内窥式切伦科夫荧光成像系统对肝肿瘤的在体评估

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工学硕士学位论文内窥式切伦科夫荧光成像系统对肝肿瘤的在体评估包成鹏哈尔滨理工大学2016年3月 国内图书分类号：TP391工学硕士学位论文内窥式切伦科夫荧光成像系统对肝肿瘤的在体评估硕士研究生：包成鹏导师：刘侠申请学位级别：工学硕士学科、专业：检测技术与自动化装置所在单位：自动化学院答辩日期：2016年3月授予学位单位：哈尔滨理工大学 ClassifiedIndex：TP391DissertationfortheMasterDegreeinEngineeringEvaluationofdetectionofHCCinvivousingtheendoscopicCerenkovluminescenceimagingsystemCandidate:BaochengpengSupervisor:LiuXiaAcademicDegreeAppliedfor:MasterofEngineeringSpecialty:DetectionTechnologyandAutomaticEquipmentDateofOralExamination:March,2016University:HarbinUniversityofScienceandTechnology 哈尔滨理工大学硕古学位论文原创性声明本人郑重声明：此处所提交的硕±学位论文《内窥式切伦科夫巧光成像系统对肝肿瘤的在体评估》，是本人在导师指导下，在哈尔滨理工大学攻读硕古学。位期间独立进行硏究工作所取得的成果据本人所知，论文中除已注明部分外不包含他人已发表或撰写过的研究成果。对本文研究工作做出贡献的个人和集体，均在文中Ｗ明确方式注明。本声明的法律结果将由本入承担。作者签名：曰期；如／年月训如／Ｊ巧暢哈尔滨理工大学硕±学位论文使用授权书《内窥式切伦科夫焚光成像系统对肝肿瘤的在体评估》系本人在哈尔滨理工大学攻读硕壬学位期间在导师指导下完成的硕古学位论文。本论文的研巧成果归哈尔滨理工大学所有，本论文的研究内容不得Ｗ其它单位的名义发表。本人、完全了解哈尔滨理工大学关于保存使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部口提交论文和电子版本，允许论文被查阅和借威。本人授权哈尔滨理工大学可采用影印、缩印或其他复制手段保存论文，可公布论文的全部或部分巧容。本学位论文属于保密□，在年解密后适用授权书。不保密ｄ。请在上相应方框内打Ｖ（）也擊７＾作者签名；Ｋ日期；年＾月＞日Ｉ导师签名；曰萌＾／《年声月０曰ｉ；灵 内窥式切伦科夫荧光成像系统对肝肿瘤的在体评估摘要近年来，切伦科夫荧光成像，即CerenkovLuminescenceImaging(CLI)，在分子成像领域中迅速崛起，吸引了大量关注。这种成像模式的机理是，放射性核素在衰变的过程中，产生的高速带电粒子在非真空的透明介质中以超光速的速度穿行时会产生一种以蓝紫光为主的可见光，通过光学设备捕捉可见光光子完成显像。相对于核医学领域比较先进的临床检查影像技术——正电子发射计算机断层显像（Positronemittingcomputedtomography,PET），切伦科夫荧光成像同时具备高分辨率、无毒核素等优势的同时，还大大降低了成本。目前切伦科夫荧光成像在肿瘤检测、药物疗效评估、基础研究等生物医学领域开展了大量的研究。然而，切伦科夫荧光成像也有其自身的缺陷，切伦科夫荧光的光强较弱，并且其在生物体中传播时容易产生散射，组织穿透性较弱，这些因素使得其对深层组织成像产生了阻碍，从而限制了切伦科夫荧光成像广泛地应用于临床诊断、治疗中。针对此问题，本文设计了一套内窥式切伦科夫荧光成像系统，其采用内窥技术与光学成像结合的原理从空间上减少切伦科夫光子的损失，提高成像的分辨率。内窥式切伦科夫荧光成像系统的搭建主要包括两部分：系统硬件的设计与软件相关工作。系统硬件主要包括成像模块、系统降温模块、辅助平台模块以及控制模块。通过模块之间的协同运作，完成切伦科夫图像的采集。软件工作方面，主要完成数据参数的调控、图像滤噪和图像融合。通过软、硬件的结合，提供了一套完整的、高分辨率的光学成像系统。除此之外，为了验证该系统在活体成像方面的性能，本研究设计了一系列生物实验，用实际数据说明了内窥式切伦科夫荧光系统的实用性。生物实验采用人原肝癌细胞构建皮下异种移植瘤模型和原位异种移植瘤模型，实验对象均采用具有基因缺陷的裸鼠。该成像对皮下肝癌异种移植瘤模型实现了高灵敏度地检测，并利用术中成像，指导了肿瘤切除手术的完成。其实验结果与传统切伦科夫成像模式的实验结果具有一致性，验证了成像系统在皮下瘤检测方面的高鲁棒性。对原位肝癌异种移植瘤的检测是切伦科夫成像在深层肿瘤组织成像方面的突破性进展。在本研究中将传统切伦科夫成像模式采集到的图像数据作为对照组，来验证内窥式切伦科夫成像系统的优势。其结果是鼓舞人心的，传统切伦科夫成像下的图像数据没有-I- 探测到任何关于原位肝肿瘤的有意义的信息。相反，使用内窥式切伦科夫成像系统则完成了肿瘤检测与切除，具有很大的实际意义与临床应用前景。关键词切伦科夫；光学成像系统；肝肿瘤检测；内窥式成像；高灵敏度-II- EvaluationofdetectionofHCCinvivousingtheendoscopicCerenkovluminescenceimagingsystemAbstractInrecentyears,Cerenkovluminescenceimaging(CLI)risesrapidlyinthefieldofmolecularimaging,whichattractsalotofattention.ThemechanismofCLIisthattheelectromagneticradiationemittedwhenachargedparticlepassesthroughadielectricmediumataspeedgreaterthanthephasevelocityoflightinthatmedium.Itcompletestheprocessofimagingthroughtheopticaldevice.Unlikethepositronemittingcomputedtomography(PET),CLIhasmanyadvantages,suchashighthroughput,lowcostsanduseofnon-toxicradiopharmaceuticals.Ithasasignificantimpactonthebasicresearch,clinicaldiagnosisandtreatment.However,CLIhasitsowndefects,becauseitsweakerintensityandgreatabsorptioninbiologicaltissuesandpoorabilityofpenetration,thesefactorslimitwidebiomedicalapplications.Inordertosolvetheproblem,anovelhigh-sensitivityendoscopicCerenkovluminescenceimaging(ECLI)systemwasdevelopedinthisstudy.ItcombinedtheendoscopictechnologyandopticalimagingtoimprovethesensitivityofimagingsystemthroughreducingthelossofCerenkovphotonsinspace.TherearetwopartsofworktobuildtheendoscopicCerenkovluminescenceimagingsystem:thedesignofhardwareandsoftwarerelatedmission.Thepartofhardwaremainlyincludesimagingmodule,cooledsystemmodule,auxiliaryplatformmoduleandmodule.Cerenkovimagesacquisitionsarecompetethroughthecollaborativeoperationbetweenmodules.Abouttheprogram,ithelpsparametersadjustment,imagesfusionandimagesdenoise.Combiningthehardwareandprogramprovidesacompletesetofhigh-sensitivityopticalimagingsystem.Inaddition,aseriesofbiologicalexperimentsareconductedinordertoverifytheperformanceoftheimagingsystem.Subcutaneousxenograftmodelsandorthotopicxenograftmodelsofhumanhepatocelluarcarcinoma(HCC)cellsarebuiltintheexperimentsusingnudemicewithgeneticdefects.TheimagingsystemdetectedthesubcutaneousHCCsuccessfullyandguidedthesurgeryoftumorresectionthrough-III- intraoperativeimaging.ExperimentalresultshadconsistencywithtraditionalCerenkovluminescentimages,whichdemonstratedtherobustnessofECLIsystem.DetectionoforthotopicHCCinvivowasabreakthroughindeeptissueimaging.InthisstudythetraditionalCerenkovimagingwasusedascontrolgroup.Theresultswereencouraging,traditionalCerenkovimagingdidnotdetectanymeaningfulinformationaboutorthotopicHCC.Instead,theECLIsystemwassuccessfultodetectandresecttheorthotopicHCC,whichhasgreatpracticalsignificanceandclinicalapplication.KeywordsCerenkov,opticalimagingsystem,detectionofHCC,endoscopicimaging,highsensitivity-IV- 