《姜黄素的抗氧化性及对猕猴桃病原菌抑菌效果研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
。公开：１０３５９单位代码密级：９３１２３学号：２０１５１１１分类号：ＱＨｅｆｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ硕士学位论文ＭＡＳＴＥＲＳＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ学术硕士）（论文题目：姜黄素的抗氧化性及对猕猴桃病原菌抑菌效果研究学科专业：微生物学作者姓名：王晓芙导师姓名：刘永胜教授完成时间：２０１８年４月一－卜 合肥工业大学本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合合肥工业‘。大学学历硕士学位论文质量要求．答辩委员会签名（工作单位、职称、姓名）主席：安徽大学教授委员：合肥工业大学教授合肥工业大学教授合＾肥工业大学副教授＾丨合肥工业大学副教授导师：合肥工业大学教授１■Ｉ 学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行独立研究工作所。，取得的成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的内容外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得合肥工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文成果做出贡献的个人和集体，本人已？，。在论文中作了明确的说明并表示谢意：。学位论文中表达的观点纯属作者本人观点，与合肥工业大学无关学位论文作者签名：ｉ滅签名曰期：於／８年午月／ｒ曰本学位论文作者学位论文版权使用授权书完全了解合肥工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：除保密期内的涉密学位论文外，学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子光盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权合肥工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，允许采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。学（保位密的学位论文在解密后适用本授权书）签论文作者签名：ｉ指导教师签名：名日期：＞〇以年士月日签名日期日论化工文作者毕业去向Ｉ．作单位：通联讯系地电话址：Ｅ－ｍａｉｌ：：邮政编码： 单位代码：10359密级：公开学号：2015111123分类号：Q93HefeiUniversityofTechnology硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION（学术硕士）论文题目：姜黄素的抗氧化性及对猕猴桃病原菌抑菌效果研究专业名称：微生物学作者姓名：王晓芙导师姓名：刘永胜完成时间：2018-04-15 合肥工业大学学历硕士学位论文姜黄素的抗氧化性及对猕猴桃病原菌抑菌效果研究作者姓名：王晓芙指导教师：刘永胜学科专业：微生物学研究方向：微生物代谢及调控2018年4月 ADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterResearchonAntioxidantactivityofcurcuminanditsinhibitoryeffectonPathogensofkiwifruitByWangXiaofuHefeiUniversityofTechnologyHefei,Anhui,P.R.ChinaApril,2018 致谢本研究论文的完成首先要感谢我的导师刘永胜教授，在刘老师的悉心指导下才顺利完成了现在的这篇论文。在此，向我的导师刘永胜教授表示最真诚的敬意和由衷的感谢。在学术上，刘老师的基因工程知分子生物学专业知识十分渊博，他对科研始终充满了极大的热情，时刻保持着认真严谨的态度，这让我在三年的研究生学习生涯中受益匪浅。刘老师不仅为我提供了优越的科研和学习环境，同时在人生态度和意志品质等方面给予我谆谆教诲，也将是我一生学习的榜样。特别感谢张丹凤老师，三年来，在我实验理论、方法知识上给了我极大的帮助，在实验设计和实验开展上给了我莫大的指导，在我的论文修改发表过程中给了我宝贵的意见，让我醍醐灌顶。在张老师耐心的演示和指导下，我的实验技能得到了极大的提高，我的实验和论文能够顺利完成与张老师的帮助是分不开的。感谢牛向丽老师、唐晓凤、苗敏、陈丹阳师姐、汪洪涛师兄等在实验过程中给予的帮助，在此表示最真诚的感谢。感谢同届的胡鑫、季春燕、周宇，我的师妹花晨艳、师弟开凯，以及我的室友贺云、李婷婷、王伟艳。在我的实验遇到瓶颈时能够给予我鼓励和帮助，给我提供思路去克服困难，在我生活中遇到不顺时能够给予我关心，我们在一起的时光虽然短暂但却是难忘而最好的回忆。感谢合肥工业大学，感谢食品科学与工程学院给了我这么优秀的科研平台。最后，我要感谢我的父母。是你们不辞辛苦的付出，默默的支持和理解给了我前进的动力，没有你们的支持就没有我的今天，我人生中的每一点成果都倾注了你们无数的心血，在此，我深深地向你们鞠躬。衷心感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们！作者：王晓芙2018年4月9日I 摘要姜黄素作为一种新型的抗氧化剂，在果蔬保鲜、食品防腐、抗炎症等方面中有着广泛的应用。果蔬在采摘后最容易受到真菌病原菌的侵害导致其腐烂变质，其中拟茎点霉菌和灰霉菌是比较常见的真菌病害。本文中对拟茎点霉菌和灰霉菌分别选取4种不同浓度的姜黄素处理，主要研究了不同浓度的姜黄素在离体和活体培养条件下对2种病原真菌菌丝生长的抑制以及姜黄素对病原菌孢子萌发的抑制，研究了姜黄素处理后菌丝中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）累计水平，以及过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）等酶活性的变化，使用实时定量PCR检测处理过姜黄素的菌丝中致病相关基因和抗氧化酶编码基因的表达水平，从分子水平上分析姜黄素对病原菌产生抑制作用可能存在的分子机理。实验结果表明：姜黄素处理后的猕猴桃在接种病原菌孢子液后其发病率以及相同时间内病斑的直径均显著减小。