignalingTechnology（CST）常见问题回答（FAQ）1.问:如何储存CST的抗体?答:请将抗体的原始管储存到-20°C,不要分装。因为抗体储存在含有50%甘油的缓冲液中,所以抗体在-20°C仍为液体状态,不会因为反复冻融而降解。具体储存温度请参考产品说明书。2.问:如何储存SDS裂解的磷酸化蛋白样本?答:如果短期内使用(少于3个月),SDS样本细胞裂解液可以储存在-20°C,如果长期储存,应保存于-80°C。活化的蛋白样本的降解变化很大,其降解率取决于每种蛋白的性质和样本里究竟含有多少活化的蛋白。3.
2、问:能用室温孵育抗体1小时代替4°C过夜吗?答:不建议。CST公司活化状态的特异性抗体用于区分一或两个翻译后修饰的氨基酸残基。这些修饰包括磷酸化,乙酰化和酶切割。与识别总蛋白的抗体相比,大多数针对这些修饰位点的抗体具有较低的亲和性。因此,通过4°C孵育过夜延长抗原和抗体的反应时间以获得最好的信噪比是非常关键的。4.问:当我准备细胞裂解液样品时,需使用什么缓冲液?答:请检查每个产品说明书中包含的Westernblot操作步骤中推荐的缓冲液。CST提供以下缓冲液(见下表),或者,如果你想自己配制,CST网站上列出了特别的缓冲液组分
3、。CHAPS缓冲液专为获得细胞质的提取物而设计,适应于Caspase的检测,但并非关键。 5.问:CST的抗体是否适用于全组织样本裂解物?答:CST并未测试所有抗体是否适用于全组织样本裂解物,但是CST的很多抗体已经被其他客户用于整个组织而且取得成功。6.问:如何为磷酸化目标蛋白准备阳性细胞裂解液对照?答:请参考CST网站上该产品的Westernblot图,使用图述的细胞系和药物处理,能够得到阳性对照蛋白。也可参见:www.cellsignal.com/support/controls.html查阅。7.问:假如说明书上某个种
4、属未被列出与CST抗体有交叉反应,是否意味着这个种属未被检测过呢?答:如果可能的话,CST科学家检测所有CST抗体在人、小鼠和大鼠的交叉反应性。假如我们没有获得某个种属的阳性结果,我们就不会列出这个种属。然而,有可能我们检测的这个细胞系包含一个低水平的特定蛋白,或者,我们使用的操作对于那个特定的细胞系不起作用。因此,我们建议你比较所研究种属和CST抗体验证种属修饰位点附近的肽段序列(每边5个氨基酸)。在很多情况下,CST抗体由免疫人的蛋白序列产生,并通过亲和层析高度纯化。很多时候,如果序列相同,或者在非磷酸化位点只有1或者2个
5、氨基酸的不同时,CST抗体很有可能识别你的蛋白。8.问:使用CST抗体时,为什么我不能使用我自己实验室的Westernblot操作流程?答:CST抗体经过优化以提供最强的信号,最少的背景,使用CST推荐的Westernblot操作流程,对于终端客户的优点是节约时间和材料。9.问:为什么这个抗体用于Westernblot效果不佳?答:这里有几个关于CSTWesternblot流程的细节,对于避免丢失信号或高背景是非常关键的。•不要过度清洗膜。应在TBS/0.1%Tween-20中清洗三次,每次5分钟。过度的清洗会洗掉一抗。推荐的
6、清洗条件已经过优化以获得最好的信噪比,因此是最强、最干净的结果。•不要过度封闭(例如超过1小时或者过夜)。在一些抗体中发现,过度封闭会减少特异信号。确保查阅每个产品的说明书以得到每个抗体推荐的封闭时间。•一般来说,针对兔多抗或兔单抗,使用抗兔二抗:#7074;针对鼠单抗,使用抗鼠二抗:#7076。但是,请依然检查www.cellsignal.com上的产品说明书。•确认抗体的说明书上交叉反应部分有列出你所检测的种属。•确认你的上样量达到20μg细胞裂解液。•确认诱导的细胞裂解液样本蛋白已活化。10.问:如何确保Westernb
7、lot结果的可重复性?答:至于为什么看起来较难重复Westernblot结果,这里有几种可能性。要发现这种情况的原因,可考虑以下:•你是如何储存抗体的?请参考问题1,2。•抗体稀释后不能重复使用。许多抗体有一个非常低的工作浓度,很可能这个浓度随着连续的Westernblot会减少。•你确定你的样本中包含活化的蛋白?细胞裂解液样品制备活化蛋白会由于细胞数量,药物诱导时间,细胞传代数量和储存条件不同而改变。•CST产品在其保质期内都有最佳表现。请访问www.cellsignal.com/support/shelflife.html
8、产品保质期页面获得列表。请注意:不能分装抗体。11.问:如何使用固相抗体来做免疫沉淀?答:要得到最佳的结果,获得均匀的微珠悬浮液是重要的。以下步骤可确保同质:•将包含微珠悬浮液的管子放入冰桶10分钟。•倒置管子几次以获得50%微珠-缓冲液悬浮液。•假如可能,温和漩涡管子。•为