目录摘要...............................................................................................................................IAbstract.....................................................................................................................III第1章绪论..................................................................................................................11.1课题研究的背景和意义................................................................................11.2切伦科夫成像的研究进展............................................................................31.3内窥式切伦科夫成像的研究现状................................................................61.4本文的主要工作和文章结构........................................................................6第2章内窥式切伦科夫成像原理..............................................................................82.1引言................................................................................................................82.2ECLI成像模式的理论分析..........................................................................82.3ECLI光学成像系统的硬件架构................................................................102.4本章小结......................................................................................................11第3章设计并搭建内窥式切伦科夫荧光成像系统................................................123.1引言..............................................................................................................123.2ECLI光学成像系统的设计方案................................................................123.2.1成像模块...........................................................................................143.2.2系统降温模块...................................................................................173.2.3控制模块...........................................................................................183.2.4辅助平台模块...................................................................................183.3ECLI光学成像系统的软件设计................................................................193.3.1数据采集控制软件...........................................................................193.3.2图像融合...........................................................................................223.4本章小结......................................................................................................23第4章ECLI光学成像系统对肝肿瘤的在体评估................................................24 4.1引言..............................................................................................................244.2在体生物实验的设计方案..........................................................................244.2.1肿瘤模型的构建...............................................................................244.2.2图像采集流程...................................................................................254.2.3皮下异种移植瘤的检测...................................................................254.2.4基于切伦科夫术中图像的皮下肝肿瘤切除...................................254.2.5原位异种移植瘤的检测与切除.......................................................254.3实验结果及讨论分析..................................................................................264.4本章小结......................................................................................................31结论............................................................................................................................33参考文献....................................................................................................................34攻读硕士学位期间发表的学术论文........................................................................38致谢............................................................................................................................39 第1章绪论1.1课题研究的背景和意义进入21世纪以来，人类基因组生物测序的完成推动了后基因组时代的发展。从细胞分子层面去认识机体疾病的产生、原理、治疗顺势成为人们研究的新课题[1]。作为医学影像领域最受重视的学科之一，分子影像技术不仅能够对未致病的生命体在基因以及细胞层面来检测结构或者功能异常，其在连续观测药物作用及预后评估领域也发挥着重要的作用[2,3]。新时代的分子影像技术结合信息处理技术、分子生物学、计算机、数学等学科展开研究，使其可以在分子水平上完成生理、病理变化的动态在体成像，开辟了医学影像技术的新道路[4]。据世界卫生组织《世界癌症报告2014》，2012年全球癌症患者人数为1400万，降低肿瘤发病率和死亡率是亟待解决的公共卫生问题。早诊断、早治疗是肿瘤防治的重点。灵敏的可视化成像技术，是结合物理、化学、医学等学科综合发展而来，在生命科学与医学基础研究及临床诊断中居于核心地位，实现肿瘤早期诊断的最有效方法[5,6]。然而现有的成像模式是基于结构改变的解剖成像模式，反映的是肿瘤疾病细胞组织功能改变的后期情况，即组织结构改变。