离体培养下姜黄素对拟茎点和灰霉菌的菌丝生长、病原菌孢子萌发都具有显著性抑制作用，在一定范围内，随着姜黄素浓度的增加，抑制效果越明显。用姜黄素处理生长分化中的菌丝，其ROS累计水平显著降低，菌丝MDA含量也呈降低趋势，处理组的菌丝中抗氧化物酶的酶活性有显著上升。另外，在实时定量PCR中，经过姜黄素处理的灰霉菌菌丝的MAPK信号通路中的致病基因Bmp3和Sak1表达水平低于对照组；而SOD编码基因SOD1和NADPH的两个亚基编码基因10823和6200的表达水平均高于对照组。综合以上结果得出，姜黄素对于病原真菌生长的抑制可能是通过激活病原菌的MAPK信号通路，下调致病相关基因，从而实现一定范围内对菌丝生长和孢子萌发的抑制。关键词：姜黄素；拟茎点霉菌；灰霉菌；猕猴桃；MAPKII ABSTRACTCurcumin,asanewantioxidant,hasbeenwidelyusedinfruitandvegetablepreservation,foodpreservative,anti-inflammatoryandsoon.Thefruitsandvegetablesaremostvulnerabletothefungalpathogensafterpicking,BotrytiscinereaandPhomopsiswhicharethemostcommonfungaldisease.Inthispaper,fourdifferentconcentrationsofcurcuminwereusedtohandletheinhibitionofcurcuminonthegrowthofmyceliumoftwopathogenicfungiinvitroandinvivo，inhibitionofcurcuminonsporegerminationofpathogenicfungi.Theactivitiesofreactiveoxygenspecies(ROS),malondialdehyde(MDA)andtheactivitiesofperoxidase(POD),catalase(CAT),glutathioneperoxidase(GSH-Px)andsuperoxidedismutase(SOD)inthepathogenaftercurcumintreatmentwerestudied.RealtimequantitativePCRwasusedtodetecttheexpressionlevelofpathogenicgenesandantioxidantenzymegenesincurcumintreatedmycelium.Themolecularmechanismofcurcumininhibitiononpathogenicbacteriawasanalyzedfromthemolecularlevel.Theexperimentalresultsshowthat，theincidencerateandthediameterofdiseasespotofkiwifruittreatedwithcurcumindecreasedsignificantlyafterinoculationofpathogensporefluid.Curcumininhibitedthegrowthofmyceliaandpathogensporesandgerminationofpathogenicfungiinvitro.Inacertainrange,withtheincreaseofcurcuminconcentration,theinhibitoryeffectismoreobvious.TheaccumulativeROSlevelofmyceliumtreatedwithcurcumindecreasedsignificantly,andtheMDAcontentofmyceliumalsodecreased.Inaddition,inrealtimequantitativePCR,theexpressionlevelsofBmp3andSak1whichintheMAPKsignalingpathwayofBotrytiscinereamyceliumtreatedbycurcuminwerelowerthanthoseinthecontrolgroup.TheexpressionlevelsoftwosubunitofNADPHencodinggenes10823,6200andSOD1whichisSODencodinggenewerehigherthanthoseofcontrolgroup.ItisconcludedthatcurcumininhibitsthegrowthofpathogenicfungibyactivatingtheMAPKsignalingpathwayofpathogenicfungianddown-regulatingthepathogenicityrelatedgenessothathyphalgrowthandsporegerminationcanbecontrolledtoacertainextent.Keywords:Curcumin；Botrytiscinerea；Phomopsis；kiwifruit；MAPKIII 目录第一章文献综述...........................................................................................................11.1猕猴桃采后常见病害.........................................................................................11.1.1猕猴桃概况................................................................................................11.1.2猕猴桃的食疗价值....................................................................................11.1.3猕猴桃采后常见真菌病害........................................................................11.2灰霉和拟茎点病原菌..........................................................................................21.2.1拟茎点霉菌生物学特性及其研究进展....................................................21.2.2灰霉菌生物学特性及其研究进展............................................................21.3果蔬采后保鲜技术研究进展..............................................................................41.3.1化学保鲜技术............................................................................................41.3.2物理保鲜技术............................................................................................41.3.3生物保鲜技术............................................................................................51.4姜黄素及其抑菌机理的研究现状......................................................................61.4.1姜黄素简介................................................................................................61.4.2姜黄素的提取方法....................................................................................71.4.3姜黄素的抗氧化作用................................................................................71.4.4姜黄素的抗炎作用....................................................................................81.4.5姜黄素的防腐作用....................................................................................81.5ROS的检测机理.................................................................................................81.6本课题研究的目的和意义..................................................................................9第二章材料与设备.....................................................................................................112.1实验材料............................................................................................................112.1.1猕猴桃......................................................................................................112.1.2病原真菌..................................................................................................112.1.3姜黄素......................................................................................................112.2常用试剂与仪器...............................................................................................112.2.1常用生化试剂..........................................................................................112.2.2主要仪器与设备...................................................................................122.2.3常用试剂盒..............................................................................................132.2.4常用试剂配方和配置方法......................................................................13第三章病原菌分离纯化鉴定.......................................................................................173.1猕猴桃病原菌的分离和纯化............................................................................17IV 