分子影像技术实现了基于特异性分子探针的功能成像，将肿瘤诊断时间窗由结构改变提前到了生物大分子甚至基因水平，为实现肿瘤的早期精准诊断提供了可能[7,8]。PETSPECT在临床的成功应用证明了分子影像巨大的转化医学及临床医学应用价值。分子影像技术包含多种生物成像技术，每种生物成像技术均有各自不同的成像对象、成像深度、空间分辨率、灵敏度及应用领域。超声波成像(Ultrasonicimaging,US)、核磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MRI)、X射线计算机断层成像(Computedtomography,CT)、单光子发射型计算机断层成像(Singlephotonemissioncomputedtomography,SPECT)和正电子发射型计算机断层成像(positronemissiontomography,PET)等成像技术己经成为医院临床的常规检查技术，同时在基础医学及生命科学研究中也用于不同的小动物模型成像[9,10]。近几年发展起来的光学成像技术，其研究对象己经由细胞层次逐步拓展到动物活体层次[11]。但是在临床诊断中，由于受到光在组织中穿透深度有限、生物体系自发荧光干扰等因素的限制，光学成像的生物应用范围仅限于对局部浅表信号的成像[12,13,14]。既往生物成像领域有两个重要的发展方向，一个是在微观的细胞和组织层次上的单分子成像和单粒子追踪技术，另一个是在宏观的活体动物和-1- 人体层次上的成像技术[15]。近年将不同的成像技术进行结合，发挥每种成像技术的优点，综合而成的多模式成像技术可以提供更为全面的生物学信息，已成为分子影像技术发展的必然趋势[16,17]。例如，PET/CT将PET的功能影像与CT的解剖影像同机融合，同步获得机体功能和形态的全面信息，已经广泛用于临床诊断。近年来，一种新型模式的在体成像方法，切伦科夫荧光成像(Cerenkovluminescenceimaging,CLI)在众多成像模态中脱颖而出[18]。其使用与PET相同的探针进行成像，实现了放射性核素自发荧光成像，并开创了核素PET-光学双模式成像的新领域。自2009以来迅速成为研究热点，在肿瘤检测、药物疗效评估、新药研发等多个生物医学领域展现了良好的发展应用前景[19,20,21]。CLI较传统的激发荧光成像，提高了信噪比、克服了探针毒性的问题，成为基础医学临床转化应用的重要分子成像技术。众多研究性论文中的在体实验表明，光学成像设备能够准确地定量分析核素分布的平面信息(如图1-1所示)，然而微弱的切伦科夫光信号强度影响了显像的灵敏度与准确性，较长的信号采集时间降低了成像效率；同时由于切伦科夫光谱主要集中在蓝紫波段，极大地影响了光学信号的生物组织穿透性。因此微弱的信号强度与有限的组织穿透性，成为限制CLI生物应用的两大瓶颈问题[22,23,24]。为进一步探索这两大瓶颈问题的一体化解决方案，在前期研究的基础上，拟制备新型的成像设备势在必得，为在保留CLI高信噪比优势的前提下增强信号强度、提高组织穿透性，可以尝试探索一种核素光学成像的新方法，进而通过构建针对核素放射性激发荧光成像的荧光三维重建算法，实现信号的准确定位与量化分析，在此基础上通过小动物活体成像验证并完善新的成像方法。另外，基于断层技术的切伦科夫荧光断层成像(Cerenkovluminescencetomography,CLT)更能与PET或SPECT相类似地准确定位同位素的深度信息，其是对核素放射性激发荧光成像信号增强技术与相应三维重建算法构建的序贯性研究，为肿瘤早期诊断探索更为精准的定量成像模式[25,26]。综上所述，分子层面上的影像技术研究已经走向多模态，无毒核素已经成为在体成像的光学分子探针，CLT已经成为较为成熟地分析核素分布显像的断层显像技术。借助光学成像探测设备的开放性和多模态信息同机探测方法，应用分子、功能与结构成像信息交互融合的断层图像重建流程，研究并建立准确描述切伦科夫荧光在生物组织中辐射传播规律的数理模型，针对在体医学同位素的代谢与摄取显像问题提出并论证全域快速反演重建方法，同时表征细胞分子、功能代谢、解剖结构等多源信息，是为多模态有机融合的分子影像研究及其临床应用提供一种可行的计算方法[27]。-2- 图1-1切伦科夫成像示意图Fig.1-1CerenkovluminescenceimagingSchematic1.2切伦科夫成像的研究进展当带电粒子在某一种媒介中的运动速度超过自然光在该介质中的速度时，将会产生微弱的光子，这种现象被称为切伦科夫辐射(Cerenkovradiation,CR)，它的实质是高速带电粒子与媒介之间的一种电磁波的相互作用。Cerenkov教授于1934年在研究中发现并阐述了这种现象[30]，并在1958年与物理学家塔姆(I.Y.Tamm)、弗朗克(I．M．Frank)共同获得了当年的诺贝尔物理学奖。根据塔姆与弗兰克的电磁理论的阐述[31]，切伦科夫辐射是一种从红外波段到紫外波段的连续光谱，其发射波长与光子数的平方成反比关系，所以切伦科夫辐射主要集中于蓝紫波段区[28]。早于1971年，W.Burch发表了使用32P来释放切伦科夫光子，以诊断眼部疾病的报告，但是这份报告在当时被未引起关注，主要原因是受限于当时弱光探测设备的成像技术水平。直到2009年，这种技术才被众多研究学者所接受，其阐述了关于如何使用光学成像设备采集核素衰变发出的微弱可见光的概念。使用光学成像设备采集到的光称之为切伦科夫光，而这种全新的成像技术被成为切伦科夫荧光成像，其能够用光学成像设备定量显像临床核素探针发出的光学信号[19]。CLI很好地解决了光学分子影像技术转化医学应用的分子探针局限性问题，同时应用一种探针即可实现PET-光学双模成像。CLI通过核素衰变的副产物切伦科夫辐射进行核素自发荧光成像，这种内源发光成像方式较激发荧光成像，克服了激发光穿透性的限制及自体荧光的干扰，提高了信噪比[29]。反射性核素的选取决定着切伦科夫辐射的产生量，很多科学家对多种-3- 放射性核素产生的切伦科夫辐射进行了评估[32,33]，他们的研究表明由β粒子产生的切伦科夫光子与放射性核素的能量谱及放射性强度相关，考虑每次衰变产生的切伦科夫光子数，在众多核素中90Y最强，68Ga、15O、11C、131I、89Zr次之，18F和64Cu最弱。实际上用于生物医学显像的发射正电子的放射性核素产生的能量都能满足产生切伦科夫辐射所需要的阈值能量而产生切伦科夫辐射，其体内显像均表明CLI与PET显像有很好的相关性。国内外的研究学者同时在多个角度对CLI成像模式进行了探索，美国加利福尼亚大学的研究团队、西安电子科技大学的研究团队和中国科学院自动化研究所的团队从光源自身入手，开发了基于三维重建的光学成像系统及重建算法，CLT能够量化深层肿瘤组织光源的三维信息，如何减少真实光源与重建光源之间的空间误差是这一领域的核心问题[34,35]；斯坦福大学的研究团队从成像硬件设备为立脚点，采用内窥技术与传统CLI成像模式相结合，内窥式成像系统能够说明放射性核素在生物体中的分布，但是这种方式进一步减弱了切伦科夫的光信号，改进成像设备的内部结构可以促使CLI真正的走向临床应用[36]。另一方面，基于生物体器官对切伦科夫荧光的吸收度，很多研究学者开展阴性对比的成像研究。Steinberg等根据血管中红细胞较体内其他组织对红光及近红外段光具有更高吸收率的特性开展阴性血管对比成像研究，研究人员采用具有高光子产出以及在血液中具有较长半衰期的[68Ga]GaCl3作为显像剂进行成像，实验结果验证了这一设想，即血管的切伦科夫光信号明显低于周围组织，而肿瘤血管由于直径较大，血容量较多，使其对切伦科夫冷光吸收更强，具有更好的阴性对比结果[37]。在预临床与临床的生物应用方面，利用光学成像的高时间分辨率和低成本特性，CLI在肿瘤早期诊断、放射治疗、手术导航、药物研制等预临床研究中也有了探索性进展。通过CLI检测甲状腺和甲状腺癌的细胞中124I和131I在体分布差异，核医学杂志(JournalofNuclearMedicine,JNM)证实肿瘤小鼠在接受药物治疗进程中18F的CLI连续成像有效性与PET结果线性相关，且每组实验数据相关指数R2>0.88[38]；在89Z的CLI图像导航下，微创在体手术精准地切除了T-474肿瘤[39]；MillenniumPharmaceuticals制药公司使用CLI方法在体评估了LN4924化合物的抗癌疗效[40]。2013年，Spinelli等成功对人类甲状腺进行了CLI显像[41]；2014年，Thorek等对人腋窝淋巴结进行了CLI显像，实验表明CLI所显示的淋巴结与PET显像具有良好的一致性，这些应用标志着CLI已经从理论研究过渡到动物模型、再到浅表临床应用的转化[42]。然而，CLI的医学前景也不尽善尽美，其微弱的光信号强度依然影响着显像的灵敏度与准确性，同时较长的信号采集时间降低了成像效率，这些因素成-4- 为CLI应用于临床必须攻克的难题[43]。如何有效地提高切伦科夫信号采集的成功率成为国内外新的研究热点。通过斯托克斯位移原理，采用切伦科夫光作为内源激发光源二次激发荧光物质，进而增强信号强度、实现光谱红移以提高组织穿透性，是增强切伦科夫信号的有力手段之一。2010年，Dothager等发现64Cu和18F可以通过量子点激发荧光的斯托克斯位移效应实现光谱向红外方向移动，正式提出了切伦科夫能量转移成像(CerenkovRadiationEnergyTransferImaging,CRET)的概念[44]。随后，Liu等通过异种移植瘤实验验证了量子点在切伦科夫辐射发出的蓝色光谱下可以被激发出二次荧光，以此来提升输出图像质量。有机荧光染料同样可以完成光谱红移的二次激发。Lewis等在2010年通过18F-FDG衰变而成的切伦科夫光完成了荧光素的二次激发[45]，在体实验结果证明，18F-FDG、荧光素按一定比例混合后，其信噪比比单独18F-FDG注射的条件下高5.7倍。2013年，Grimm等在Naturemedicine发表论文提出切伦科夫二次激发荧光成像(SecondaryCerenkovinducedfluorescenceimaging,SCIFI)的概念，他们利用SCIFI可有效减少了非靶向组织的光信号，提高了靶与非靶组织比值，进而提高了图像可分析性。然而，核素光学激发荧光成像依旧是核素衰变的副产物作为激发光源，尽管二次激发荧光成像实现了光谱红移输出，理论上提高了信号的组织穿透性及可采集率，但这种依据斯托克斯位移的二次激发荧光成像是一种转换能量的方式，进一步降低了切伦科夫光总的信号强度[46]。