3.2病原菌的回接....................................................................................................173.3病原菌的鉴定....................................................................................................173.3.1CTAB提取液的配制...............................................................................173.3.2病原菌DNA的提取...............................................................................173.3.3PCR扩增.................................................................................................183.3.4琼脂糖凝胶的制备..................................................................................183.3.5电泳..........................................................................................................193.3.6测序..........................................................................................................193.4实验结果............................................................................................................19第四章姜黄素对猕猴桃发病情况的影响...................................................................214.1不同浓度姜黄素对病原菌在猕猴桃上生长的影响........................................214.1.1不同浓度姜黄素溶液的选择和配置......................................................214.1.2猕猴桃接种病原菌的处理......................................................................214.2实验结果............................................................................................................214.2.1姜黄素处理对猕猴桃果实上拟茎点霉菌的抑制.................................214.2.2姜黄素处理对猕猴桃果实上灰霉菌的抑制.........................................23第五章姜黄素对病原菌的作用...................................................................................255.1姜黄素对病原菌生长情况的影响....................................................................255.1.1姜黄素对病原菌菌落扩展的影响..........................................................255.1.2姜黄素对病原菌孢子萌发的影响..........................................................255.1.3姜黄素对病原菌菌丝ROS累积的影响................................................255.1.4姜黄素对病原菌菌丝中MDA含量和POD活性的影响.....................265.1.5姜黄素对病原菌菌丝中CAT活性的影响.............................................275.1.6姜黄素对病原菌菌丝中GSH-Px活性的影响.......................................275.1.7姜黄素对病原菌菌丝中SOD活性的影响............................................275.2菌丝组织RNA的提取和mRNA的反转录...................................................285.2.1灰霉菌菌丝中RNA的提取....................................................................285.2.2灰霉菌菌丝cDNA的反转......................................................................295.3实时定量PCR检测菌丝中相关基因的表达...................................................305.4实验结果............................................................................................................315.4.1姜黄素对扩展病原菌菌落扩展的抑制..................................................315.4.2姜黄素对拟茎点霉菌和灰霉菌孢子萌发的抑制..................................335.4.3姜黄素对病原菌ROS累积水平的影响................................................345.4.4姜黄素对病原菌MDA和POD水平的影响.........................................36V 