因此核素光学激发荧光成像未从根本上解决核素光学成像中微弱的信号强度与有限的组织穿透性两大瓶颈问题。切伦科夫断层显像，通过三维重建算法来获取光源的三维立体数据，打破了传统切伦科夫荧光显像只能提供光源平面信息的限制，提供了光源的深度信息，进而准确定位光源位置，其算法的效率值决定了最终结果的精确度。Liu等通过将18F-FDG作为显像示踪剂，首次使用高灵敏度的科学相机进行活体切伦科夫断层显像实现了这一领域零的突破，但是其重建算法精确度还不高，致使输出结果的空间分辨率比PET的分辨率要低了若干等级。Spinelli等利用干窄的带通滤波器产生平面图像进行三维重建，得到了相对满意的成像结果，但该研究的缺陷在于成像耗时较长，理论上不适用与临床应用中[47]。Hu等通过自适应高阶有限元方法(hp-FEM)进行三维重建，所得结果与SPECT相比具有很好的一致性，该方法在保证图像分辨率的前提下使得成像时间大大缩短，提高了CLT的可操作性[48]。-5- 1.3内窥式切伦科夫成像的研究现状鉴于内窥式切伦科夫荧光成像的优势，组建内窥式光学成像系统是切伦科夫荧光成像突破性的发展道路。由切伦科夫辐射能量公式可知，以蓝紫波段为主的切伦科夫荧光与生物组织光窗有偏移。切伦科夫荧光的吸收性决定了其较弱的组织穿透力。面对深层组织的肿瘤而言，传统的CLI成像模式难以获得有意义的信息，这也是限制CLI广泛应用于临床的重要因素[30,31]。针对CLI的缺陷性问题，斯坦福大学的科研团队首次提出了内窥式切伦科夫成像(endoscopicCerenkovluminescenceimaging,ECLI)，其设计理念是将内窥技术与切伦科夫荧光成像相结合[44]，开发一套适用于生物体结构的高灵敏度肿瘤探测设备。实验测试可得，腹腔镜、内窥镜、光纤均可以与EMCCD科学相机进行耦合组建成像元件，但鉴于使用光纤来传导切伦科夫光子会致使传导过程中光子损失量加大，所以，目前为止，腹腔镜得到相对广泛的应用。在体实验说明，这种硬件组合可以对皮下肿瘤组织进行早期检测。鉴于内窥式光学成像系统还处于研发的初期阶段，目前设备的性能还不能支持其进行深层肿瘤组织的检测。本研究通过市场调研及理论分析，开展了关于内窥式切伦科夫荧光成像系统的搭建工作，并通过原位肝肿瘤的在体实验，首次对深层肿瘤组织检测方面取得了突破性的进展。这意味着内窥式切伦科夫成像模式距离临床应用又近了一步。1.4本文的主要工作和文章结构本研究以成像系统搭建与在体实验评估为两个主线，开展了相关工作如下：1、根据切伦科夫效应的理论分析与成像元件的市场调研，我们设计并搭建了一套完整的内窥式切伦科夫荧光成像系统，其具备合理的硬件设备与高效率的算法实现。该成像系统最大的优势是具有高灵敏度，对深层肿瘤组织成像方面有较大的优势。2、为了测试成像系统在体组织成像方面的性能，我们设计了皮下肝肿瘤检测实验与原位肝肿瘤检测实验。在皮下肝肿瘤检测实验中，我们得到了多组数据，并将其与传统的切伦科夫成像结果对比，得到了较好的一致性。在原位肝肿瘤检测实验中，我们使用该成像系统成功地完成了早期探测工作。除此之外，我们使用该系统进行术中成像，指导了肿瘤组织的切除手术，成功模拟了术中导航过程。全文共分为四章：-6- 第一章介绍切伦科夫成像技术的背景及意义，概况了其特点及国内外研究现状。第二章介绍了切伦科夫成像技术的原理。第三章介绍了自主搭建的内窥式切伦科夫成像系统。包括硬件平台的设备选型，系统组装及调试等，同时介绍了本系统的软件部分，包括数据采集和数据处理等。第四章详细描述了皮下肝肿瘤与原位肝肿瘤检测的实验过程，并分析其结果及意义。-7- 第2章内窥式切伦科夫成像原理2.1引言ECLI成像技术是CLI技术的扩展，是针对CLI成像模式的固有缺陷而提出的一种解决方案。其通过物理结构上的改变，从空间上减少切伦科夫光子的损失，提高成像系统的分辨率。ECLI成像的技术原理的核心部分是通过腹腔镜传导切伦科夫辐射产生的可见光，其工作方式能够以微创、甚至无创地进行深层肿瘤组织成像，是CLI成像走向临床应用的必经道路。2.2ECLI成像模式的理论分析19世纪，科学家Cerenkov发现了一种物理现象，即带电粒子在某一种介质中以超过光在该介质传播的速度运行时，会产生一种可见光，后来人们称这种现象为切伦科夫辐射。O.Heaviside在上世纪八十年代提出一种观点，带电粒子以超过电磁波的速度行进时会产生新的辐射源[17]。L.Kelvin在上世纪九十年代发表了“笼罩在热和光的动力学理论上的十九世纪乌云”的著名演说，他提出带电粒子以超光速行进时是有可能产生辐射的[18]。1904到1905年间，A.Sommerfeld提出了与此相类似的带一小角度分布的超理论辐射[20]。这些理论分析在当时并没有得到大多数学者的认可，因为人们普遍认为，任何粒子的运行速度都不可能超过光的速度。这种观点随着科学家Cerenkov的研究报告问世而产生了动摇。在科学家S.Vavilov的实验室中，P.A.Cerenkov发现即使仅放置放射性材料也能观察到足够强的荧光[30]，并通过荧光寿命、光谱特征、荧光物质属性等方法鉴定其分类归属：这是一种新的物理现象。后来这种可见光被命名为切伦科夫荧光[30]。随后，科学家I.M.Frank与I.E.Tamm在经典电磁场理论框架内，对切伦科夫荧光现象完成了数理推演与理论解释[31]。由经典物理和量子学理论可知被辐射光子的频率与辐射传播方向之间的定量关系[33]：n()wwww+0cosq=(2-1)cv式中，w0代表本征频率，c代表光在真空中的速度，µ代表以速度v运行的电荷路径与频率为ω的切伦科夫辐射方向间的夹角，n(ω)代表该介质的折射系数。设定v/c的比值为β，即cosµ=1/(n(w)β)。切伦科夫辐射光谱由运动系统的速度v-8- 与本征频率ω0和光在介质中的相对速度c/n(ω)共同决定。对可见光而言，当n(ω)大于1时，光在该媒介中的传播速度可以表示为c/n(ω)，可以看出，其值低于c。切伦科夫效应产生的必要条件为，vn()w>1(2-2)c当带点粒子的运动速度趋于光速时，发生切伦科夫辐射的能量阈值可以表示成以下公式，222Emc=(11--vc1)(2-3)其中m表示为该粒子的质量。众所周知，折射率n(ω)是辐射频率的函数。当发生辐射时，能量的转移与相对速度无关而是与群速度紧密联系[33]，dn()wucn=+(()ww)(2-4)dwE.Fermi提出了一种观点，点电荷在具备介电常数的媒介中匀速运动时会产生辐射[34]，所以考虑到频率积分，对任意速度都满足Tamm-Frank所提出的切伦科夫辐射条件。上世纪40年代，科学家V.L.Ginzburg首次提出了切伦科夫辐射的量化公式。这也与I.M.Frank和I.E.Tamm的经典表述一致[31]。携带整数z个单位电荷量e的粒子运动单位距离ds后产生的切伦科夫光子数及其光子的单位能量积分可以表述为：2222dN4pex2=sinq(2-5)2dsdllhc其中λ代表光子的波长，h代表普朗克常量。在现实情况中，切伦科夫辐射在媒介中传播时会发生色散现象，切伦科夫光子以群速度u向前运行。在非色散介质中，传播速度可以简化成u=c=n(ω)。在理想情况下，光电耦合器(Chargecoupleddevice,CCD)对波段为400-700nm的光子的量子效率为100%，那么其能收集到的切伦科夫光子总量为，222dN41pex12=（）-sinq(2-6)dshcll12其中，λ1=400nm，λ2=700nm。从数学角度上去阐述切伦科夫光子在蓝紫波段占有量较大，就要分析其单位路径发射出的光子能量W，22dWex2=2òbwn()1>wqsindw(2-7)dsc-9- 设定n(ω)是一个常数，那么由于光谱连续分布，n(ω)可以近似为1。综上所述，相对于角频率的微分算子可表示为，22dWexsw=(2-8)2dcw换用波长代入上式，其结果为，dW1µ(2-9)3dwl在现实情况中，光子探测器的芯片形状与材质都有缺陷，例如石英窗的透明度、透镜反射、Winstone光核等，其量子效率并不能够达到百分之百的理想状态。由于切伦科夫辐射的理论分析进展迅速，科学家J.V.Jelley就其当时的研究背景进行了总结与归纳[38]。结合电磁场与重力场理论，在有限温度环境下切伦科夫荧光辐射能量谱定量式被公开发表[39]。当粒子束在某一个非线性介质中传播时，设定其中某一个粒子以超光速运行，其他粒子以低于光速的速度运行，这种情况下切伦科夫辐射也会发射出来。通过验证切伦科夫辐射的内部电磁结构，其呈锥状发射，可见光被低能近红外光子和高能光子所包围[41]。当实验对象被注入放射性核素时，随着其衰变过程，同样会产生切伦科夫辐射。通过高灵敏度的科学相机对发射出来的可见光进行采集成像，这种模式即CLI成像模式。当实验对象为活体生物时，同位素标记的放射性核素会被注射入生物体中，随后核素会参与组织代谢并汇聚在生物体的异常组织中。随着放射性核素的不断衰变，电磁信号会不断从源头辐射出来被检测设备收集到。根据其在生物体中的分布，来推测出生理信息。组织内的同位素分布与摄取信息是功能与结构成像的理化依据。总之，核素显像能够以非侵入式来反映单细胞乃至整个组织的生物分子或进程变化信息。对于能够释放高能带电粒子的反射性核素而言，同一放射源会产生两种类型的光子，伽马光子与切伦科夫光子。PET、SPECT和γ相机等探测装置通过收集伽马光子来反映相应的信息，而CCD能够依靠微弱的切伦科夫荧光来提供生物信息。2.3ECLI光学成像系统的硬件架构ECLI光学成像系统的硬件架构图如图2-1所示，数据采集时，实验对象固定在电控平台上，将腹腔镜的镜头端对准实验对象，切伦科夫光子通过腹腔镜传导至高灵敏度低温电子倍增(Electron-multiplyingCharge-coupledDevice,-10- EMCCD)科学相机，最后输出实验对象的白光图像和切伦科夫荧光图像。平台部分可以对实验对象的位置进行精准调节，保证实验对象在成像视野的中央，同时还可以辅助科学相机完成准确对焦。实验设计与条件的不尽相同，对ECLI光学成像系统的技术指标和参数也不同。若只对实验对象的表层进行切伦科夫信号探测，参数设定通常都采用较短的曝光时间和皮下注射适量示踪剂药物来完成数据采集；如若对于实验对象的内部进行切伦科夫信号检测，则流程较为复杂，对于活体的肿瘤小鼠来说，需要对其麻醉，完成剖腹手术，将腹腔镜的镜头端探入小鼠的腹腔并找到成像点，与此同时，较长的曝光时间、大剂量的示踪剂药物、大倍数的电子倍增增益是必要的。