5.4.5姜黄素对病原菌CAT活性的影响.........................................................375.4.6姜黄素对病原菌GSH-Px活性的影响...................................................385.4.7姜黄素对病原菌SOD活性的影响........................................................395.4.8姜黄素处理对灰霉菌中Bmp3和Sak1基因的影响.............................395.4.9姜黄素处理对灰霉菌中SOD1、10823和6200基因的影响..............40第六章结论与讨论.......................................................................................................426.1结论....................................................................................................................426.2讨论....................................................................................................................43参考文献.........................................................................................................................44附录1..............................................................................................................................52附录2..............................................................................................................................53攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况.................................................................54VI 插图清单图1.1植物感染拟茎点霉菌症状图.....................................................................2图1.2灰霉菌侵染植物过程图.............................................................................3图1.3姜黄素的分子结构图.................................................................................6图3.1病原菌的菌落形态...................................................................................20图3.2病原菌回接猕猴桃的发病情况...............................................................20图3.3病原菌的ITS扩增电泳图.......................................................................20图4.1姜黄素对接种拟茎点霉菌的猕猴桃发病情况的影响...........................22图4.2姜黄素对接种灰霉菌的猕猴桃发病情况的影响...................................24图5.1姜黄素对病原菌菌落扩展的抑制...........................................................32图5.2拟茎点霉菌在不同浓度姜黄素的PDA培养基的生长状态.................33图5.3灰霉菌在不同浓度姜黄素的PDA培养基的生长状态.........................33图5.4病原菌的孢子形态...................................................................................34图5.5姜黄素处理对病原菌孢子萌发率的影响...............................................34图5.6病原菌菌丝组织中活性氧的累积...........................................................36图5.7不同浓度姜黄素对病原菌菌丝MDA含量和POD活性的影响..........37图5.8不同浓度姜黄素对病原菌菌丝CAT活性的影响..................................38图5.9不同浓度姜黄素对病原菌菌丝GSH-Px活性的影响............................38图5.10不同浓度姜黄素对病原菌菌丝SOD活性的影响.................................39图5.11灰霉菌菌丝Bmp3/Sak1基因的相对表达水平.......................................40图5.12灰霉菌菌丝SOD1/10823/6200基因的相对表达水平...........................41VII 插表清单表2.1主要试剂...................................................................................................11表2.2仪器和设备...............................................................................................12表2.3常用试剂盒及用途..................................................................................13表2.4PDA培养基配方......................................................................................14表2.550×TAE缓冲液...........................................................................................14表2.650×TE缓冲液.............................................................................................14表2.76×DNA上样缓冲液....................................................................................15表2.81MTirs-HCl缓冲液..................................................................................15表3.1PCR反应体系...........................................................................................18表3.2PCR扩增程序.............................................................................................18表5.1牛血清蛋白标准曲线的绘制.....................................................................28表5.2RT-qPCR反应体系...................................................................................30表5.3RT-qPCR反应程序...................................................................................30表5.4用于扩增Bmp3/Sak1和SOD1/10823/6200基因的寡核苷酸引物.........31VIII 第一章文献综述第一章文献综述1.1猕猴桃采后常见病害1.1.1猕猴桃概况水果是有益于人体健康的一类食物，其中含有丰富的维生素，是人们合理的膳食中不可或缺的一部分[1][2]。猕猴桃一直被称为“水果之王”，广受人们的偏爱。猕猴桃，雌雄异株的大型藤本植物，果实一般呈椭圆形，果皮表面覆盖绒毛，果肉为绿色或黄色。猕猴桃属下有54个种，21个变种，共约75个种下分类单元[3]。国内最常见的品种有红阳猕猴桃、中华猕猴桃、美味猕猴桃等。中国是猕猴桃的原产国，对猕猴桃的记载历史悠久。大约在两千年前，我国诗歌总集的《诗经》中提到的的“苌楚”，就是猕猴桃的古名。我国对猕猴桃有1300多年的人工栽培历史，大约在19世纪中旬被引种到国外，在20世纪70年代末，我国开始对猕猴桃进行资源开发研究和规模栽培，目前我国猕猴桃种植面积和产量均居世界首位。1.1.2猕猴桃的食疗价值猕猴桃果肉清香，水分丰富，食之酸甜可口。果实含有丰富的矿物质，它可以补充人们在体育运动后造成的电解质损失，是一种有效的天然电解质源，其中的维生素C含量更是在水果中名列前茅，并且在人体中的利用率高达94%，这对于坏血病有一定的预防和治疗作用。唐代的《本草拾遗》中也提到：“猕猴桃味咸温无毒，可供药用，主治骨节风，瘫痪不遂，长年白发，痔病，等等。”由此可见猕猴桃在当时已经被用作药物。心脏学家发现猕猴桃中的精氨酸可以有效改善和阻止血管中血栓的形成，其中的肌醇对于预防糖尿病和抑郁症也有一定的积极作用[4]。1.1.3猕猴桃采后常见真菌病害虽然我国猕猴桃产量丰富，品种繁多，但水果采后由于贮藏时间短，容易失水，在运输或销售中受到的机械损伤[5]等方面引起的生理失调[6]、病原菌的侵染，往往给猕猴桃产业带来惊人的经济损失，极大地限制了该产业的快速发展[7-10]。猕猴桃采后受到的病害通常有两种[11][12]：其一是生理性病害，主要由于非生物因素引起的，例如光伤害、低温伤害、营养失调、乙烯或二氧化碳气体伤害等，这些病害因子目前主要以预防措施为主；其二便是病原微生物的侵染，引起果实腐烂的病原菌主要有真菌和细菌。在猕猴桃中常见的真菌病害有软腐病、灰霉病、溃疡病、青霉病等，病原菌会通过一些坏死的组织或者机械损伤的伤口处快速侵入，引起果实病变。本文中主要研究的是灰霉菌和拟茎点霉菌。1 合肥工业大学硕士学位论文1.2灰霉和拟茎点病原菌1.2.1拟茎点霉菌生物学特性及其研究进展拟茎点霉属是半知菌亚门，腔孢纲，球壳孢目中的真菌属。该真菌属种类繁多，分布广泛，不同种间形态形似度较高[13]。拟茎点霉属没有宿主特异性,因此在许多染病植物中都能分离出该真菌菌属。Sutton[14]曾这样定义拟茎点霉属的形态学特征：载孢体的真子座质为黑色，含有两种类型分生孢子：甲(α)型分生孢子无色，单细胞，椭圆形，梭形或长椭圆形，含有2个油球；乙(β)型分生孢子单细胞、无色、呈线状，孢子的端部通常会有所卷曲，呈现出弯钩状。分生孢子梗无色，分枝；产孢细胞圆柱状，内壁芽生瓶体式，α型孢子更为常见。拟茎点病原菌通常会通过植物的叶片、枝条及果实进行侵染，根部的侵染不常见。主要会引起植被溃疡病、果腐病、软腐病、烂茎、叶片树皮坏死等病症，图1.1是果实和叶片被拟茎点霉菌侵染后发病的症状。图1.1植物感染拟茎点霉菌症状图Fig.1.1ThesymptomsofplantsareinfectedwithPhomopsis资料记载，在25~30℃的温度6.0的pH条件下最适宜拟茎点菌丝的生长，大约10天会产生深绿色的分生孢子器，随后逐渐转变为黑色，并在上端产生分枝，随之会有黄白色黏液分泌，分泌物中含有大量的分生孢子。罗利娟等[15]对8种拟茎点霉在纯培养的情况下其产孢条件进行了筛选和分析，发现拟茎点霉产孢以苜蓿煎汁+Czapek作为培养基，在22~25℃下，每天光照12h，pH值范围为5.6~6.8的条件下拟茎点霉产孢最佳。近些年来，拟茎点霉属的分子遗传机制日益受到关注。DanielJ等首次将绿色荧光蛋白转入葡萄中，获得的转基因植物致病性没有发生改变，这为研究真菌侵染宿主植物提供了有效的手段。Diogo等[16]通过卫星PCR的方式，结合形态、文化、分子和病原性数据，对杏仁树上混合真菌侵染进行分辨，有效区别出拟茎点霉属和其他两个真菌种属。这对于有效检测病原菌具有重大意义。1.2.2灰霉菌生物学特性及其研究进展灰霉菌又称灰葡萄孢菌，知菌亚门葡萄孢核盘菌属。