图2-1硬件架构图Fig.2-1Diagramofhardwarearchitecture整个数据采集的过程中，为了保护切伦科夫光信号，削除外界自然光对成像结果的干扰，所有的数据采集部件都要用一个光学暗箱中进行闭光处理。暗箱外部放置铅制屏风，以防止发射出来的射线伤害实验人员。2.4本章小结本章详细描述了内窥式切伦科夫成像模式的理论分析，验证了其成像的可能性。同时介绍了ECLI光学成像系统的硬件架构图，阐述了ECLI成像模式主要硬件的构成及作用，为后期的系统设计提供了理论支持与技术指导。-11- 第3章设计并搭建内窥式切伦科夫荧光成像系统3.1引言为了能够使切伦科夫效应的成像模式走向临床应用，国际科研学者们在成像方式上积极地寻找方向。2013年，内窥式切伦科夫荧光成像(EndoscopicCerenkovluminescenceimaging,ECLI)首次被斯坦福大学的科研团队提出，他们通过理论推理及实际验证，对此成像模式展开了大量的研究。这种成像模式是针对深层肿瘤组织进行实时、准确的探测，一经提出迅速成为领域中的研究热点，加快了切伦科夫荧光成像模式走向临床应用的脚步。内窥技术与切伦科夫效应相结合的理念，吸引了国内外的科研单位的注意力，纷纷搭建实验测试型的内窥式光学成像系统，用于小动物成像的基础研究。本研究设计并搭建了一套完整的ECLI光学成像系统，其包括硬件设计与组合，还包括了软件的编写。经过理论分析与市场调研，本研究选择高灵敏度带电子倍增功能的科学相机组合适用于临床的腹腔镜作为主要的成像元件。除此之外，设计并定制了一系列辅助设备来完善实验环境，保证数据采集的顺利进行。在软件方面，基于snake模型的图像融合算法可以对感兴趣区域的切伦科夫信号进行有效提取，并且在设置阈值、过滤伽马光子方面也考虑到内，使得得到的图像数据质量、精准度都能达到较高的水平。3.2ECLI光学成像系统的设计方案ECLI光学成像系统的设计方案包括硬件部分与软件部分。对于硬件部分，该系统主要包括四个模块，即成像模块，系统降温模块，辅助平台模块以及控制器模块。成像模块是ECLI光学成像系统的核心部分，其承担着图像数据采集的重要任务，该系统的重要技术指标都由此部分来实现。系统降温模块给ECLI光学成像提供了一个低温的、稳定的成像环境，是该系统必不可少的一部分。对数据参数的调整、后期图像的融合与过滤、分析图像数据这些功能主要有控制器模块来实现，这部分是整个成像系统的中枢神经，控制着图像采集的流程。辅助平台模块包括了光学平台、外置光源、成像平台等设备，主要任务是为图像数据采集过程提供一个相对稳定的外围环境，避免外界因素对成像过程的干扰，并且根据实际情况来调节各个设备的位置与光线。-12- 图3-1ECLI光学成像系统图示Fig.3-1DiagramoftheECLIsystem成像系统的连接方式及各个部件的位置如图3-1所示。首先详细介绍成像系统各硬件，图中1箭头所指示的部件为计算机，2箭头所指示的部件为高灵敏度带电子倍增功能的科学相机，3箭头所指示的部件为科学相机的内置制冷系统，4箭头所指示的部件为系统外接制冷系统，5箭头所指示的部件为定制转接环，6箭头所指示的部件为临床应用的腹腔镜，7箭头为成像平台，8箭头腹腔镜外接光源，9箭头所指示的部件为定制暗箱。所有的成像设备均使用8号暗箱设备进行封光处理。1号设备为成像系统的控制模块，所有的采集参数均有此部分控制。2、5、6号设备组成了ECLI光学成像系统的成像模块，科学相机的镜头卡口与腹腔镜由定制的转接环进行耦合，负责图像数据采集。7、8、9号设备组成了辅助平台模块，其中成像平台为可升降移动平台，将待测实验对象固定到其上面，可以辅助调整成像距离、成像视野等工作；腹腔镜外接光源则为实验过程中采集白光图像数据提供充足的环境光；铅制暗箱将所有的成像设备封闭起来，确保外界光线不会影响微弱的切伦科夫光，降低图像中的噪点，提高分辨率。3、4号设备组成了系统降温模块，其中，科学相机内置降温系统为风冷设备，相机开启时其自动开启，外接降温设备为水冷机系统，需要时可以手动开启。两部分降温系统同时开启时，给成像过程保证了超低温的实验环境，最高可达到-100℃，在这个温度等级下采集到的图像数据，确保了低等级的暗噪声，提高-13- 了成像体统的分辨率。下图为成像系统的实物连接图，由于成像部分被放置在暗箱中，光线较弱，部分部件不是很清晰，后续章节将详细介绍每个模块每个部分设备的调研过程与具体参数。图3-2ECLI光学成像系统实物图Fig.3-2PrototypeofECLISystem3.2.1成像模块基于切伦科夫辐射的可见光光强非常弱，本身很难被光学设备探测到，采集生物体内的切伦科夫光更加困难。从光在生物组织中的传输方程可知，其在生物体内会发生散射现象，一部分还会被生物体所吸收，所以光子损失情况比较严重。这也是CLI在科研界未能进一步突破的主要原因。随着高灵敏度的科学级相机的问世，使成像设备捕捉弱光的能力提高了几个数量级，使用科学相机作为数据采集的核心部件非常适用于切伦科夫光的采集，同时也是未来的发展趋势。本研究设计的成像模块三个主要部件，分别是EMCCD科学相机、应用于临床的腹腔镜和定制的转接环，相机与腹腔镜使用转接环进行耦合连接，使得切伦科夫辐射出的光子通过腹腔镜传输到科学相机中的芯片中，他们的实物如图3-3所示，其中a为EMCCD相机，b为定制转接环，c为腹腔镜。-14- 图3-3成像模块实物图Fig.3-3Diagramofsignalacquisitionmodule使用科学级相机进行光子采集时，往往有几个因素会影响到图像质量。首先是量子转换效率，EMCCD相机的感光元件能够采集不同波长的光，光信号转变为电信号的效率即为量子转换效率，此值越大，输出结果越强，图像质量也越高。读取噪声也是图像质量的重要参数，在系统输出图像时，前置放大端决定了读取噪声，读取速率变快时，其值就会升高。暗噪声也是影响输出图像重要指标，当相机工作时，会产生大量的热能，促成电子-空穴对的形成，当自由电子流到电势阱，就产生了暗电流。这种情况不是我们想要的结果，暗噪声的存在会混淆较弱的切伦科夫信号，使图像数据的信噪比降低，甚至导致成像结果失败。因此使相机工作在超低温的环境下，是减弱暗噪声的有效措施。针对较弱的切伦科夫光，如果想得到有意义的图像数据，信号放大也是一项必不可少的功能，因此具有电子倍增功能的EMCCD相机是首要选择。电子倍增功能可以放大切伦科夫信号的倍数来提高图像的分辨率，但是同时也会放大相应的暗噪声，因此合适的放大倍数是需要后期通过实验结果来调节的。经过理论分析与市场调研，ECLI光学成像系统采用ANDOR公司的DU888+EMCCD相机作为核心器件。这款EMCCD相机的有效像素可以达到1024×1024;像素尺寸为13um×13um;感光元件尺寸为13.3mm×13.3mm;内部风冷系统采用半导体制冷的方式，最低可以达到-85℃，工作在这种温度环境下的相机对暗噪声的抑制有很好的效果；此款相机还具备线性定量的信号放大功能，对于光强等级比较低的切伦科夫光的采集有很好的效果，其成像结果更便于后期的处理。鉴于切伦科夫光的波长集中在400-700nm范围内，而DU888+EMCCD在相应波长段的量子效率为92.5%，更够最大限度地将光信号转变为我们所需的电信号输出。另外，其读出速率值可以在1MHz到10MHz内调节，满足不同波段光子的采集。在成像过程中，相机通过可移动升降台来调节位置、高度，保证了对实验对象各个角度的数据采集。综上所述，此款相机适用于切伦科夫光的采集，将其作-15- 为主要成像元件完成了搭建ECLI光学成像系统的重要一步，其内置的详细参数可参考下表中的技术指标。表3-1DU888+科学相机的技术指标Table3-1ParametersofDU888+EMCCDcamera参数名称PixelSizeReadoutrateNoiseTemperature参数值1024×102413×13μm1~10MHz<1e-withEM-85℃Quantum参数名称GainDarkcurrentCapacityFrameefficiency参数值>90%1-10000.001e-/pix/sec80,000e-8.9fpsECLI光学成像系统的设计特点为，实验对象发射出的切伦科夫光子通过腹腔镜传导至EMCCD相机的芯片中，再输出图像，因此选择什么类型的腹腔镜对实验结果也有着极大的影响。根据技术参数的分析与市场调研，我们分别测试几款腹腔镜的性能，得到的技术指标如下表所示。最终我们选用奥林巴斯公司生产的光学试管，这是一款应用于临床的腹腔镜，其成像距离的范围可以从1cm达到15cm，适应于小动物实验的成像条件。更为重要的是，其内部结构采用棱镜来传导光子，相对于光纤，这种结构对于传导过程中的光子损失量更小，能够最大限度地收集切伦科夫光子。表3-2腹腔镜技术指标Table3-2Parametersoflaparoscopes种类最大成像距离孔径值内径内部结构软镜0.4m0.1~0.222毫米未知硬镜0.15m未知2毫米棱镜6mm纤维束0.1m0.226毫米纤维40um光纤0.1m0.20.4毫米纤维60um光纤0.1m0.220.6毫米纤维ECLI光学成像系统的转接环部件，依据硬件环境及实验要求由工厂定制，其设计方案是集调焦与转接于一身。由于腹腔镜的卡口与EMCCD相机的卡口不兼容，所以需要用转接环将其耦合到一起。转接环的另一个重要作用是增加靶面利用率，腹腔镜的镜头端直径较小，导致成像视野很小，不利于信息的提取，使用转接环放大后，使成像系统能够输出成像视野更宽阔、质量更高的图像数据。转接环还可以起到调整焦距的作用，在成像距离固定的情况下，其能够保证成像视野的清晰度。综上所述，DU888+EMCCD相机、奥林巴斯腹腔镜和定制的转接环作为了-16- ECLI光学成像系统核心的成像模块。3.2.2系统降温模块系统降温模块的建立为ECLI光学成像系统提供了超低温的数据采集环境。正如上文介绍，影响输出图像的一项重要外界因素是暗噪声。即使EMCCD相机工作在明暗度较低的环境下，也会产生热量，这些多余的热能导致的电子-空穴对的大量产生。产生的自由电子会飘进电势阱，即形成了暗电流.这种情况会使输出的图像数据中产生背景噪声，也称之为暗噪声。那么降低EMCCD相机的工作环境温度是减少暗噪声的最有利方法。图3-4水冷降温设备Fig.3-4Water-cooleddevice系统降温模块就是针对暗噪声问题而设计的，共包括两部分设备，即EMCCD内部降温系统与外接降温系统。内部降温系统内置于EMCCD相机之内，随着相机的启动，可以通过软件控制将其开启，也可以设置成随相机启动开启。这部分降温设备是EMCCD相机的一项特色技术，使用半导体制冷而形成的风冷系统更够使成像温度降低到-85℃。为了进一步减少暗噪声的产生，提高输出图像的分辨率，外接降温系统起到了重要的作用。外接降温系统采用定制的水冷机连接EMCCD相机，在相机工作时，可手动打开水冷机开关，根据选择功率的不同，水冷机将以不同的速率将制冷液体通过皮质胶管输送出EMCCD相机内。由于EMCCD相机的芯片部分采用了水隔离包围，保护了芯片不受制冷液体的影响。液体流过相机后通过输出皮质胶管返回水冷机。这种如此循环制冷的技术可以使EMCCD相机的工作温度进一步降低，经过实验测试，可以达到-100℃。当EMCCD相机的工作温度低于-90℃时，每降低5℃，暗噪声的产生量就会减少-17- 一个数量级。由此可见，内部降温系统结合外接降温设备可以保证ECLI光学成像系统能够对微弱的、数量少的切伦科夫光进行采集，同时还能提供低噪声的图像质量。这一模块的设计很大程度上决定了成像系统的分辨率，是优于其他团队研发的成像系统的特点之一，也是本研究重要的创新点。3.2.3控制模块控制模块主要包括以计算机为主的工作站，是ECLI光学成像系统的司令部。通过控制模块可以对图像采集的参数进行设定，可以对切伦科夫荧光图像进行采集、处理、滤噪、融合等操作。图3-5工作站Fig.3-5Workstation工作站如图3-5所示，其主机中装有数据采集卡，EMCCD相机通过一根数据线与主机上的相应卡口连接，使得数据采集、参数调整等操作可以通过工作站来完成。当进行图像数据采集时，先在工作站中完成采集参数设定，出于实验环境的严谨，等待数据采集的过程中，应关闭显示屏，以防止多余的光线影响图像质量。数据采集结束后，其结果会反馈到工作站中，工作站可以通过软件进行过滤噪声及伽马光子，继而完成图像融合输出最终图像。3.2.4辅助平台模块辅助平台模块主要包括暗箱设备、定制光源、可移动升降台。其主要作用就是给予成像模块一个相对稳定、安全、抗干扰能力强的数据采集环境。暗箱设备是减少自然光线的屏障，成像模块与系统降温模块在数据采集的过程中都需要进行封过处理，暗箱设备就是针对这种情况设计的。暗箱的一面喷有吸光漆，可以滤除成像环境之外的光线，对抑制内部金属部件的反光也有-18- 一定的作用。其内部装有导热板，可以将EMCCD相机工作时产生的热量及时疏散出去，从侧面提高输出图像的质量。暗箱的外部还涂有铅层，可以减少实验人员遭受射线的伤害。定制光源是针对腹腔镜在拍摄白光图像时的补光设备，因为整个成像过程都需要密闭无光，不宜频繁的开关暗箱，所以在需要观测实验对象的白光图像采集时，需要植入外接光源。定制光源使用光纤来传导光，一端接入光源主部件上，另一端接入腹腔镜的光源导入接口处，当开启光源时，腹腔镜的镜头端可以射出光线，其强度可以通过旋钮进行调整。可移动升降台包括成像平台与相机控制平台。实验开始之前，EMCCD相机连接在控制平台上，根据实验条件调节相机的位置与高度。然后将实验对象固定在成像平台上，通过调整成像平台的位置和高度，使实验对象在成像视野范围内并保证准确的对焦。辅助平台模块保证数据采集实验的顺利完成，为精准的实验结果提供了硬件支持。3.3ECLI光学成像系统的软件设计ECLI光学成像系统不仅需要硬件模块的支持，软件设计也至关重要，其主要分为两部分，即数据采集控制软件和图像数据后期处理软件，二者缺一不可。数据采集控制软件的主要功能是调整图像数据的采集参数，根据不同的实验要求、实验对象、成像方式，每一次数据采集所要求的参数都不尽相同，所以需要实时地改变参数以适应实验条件。另外，在数据采集采集过程中，也需要组合不同的技术指标来达到满意的效果。图像数据后期处理可以提取荧光图像的感兴趣区域、完成过滤噪点、改变图像格式、输出最终图像、分析图像结果等流程。3.3.1数据采集控制软件输出图像的质量、分辨率与采集过程中参数的相互组合密切相关，所以如何完善参数设定是此部分软件的重要任务。在实验开始之前，要对实验对象进行精准对焦，此时可以通过此部分软件开启相机视频模式、动态调整成像视野、成像距离以及对焦状况等。此过程采用1s时间曝光，关闭电子倍增增益就可以完成。-19- 图3-6图像采集的操作界面Fig.3-6Operatorinterfaceofacquisition随后进行数据采集控制，主要是设置数据采集时的成像模块的技术参数，包括曝光时间、binning值、读取速率、成像温度和电子倍增值等都设置成初始的默认值，继而对实验对象进行调焦，保证实验对象在成像视野的中心位置并且保持清晰。在调焦的过程中，可以适当延长曝光时间来获取不同效果的图像，直到找到满意的参数，完成对焦。需要注意的是，较长的曝光时间在采集切伦科夫光子的同时，伽马光子也会被收集到，这会导致图像中噪点的产生。Binning值是通过讲一定区域内的所有像素点合并的方式来增强当前区域的有意义信号值，相当于降低一部分的分辨率来提高图像的信噪比，其主要有2×2、4×4、8×8几种组合合共选择。正常情况下的制冷温度可以设置为达到-85℃，这个等级的环境温度可以降低暗噪声产生的概率。在采集切伦科夫荧光数据时，需要提高电子倍增增益值，这样可以放大较弱的切伦科夫荧光信号，值得考虑的是，其在放大有意义的信号时，背景噪声也会随之增强，所以如何将其值优化在可控的范围内，是需要通过实验结果来不断调节的。根据不同的实验对象、不同的成像条件，完整的参数列表都需要要经过多次的预实验分析才能得到，因此-20- 在正式实验之前，通常要花费一部分时间对参数列表进行分析与评估，其主要流程如图3-7所示。图3-7参数调整流程图Fig.3-7Processofparameteradjustment当运行控制软件后，等待其初始化完成，然后设置成像系统的制冷温度，由于此系统采用EMCCD相机内部的风冷系统与外接水冷系统共同降温，所以，此处温度可以设置为-100℃，此时温度标识等为红色，代表系统处于降温状态，待颜色变成绿色，即到达了预设温度，此时可以进行图像数据采集。根据切伦科夫荧光成像的模式，需要白光图像与切伦科夫荧光图像。对于白光图像，其参数要求比较简易，只需控制曝光时间来调整图像的质量。对于切伦科夫荧光图像，需要结合曝光时间、制冷温度、读取速率和增益值等技术指标，保证采集切伦科夫光子的成功率。鉴于切伦科夫光子的低光强特点，一般在实验过程中，都要求较长的曝光时间，来确保光子的采集数量，经过多次实验研究，曝光时间控制在300s左右。对于Binning值，聚合的像素较少不会产生增强切伦科夫信号的效果，而聚合的像素过多会使输出图像的分辨率过低，所以我们选取折中的Binning值4×4。采集切伦科夫光子时，电子倍增功能是需要开启的，这样能够使采集效率大大增加，通常采取800~900的增益值。所有参数设定后，点击采集按钮，开始图像数据采集。在此期间，要保证-21- 所有能够发光的设备包括工作站的显示屏要适当遮挡，以免过多的自然光给图像采集过程造成障碍。图像采集结束后，控制软件会输出相应的白光图像与切伦科夫图像作为结果，从图像中很难去分析实验结果，还需要对图像进行滤噪、融合等等，这部分内容将在下一章节进行详细说明。3.3.2图像融合通过数据采集控制软件可以得到初始数据，即白光图像与切伦科夫荧光图像，还需要进行后期处理，然后将两种图像融合，得到最终的切伦科夫配准图像来分析实验结果。此部分通过算法实现感兴趣区域提取，通过设置阈值过滤荧光图像的噪声和伽马光子，最后将处理后的切伦科夫荧光图像与白光图像叠加，完成实验。其详细流程如图3-8所示。图3-8图像融合流程图Fig.3-8Processofimagefusion对于成像控制软件采集到的荧光图像设为I,对其处理的第一步为感兴趣区域选取，并对其进行膨胀处理，目的是提取该图像中有意义的切伦科夫光学信号。本研究采用气球snake外力模型算法来实现该过程，其公式表示为：DEextF=-knxk()(3-1)ext12DEext从I原始图像中提取出关联的感兴趣部分作为原始图像的子图像，设为Is；再在-22- Is子图像中进行有效切伦科夫光子提取，继而得到有效荧光子图像It；利用预定阈值对荧光信号子图像Is进行过滤得到有效切伦科夫子图像It。It图像中除了包含有效切伦科夫光子之外，还有一些不可避免的噪声和伽马光子，所以对It图像进行二次过滤是必要的。对于某一像素点，以其为中心，半径在δ的范围内存在5个以上的位置点没有出现有意义的信号，则该点将被滤除，变为背景。遍历It图像中的每个像素点，然后得到子图像Ip。综上所述的步骤完成后，图像Ip是最终的切伦科夫荧光图像。将所述过滤子图像Ip均匀固定在[L,Imax]的色阶上进行着色，其中，L=256，Imax是光学图像的最大信号值将其与白光图像直接叠加即得到了切伦科夫配准图像If并输出，其像素点的灰度值被转变为光照强度值。3.4本章小结本章内容分两部分详细介绍了ECLI光学成像系统，即硬件系统搭建与软件的核心算法。硬件方面包括成像模块、系统降温模块、辅助平台模块以及控制器模块，每个模块中的核心器件在理论分析到市场调研的过程中，完成了设计及组建。软件方面介绍了数据采集控制软件与图像融合算法，详细说明了切伦科夫图像采集所需要的各项技术指标和参数，并且根据算法得到了最终的输出图像，切伦科夫配准图像。在系统测试实验的结果中，由于腹腔镜的内部直径比较小，导致其镜头端的成像视野也比较小，反映到图像上导致了相机的靶面利用率也降低了。由于相机与工作站的连接是通过PCI接口完成的，所以在选择工作站时要注意其主板的硬件指标。ECLI成像是接收放射性核素衰变而来的切伦科夫光子进行成像，这对实验人员有一定的辐射性，所以为了保证充分保证科研人员的安全，进行实验是需身穿铅衣来屏蔽射线。-23- 第4章ECLI光学成像系统对肝肿瘤的在体评估4.1引言为了对深层肿瘤组织的早期探测，实现高分辨率的病灶信息采集，本文采用了内窥技术与切伦科夫效应相结合的设计理念，构建了一套ECLI光学成像系统。其设计蓝图是在临床应用中，可以对活体的、深层次的病灶组织进行微创，甚至无创地光学探测。为此，我们构建了小动物肿瘤模型，通过表皮异种移植瘤以及原位异种移植瘤的模拟探测，来验证ECLI光学成像系统的初步生物应用可行性。为了证明实验结果的科学性，我们亦对实验对象进行传统的切伦科夫图像采集，并将两种成像模式的采集数据进行量化并线性化拟合。同时，在实验过程中，我们将术中成像应用于肿瘤切割过程中，以此来模拟临床的手术导航。4.2在体生物实验的设计方案病灶信息检测大体分为皮下肿瘤组织检测与原位肿瘤组织检测。皮下采集实验可以忽略光子散射、活体组织吸收等因素的影响，对成像系统的分辨率要求不高。原位肿瘤组织检测大都在腹腔、肠道内，给图像采集过程产生了很多不利因素，因此对成像系统的分辨率要求较高。本文首先设计了皮下肝癌异种移植瘤模型的图像采集实验，以验证ECLI光学成像系统的活体病灶信息的采集能力。更为重要的是，我们设计了原位肝癌异种移植瘤的检测实验，其对于攻克深层肿瘤组织成像难题有重大意义。除此之外，我们利用术中成像过程来指导病灶切除。4.2.1肿瘤模型的构建实验癌细胞采用人原肝癌细胞，使用含有10%的胎牛血清混合DMEM培养基进行传代培养。将细胞置于37℃恒温培养箱中，保持5%的CO2供给量。实验对象为6-8周雄性BALB/c裸鼠，在军事医学院实验动物中心处购买。动物实验严格按照《军事医学科学院实验动物饲养与使用委员会》的规定实施。根据实验设计方案，需要构建两种肿瘤模型，即皮下肝癌异种移植瘤模型与原位肝癌异种移植瘤模型。对于前者，将75ul的1×106cells/ml肝癌细胞注射入实验裸鼠的右前肢皮下；对于后者，首先对实验裸鼠进行剖腹手术，暴露出肝脏部-24- 位，将50ul的1×105cells/ml肝癌细胞注射入肝部选定的区域，然后将伤口缝合。所有构建的裸鼠肿瘤模型被饲养2周，即用于实验。4.2.2图像采集流程实验所需的传统切伦科夫荧光图像由精诺真系统(IVIS200,CaliperLifeSciences,USA)来采集。内窥式切伦科夫荧光图像由ECLI光学成像系统采集，其采集流程如下：连接成像系统各个硬件部分，开启降温设备，将实验对象放置成像平台上固定，待成像系统温度稳定在-95℃时，开始图像采集。所有的采集参数通过控制元件设置，采集过程中，严格进行封光处理。对实验对象依次进行白光图像与切伦科夫荧光图像采集。对于白光图像，开启外置光源，曝光时间设置为0.05s，关闭电子倍增；对于切伦科夫荧光图像，关闭外置光源，曝光时间设置为300s，电子倍增值设置为800，binning值设置为4。最后，将采集到的切伦科夫荧光图像进行伽马光子滤除，直接与白光图像叠加，最终得到切伦科夫配准图像。4.2.3皮下异种移植瘤的检测为了对ECLI光学成像系统关于活体皮下异种移植瘤的检测能力进行评估，构建18只皮下肝癌异种移植瘤模型作为实验对象。每只肿瘤模型通过尾静脉注射浓度为300μCi、总容量为75μl的18F-FDG。经过35分钟的体内代谢，切伦科夫荧光图像使用精诺真系统来采集，随后使用ECLI光学成像系统采集内窥式切伦科夫荧光图像。其中，白光图像与切伦科夫荧光图像采集流程及参数参照上一节所述。最后，对采集后的切伦科夫荧光图像绘制感兴趣区域，通过计算感兴趣区域内的光子数来量化分析内窥式切伦科夫荧光成像模式的鲁棒性。4.2.4基于切伦科夫术中图像的皮下肝肿瘤切除基于皮下肝癌异种移植瘤模型的内窥式切伦科夫荧光图像，肝肿瘤将被手术切除。其流程如下：首先为了便于手术的顺利进行，覆盖皮下肝肿瘤的皮肤被切除，然后使用ECLI光学成像系统对裸露的肿瘤部位进行成像；分析采集结果，在荧光图像中绘制出肿瘤轮廓，以其为标准，将皮下肝肿瘤手术切除并对肝肿瘤进行单独成像；为了验证内窥式切伦科夫荧光图像所示的切伦科夫信号来源与肝肿瘤相吻合，将切除下来的肝肿瘤组织与切除后的身体部位进行成像。4.2.5原位异种移植瘤的检测与切除构建6只原位肝癌异种移植瘤模型用于此部分实验。图像采集前40分钟，-25- 每只肿瘤模型通过尾静脉注射浓度为600μCi、总容量为50μl的18F-FDG。待葡萄糖在体内充分代谢后，开始图像采集实验。为了对比传统切伦科夫荧光成像与内窥式切伦科夫荧光成像在深层肿瘤组织成像方便的优劣，首先使用精诺真系统对肿瘤模型进行成像，得到切伦科夫荧光图像。随后，实验所用肿瘤模型在麻醉条件下进行微创地剖腹手术，将肝脏部位暴露出，处理干净血迹，确保流出血液发射的切伦科夫信号不会影响到实验结果；调整ECLI光学成像系统的成像视野，置肝脏部位于视野中央并保持精准对焦；保证1.2cm的成像距离，完成图像采集。得到内窥式切伦科夫荧光图像后，绘制出原位肝肿瘤轮廓，并将其切除。4.3实验结果及讨论分析皮下肝癌异种移植瘤模型检测实验结果如下图所示。通过精诺真系统采集到的CLI图像可以明显地看出小鼠右上肢的切伦科夫荧光信号，白光图像与切伦科夫荧光图像叠加后，切伦科夫荧光信号区域与皮下肝肿瘤实际位置相吻合(黑色箭头所示)。此结果可以说明18F-FDG注入小鼠体内，经过一段时间的代谢，其在皮下肝肿瘤处汇聚并产生了的切伦科夫辐射。图4-1皮下肝肿瘤检测结果Fig.4-1DetectionofsubcutaneousHCCtumor随后，ECLI光学成像系统继续对这只小鼠进行肿瘤检测。通过调整实验平台高度及腹腔镜镜头位置，使得小鼠的皮下肝肿瘤置于ECLI光学成像系统中央并保持准确对焦。得到ECLI图像如下图第二行数据所示，相对于传统切伦科夫-26- 成像，使用内窥技术使得成像距离大大地缩短，视野扩大，皮下肝肿瘤充斥整个成像视野。图像中红色虚线勾勒出切伦科夫荧光信号密集区域，可以说明ECLI光学成像系统检测到了来自皮下肝肿瘤的切伦科夫信号。为了验证其统计学意义，18只小鼠根据皮下肝肿瘤大小分为6组，每组为三只肿瘤大小相近的小鼠，重复进行上述实验。图像采集结束后，分别在CL图像与ECL图像中绘制感兴趣区域。由于每一组中小鼠的皮下肝肿瘤尺寸相近，在切伦科夫荧光图像中绘制面积大小相同的感兴趣区域。通过软件计算区域内的光子数，经过量化分析得到图4-2结果。其中横坐标代表ECL图像中感兴趣区域内的光子数，纵坐标代表CL图像中感兴趣区域内的光子数，6组数据经过线性拟合，使用传统CLI得到皮下肝肿瘤的切伦科夫信号与使用ECLI光学成像系统得到皮下肝肿瘤的切伦科夫信号具备线性关系(R2=0.931)。此结果说明了我们设计并研制的ECLI光学系统与如今市场中已经广泛应用于小动物成像研究的精诺真系统在皮下肝肿瘤检测中性能相当。综上所述，ECLI光学成像系统可以如实地反映出活体皮下肝肿瘤发射的切伦科夫荧光信号，其具备检测活体皮下肝癌异种移植瘤的能力。图4-2量化分析Fig.4-2QuantificationofCerenkovsignals为了模拟临床生物应用的手术导航过程，基于内窥式切伦科夫图像的术中成像实验也是本研究的重要内容之一。图4-3、4-4中的图像数据详细记录了皮下肝肿瘤切除的过程。首先对小鼠肿瘤模型进行CLI成像，通过下图可知，位于小鼠右上肢的皮下肝肿瘤对18F-FDG产生了大量的摄取。在此基础上，使用ECLI光学成像系统指导小鼠的肿瘤切除。为了便于采集切伦科夫荧光信号，小-27- 鼠在麻醉的条件下，将包裹肝肿瘤的皮肤剥离，调整视野范围，对肿瘤部位成像。在内窥式切伦科夫图像中，我们可以得到皮下肝肿瘤范围的切伦科夫荧光信号，如图4-3中的红色虚线，在整个皮下肝肿瘤的部位中，ECLI光学成像系统采集到了明显的切伦科夫荧光信号。根据colorbar可知，信号较强的部分位于皮下肝肿瘤的中心部分，距离中心越远的肿瘤组织，其切伦科夫信号越弱，由此可知，该皮下肝肿瘤生命力非常旺盛，没有坏死组织，适用于肿瘤切除实验。依据切伦科夫荧光信号的分布范围，红色虚线内的肿瘤组织将作为术中切除手术的重要依据。图4-3皮下肝肿瘤切除手术的预实验Fig.4-3PreliminaryexperimentofsubcutaneousHCCresection根据内窥式切伦科夫荧光信号的分布范围，确定了皮下肝肿瘤的边界。在切除手术之前，准备好小动物手术专用用具，包括小型手术剪，止血棉花，手术镊等。在浓度为1%(1g/100ml)的戊巴比妥钠麻醉条件下，实行手术切除。随后，使用ECLI光学成像系统对脱离小鼠机体的肝肿瘤进行成像，其结果如图4-4。从图像数据中，我们可以看到切割下来的肝肿瘤组织依然分布了大量的切伦科夫荧光信号，由此可以确认被切割下来的机体组织为肝肿瘤组织。为了验证皮下肝肿瘤切除手术的成功性，我们对切割下来的肿瘤组织与小鼠机体切除部位在同一成像视野中进行内窥式切伦科夫荧光成像，图4-4中第二行图像数据为此次成像结果。我们发现切伦科夫荧光信号完全分布在切割下的皮下肝肿瘤的位置，而经历了切除手术后的小鼠机体则只是残留了较弱的切伦科夫荧光信号，这些信号可以解释为机体渗出的微量血液所致。随着手术的进行，组织-28- 内的18F-FDG不断进行衰变，另一方便切伦科夫荧光不断地被组织吸收，导致了肿瘤组织内的光子数减少。即使有这些客观因素存在，实验结果依然非常乐观，其证明了ECLI光学成像系统采集到的切伦科夫荧光信号来源皮下肝肿瘤组织，并且基于信号分布，完成了基于内窥式切伦科夫荧光图像的皮下肝肿瘤实验。皮下肝癌异种移植瘤的一系列实验均得到了积极的结果，这使得我们对原位肝癌异种移植瘤实验结果有了一定的信心。图4-4皮下肝肿瘤切除手术Fig.4-4SurgeryofsubcutaneousHCCtumorresection基于内窥技术的切伦科夫荧光成像模式相对于传统切伦科夫荧光成像有一系列优势。由18F-FDG衰变而产生的切伦科夫荧光主要集中在400-600nm的波长范围内，属于蓝紫波段，其较易被生物体组织吸收，这给传统的切伦科夫荧光成像系统带来了很大的限制。而ECLI光学成像系统采用内部结构为棱镜结构的腹腔镜来传导切伦科夫光子，其物理结构的优势允许成像系统以微创、甚至无创的方式靠近探测组织，并且保持准确的对焦。这些因素保证了ECLI光学成像系统对深层生物体组织发出的切伦科夫荧光光子的采集量，减少了其在物理空间上的损失。因此，对于深层肿瘤组织的成像，ECLI光学系统能达到的分辨率更高，数据采集更精确。攻克深层组织成像的难题，是我们本篇文章的主要研究对象，因此设计原位肝癌异种移植瘤的探测与切除实验是一次全新的尝试与突破。同时，这也是切伦科夫荧光成像走向临床应用的必经之路。原位肝癌异种移植瘤模型接受尾静脉注射示踪剂后，经过一段时间的体内代谢，首先对其进行传统切伦科夫荧光成像，其结果由图4-5所示。我们在图-29- 像数据中没有得到有意义的切伦科夫荧光信号，也没有得到关于原位肝肿瘤的机体分布信息。根据前文所述的传统切伦科夫成像模式缺陷的理论分析结合实际实验结果可得，传统切伦科夫成像无法解决活体深层肿瘤组织的检测。随后，使用我们研制的ECLI光学成像系统对小鼠肿瘤模型进行成像。由于原位肝肿瘤位于腹腔内，在成像检测前，小鼠要先进行微创地开腹手术，使得整个肝部可以暴露在成像视野内。然后使用手术夹将切口撑开，保证腹腔镜的镜头端可以深入小鼠腹腔内并对肝脏部分进行成像。其结果是鼓舞人心的，内窥式切伦科夫荧光图像中，我们在肝部异常组织部位采集到了切伦科夫荧光信号。这些有意义的信号反映出了一些异常肝组织的信息，从colorbar信息条我们可以看出，收集到的光子数量控制在极小的范围内，反映在机体肝肿瘤分布上则为信噪比不够高，但ECLI光学成像系统依然区分出了切伦科夫信号区域，并且信号在异常组织中心极强，边缘则极弱。这些信息可以推断出此异常组织为原位肝肿瘤。图4-5活体原位肝肿瘤的探测Fig.4-5DetectionoforthotopicHCCtumor为了确认出完整的原位肝肿瘤边界，我们调整成像视野，将初步探测到切伦科夫荧光信号的组织部位置于成像视野中央并进行二次成像，其结果如图4-6所示。由于成像视野清晰，成像距离减少，我们在荧光图像中发现了肿瘤边界更为清楚的信号分布，由红线圈出。为了验证ECLI光学成像系统得到的结果，我们需要对异常肝组织进行手术切除，使用H&E染色进行病理确认。该实验小鼠被安乐死后，通过荧光图像确认的异常组织边界将其切除。切下来的组织马上进行染色并制成冰冻切片并在电子显微镜中观察，其结果见图4-6第二行数-30- 据。使用电子显微镜放大100倍后的组织细胞，经过肝胆科专家验证，其细胞形态单核，体积大于正常组织细胞，上色较深，可以断定为肝肿瘤细胞。综上所述，通过成像结果所得到的切伦科夫荧光信号分布，指导了我们对在体原位肝肿瘤的成功切除。图4-6原位肝肿瘤的手术切除Fig.4-6SurgeryoforthotopicHCCresection4.4本章小结本章主要描述了生物在体实验的流程与结果分析，评估了ECLI光学成像系统关于在体肿瘤检测和切除的性能。根据实验设计，在体生物实验分为两部分，皮下肝肿瘤的检测与切除、原位肝肿瘤的检测与切除。皮下肝肿瘤的检测实验结果验证了ECLI光学成像系统在活体肿瘤检测方面的鲁棒性。基于此，我们又模拟了手术导航的过程，利用ECLI光学成像系统的图像数据指导手术切除肿瘤组织。这一部分的意义在于模拟临床应用，向实际的临床状况靠拢。原位肝肿瘤的检测是创新性的一步，鉴于CLI成像模式在生物体中的局限性，近年来，一直没有在深层肿瘤组织检测方面有所突破。我们的ECLI光学成像系统完成了小动物肝肿瘤的检测，加快了ECLI成像模式走向实际生物应用的步伐。同时，原位肝肿瘤的切除也展现了系统的实际应用性和临床应用的潜力。我们研究内窥式切伦科夫荧光成像的最终目的是推动光学显像系统能够走向临床应用。鉴于腹腔镜的物理结构，能够微创、甚至无创地介入深层肿瘤组织并完成显像。人类机体的构造能够为ECLI成像营造一个天然的暗室，可以有效地避免了自然光线对成像结果的干扰。这些因素可以推测我们设计并研制的-31- ECLI光学成像系统有很好的临床前景。然而，还有一些问题需要去解决。人体注射放射性核素后，其分布量很大，聚集在肿瘤部位的信号值较低，这造成了低的信噪比，不利于实验结果分析，所以进一步提高系统的分辨率是一个技术难点。另外，腹腔镜虽然可以近距离地对肿瘤组织成像，最大限度地收集切伦科夫光子，但是光在腹腔镜内部传播过程中也会产生一部分损耗，如何降低这些光子损失量是提高图像质量的突破口。在软件方面，采用全新的算法来过滤噪声并提高提取有效切伦科夫光子的能力也可以完成分辨率的提升。-32- 结论切伦科夫荧光成像技术近来受到了广泛的关注，这种成像模式的迅猛发展使科研学者们意识到可以利用光学成像设备来完成高灵敏度的肿瘤探测。但是切伦科夫成像也有其自身的限制，信号弱、易被生物组织吸收等因素依然阻止其进入临床应用领域。本研究针对深层肿瘤组织成像问题，使用内窥技术与传统的切伦科夫荧光成像相结合，通过高灵敏度的EMCCD科学相机，搭建内窥式切伦科夫荧光成像系统尝试解决此类问题。在完善成像系统后，一系列肝肿瘤的在体实验评估了内窥式切伦科夫荧光成像系统的各方面性能，结果展示，其不仅能够完成皮下、原位的肝肿瘤在体检测，在术中成像指导肿瘤切除方面也有良好的表现。这些数据说明了内窥式切伦科夫荧光成像系统在临床应用方面拥有良好的前景，我们希望未来切伦科夫荧光成像模式会给临床问题带来更好的解决方案。本研究在构建内窥式切伦科夫荧光成像系统方面主要分为两部分工作，现概括如下：1、系统构建。通过设计并构建成像系统的硬件部分与软件部分，完成一套具有高灵敏度的光学成像系统。其中硬件系统又包括了四个模块应用，本研究详细描述了各个模块的设计过程与主要功能。在硬件完善的基础上，我们实现了系统软件方面的相关设计，实现snake算法提高了输出图像数据的可分析性。2、在体实验评估。我们利用人原肝癌细胞构建了皮下、原位小动物肿瘤，意在评估内窥式光学成像系统在皮下、原位肝肿瘤的检测能力。皮下肿瘤探测实验是传统的切伦科夫成像设备能够实现的，我们将内窥式的成像系统与传统成像系统的数据进行了线性拟合，得到了很好的一致性，说明了该系统的性能可以支持活体肿瘤组织成像。原位皮下肿瘤检测，即深层肿瘤组织检测，是现有成像系统很难解决的问题，我们使用研制的成像系统完成了对其的检测与切除，体现了该系统在深层肿瘤组织检测方面的优势。但是，该系统还存在着一些不足，临床过渡还需要更高的分辨率。硬件方面，腹腔镜的内部棱镜可以优化以降低正在传导的切伦科夫光子损失量；软件方面，效率更高的算法去提取荧光图像中的切伦科夫光子也是极其必要的。-33- 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攻读硕士学位期间发表的学术成果学术论文[1]ChengpengBao,XiaLiu*,MuhanLiu,ChaotingZeng,TianmingSong,HaixiaoLiu,YaweiQu,XiaojunZhang,ZhenhuaHu*,JieTian*.EndoscopicCerenkovluminescenceimagingofmicebearinghepatocellularcarcinoma．NuclearMedicineandBiology.[2]包成鹏,刘侠,胡振华,等.高灵敏度契伦科夫发光成像系统的构建与初步应用[J].中国体视学与图像分析,2015(2):108-114.[3]TianmingSong,ChengpengBao,ZhenhuaHu,KunWang,XiaLiu*,JieTian*.EndoscopicCerenkovluminescenceimaging:invivosmallanimaltumormodelvalidation,SPIEMedicalImaging.[4]SongT,BaoC,HuZ,etal.EndoscopicCerenkovluminescenceimaging:invivosmallanimaltumormodelvalidation[C]//SPIEMedicalImaging.InternationalSocietyforOpticsandPhotonics,2015:94172U-94172U-6.[5]ZhenhuaHu,YaweiQu,KunWang,XiaojunZhang,JialiZha,TianmingSong,ChengpengBao,HaixiaoLiu,ZhongliangWang,JingWang,ZhongyuLiu,HaifengLiu,JieTian.Invivonanoparticle-mediatedradiopharmaceuticalexcitedfluorescencemolecularimaging.NatureCommunication,2015,6.专利[1]发明人：刘侠，包成鹏，宋天明，王波，郭凌宇，一种基于契伦科夫效应的内窥式手术导航系统和方法，国家发明专利，受理号：201510132934.5-38- 致谢时光飞逝，转眼间两年半的研究生涯接近尾声。回忆这两年多的学习生活，收获颇丰、感慨颇丰。这一阶段的学习、锻炼使我在生活上、学习中都取得了长足的进步，对于我来说，这两年来所经历的事是我一生的宝贵财富。第一次接触科研工作，全新的研究方向，高平台的学习环境使我热血沸腾，我不断地阅读文献，不断地实验，期间有收获的喜悦，也有失败的悲伤。两年如一日，不断地学习扩大了我的视野，丰富了我的文化，也培养了我团结协作的团队精神。这些宝贵的经验让我慢慢走向成熟，再不是那个懵懂、淘气的男孩，而是成长成了一位有责任、有底蕴的男人。首先我要感谢我的恩师刘侠教授，我最尊敬的长辈。您是我人生路上的领航人，您不仅指引我的学习方向，在为人方面更是我的榜样。研究生生活刚刚开启的时候，是我人生中最迷茫的阶段，是您不断地鼓励我，使我又重燃信心。您还将我作为交换生送到中国科学研自动化研究所学习，让我在更高的学习平台中历练。谢谢您，您的教诲与鼓励让学生终身受益！我还要衷心的感谢田捷教授，这位分子影像界的学术泰斗，使我在中科院自动化所学习期间受益匪浅。您不仅给我提供了非常优秀的科研平台，在生活中也提供为我提供了温暖。通过在您的实验室学习，让我的知识量有了爆发式的增长。不仅如此，您教育我的人生哲理，成了我日后学习、生活中的标杆，做人做事做学问，是您给予了我新的人生方向，让我度过了充实的研究生生涯！感谢胡振华老师在科研方面的点拨与生活上无微不至的关怀与照顾，让我以最快的速度融入到切伦科夫小组这个团体中去。同时，还要感谢王波老师、曹宇老师对我学习上的帮助，感谢王坤老师、杨鑫老师、徐敏老师、王丽老师、杜洋老师等，对我生活上细致入微的照顾。感谢实验室的宋天明、刘海啸、刘沐寒师兄在我实验上的协助，使得我有更多的经验和意见来不断完善自己研究。感谢汪俊、唐振超、张爽、郭凌宇同学对我生活上的帮助和陪伴，正是因为有了你们，这两年多的生活才更加的多姿多彩。还要感谢卢佳祁、刘木涵、张泽宇、王楠、张哲同学对我课余生活的帮助，我们在一起的时光是我最美好的一段记忆。最后还要感谢我的父母，感谢你们的支持，对于每一个重要的决定，你们都给予了我宝贵的意见，正是有了你们，我才有了最坚实的后盾，让我勇往直前！-39-