分布广泛，在空气、水、土壤中皆可生存，具有广寄主性，目前并没有哪种植株对其具有抗性。灰霉对果2 第一章文献综述蔬、作物危害极大，在植物生长过程中就会感染引起叶片、花朵腐烂，收获后病原菌会侵入果肉，引起果实坏死[17]。灰霉生命力顽强，即便在0℃也可生存，可通过灰色的分生孢子进行传播，潜伏性高，繁殖速度快。灰霉菌侵染过程先是它在入侵植物表皮细胞的初期产生细胞壁降解酶和其他许多有毒性的次级代谢产物，进而穿透植物表皮细胞，并从植物的死细胞中吸取营养，以利于菌丝的进一步侵入，导致组织腐烂。在灰霉菌侵染植物的过程中，是在一个跨膜四蛋白的协助下穿透宿主植物的表皮细胞，并且同时生成一些由特定分化的菌丝形成的侵染结构，如侵染垫、侵染钉、附着胞和吸器等来帮助病原菌进一步入侵宿主并与宿主建立一种寄生关系。图1.2是灰霉菌侵染植被机体的过程图。图1.2灰霉菌侵染植物过程图[18]Fig.1.2TheprocessofBotrytiscinereainfectplants金海翎等曾在美国《科学》杂志上报告，已知的许多病原体都会携带并输送特殊蛋白质进入植物细胞内部中，以抑制植物体内的免疫防御机制，从而实现有效侵染的效果，而灰霉菌也会使用一种叫做小分子RNA的分子输送到植物细胞内部，抑制植物的免疫防御系统，更加方便地侵染植物，这些小分子RNA能够通过与宿主蛋白AGO1的结合，使得抗病防御基因相关“沉默”，从而让植物的免疫系统“失效”。这也是初次发现有病原菌利用小分子RNA来对植物进行有效侵染。近期，Ma等[19]发现了一种病原菌全新致病机制。研究对象为疫霉菌，发现在疫霉菌入侵植物的早期，疫霉菌从细胞中分泌出糖基水解酶XEG1，这种水解酶可以攻击植物细胞壁，而植物会利用自身的防御系统中的水解酶抑制子GIP1抑制3 合肥工业大学硕士学位论文XEG1的活性。在物种进化过程中，疫霉菌又获得了水解酶XEG1的突变体XLP1，这种突变体虽然不具备攻击性，但会干扰抑制子GIP1的识别并诱导GIP1与其结合，使糖基水解酶XEG1有机可乘，顺利地攻击植物的抗病系统。1.3果蔬采后保鲜技术研究进展水果采后保鲜的方法多种多样，不过百变不离其宗，保鲜机理离不开以下这三方面：一是抑制或减弱水果的呼吸作用，从而延缓水果的老化；二是改变贮存环境或者水果自身机理，减少水分的蒸发；三是通过控制微生物的生长。主要有化学、物理、生物三种方法进行防治[20][21]。1.3.1化学保鲜技术化学防治是目前使用最广泛的一种防治技术，将果蔬表面涂抹或喷上化学药剂，以达到杀死或抑制果蔬和环境中病原菌菌丝和芽管的生长，从而实现果蔬的保鲜。1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)是一环丙烯类化合物，为近年来发现的一种新型乙烯竞争性抑制剂，它能破坏乙烯的信号转导，与其受体蛋白结合，抑制其相关的一系列生理效应的发挥[22]。1-MCP具有高效、无毒、低量等优点，在果蔬保鲜上广泛的应用[23]。在室温条件下0.5μL/L的1-MCP处理‘华优’猕猴桃24h后，于2℃贮藏，能够显著降低果实低温贮藏过程中呼吸作用、乙烯释放速率，并且能够延缓果实硬度的下降以及可溶性固形物的上升[24]。二氧化氯（ClO2）消毒剂是国际上公认的高效、安全、广谱的灭菌剂[25]，也被世界卫生组织和世界粮食组织列为A1级安全高效绿色消毒剂[26]。它可以有效抑制病原微生物，并且不会使其产生抗药性[27][28]。二氧化氯不但能够吸附穿透微生物的细胞壁，还可以快速地抑制微生物中蛋白质的合成来破坏微生物的致病力。王亚萍等[29]通过50mg/L二氧化氯对‘徐香’猕猴桃进行处理，有效抑制了果实中丙二醛（MDA）含量的上升速率，较好维持了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性，猕猴桃的呼吸强度也有所减弱，有效保持了猕猴桃贮藏期间果实的品质，延缓其衰老速率。1.3.2物理保鲜技术物理防治方法主要是指通过低温、辐射、热处理等处理采后的果实，抑制或者杀灭病原微生物的活性从而提高果实的抗病性。低温冷藏保鲜是生活中最常见的一种保鲜技术[30]，低温可以降低果蔬的呼吸作用，减少热量的散失，抑制微生物的生长。将‘秦美’猕猴桃通过冷藏保鲜处理，6个月后，未变质果子比率髙于95%，果实硬度基本不低于4~6kg/cm2，并且4 第一章文献综述仍然可保持其特有的风味和口感[31]。冷藏保鲜具有成本低、无污染，但不适宜的低温也会很容易诱发冷害[32]。在辐射保鲜方法中，照射射线后的果实，生理代谢活动受到抑制[33][34]。对于跃变型果实而言，呼吸跃变有明显推迟。FAN等[35][36]用400Gy60Coγ射线处理青蕉苹果后第6天，呼吸跃变期呼吸强度的峰值只有未辐照果实的68.8%。而且，辐射处理后水果中碳水化合物的含量依旧非常稳定，HUSSAIN等[37][38]在用1.5～3kGyγ射线处理草莓后，总糖浓度和主要的糖类如D-果糖、D-葡萄糖以及D-蔗糖的浓度都明显变化，酸度和挥发性成分含量也均无变化。热处理也是一种有效的果蔬保鲜方法[39-41]。CHEN等[42]研究了在热水处理45℃，10分钟的条件下有效地抑制了猕猴桃中灰霉菌和青霉菌的孢子萌发和芽胞管的延伸，热水处理使过氧化氢酶和过氧化物酶的活性显著增加，酚类化合物的含量也有所上升，并且不影响水果的质量。有效地替代了化学保鲜方法。1.3.3生物保鲜技术生物保鲜技术是21世纪新兴的一种保鲜技术，是使用某些天然物质，其具有抑菌杀菌功能的，通过浸泡、喷淋或涂膜等方式对生鲜食品进行处理，通过抑制或杀灭食物中的微生物、隔离食品避免与空气的直接接触、以及氧化作用的延迟等进而达到防腐保鲜的效果[43]。果蔬的生物保鲜技术包含利用微生物拮抗保鲜、天然提取物的保鲜、基因技术保鲜3种方法[43]。使用微生物拮抗方法进行保鲜的主要机理是其可以产生溶菌霉、抗生素、蛋白酶、有机酸和过氧化氢等，改变了所处环境的pH值[44]。这种具备拮抗作用的微生物菌可以改变环境条件或者分泌一些物质有效抑制或直接杀死果蔬中的有害微生物，或与在果蔬中的有害微生物竞争果蔬中一些营养物质，有效避免果蔬储存期间其维生素C、可溶性固形物、还原糖等含量的下降，从而达到防腐保鲜的目的[43]。通过利用菌体的次生代谢产物或直接利用微生物菌体和抗菌肽对食品实施保鲜处理，具有无味、无色、无害、无毒等特点[45][47-48]。Scan等[46]曾利用乳酸球菌DPC3147次生代谢产物乳酸菌3147作为保鲜剂，替代亚硫酸钠对食品进行保鲜。天然提取物是利用从天然物质中提取的无毒无害的生物活性物质，通过抑制果蔬表面有害微生物的活性，从而减轻微生物对果蔬的伤害[43]，实现绿色保鲜的效果和目标。壳聚糖[49]，又名几丁质，是由几丁质通过一定程度的脱乙酰基而得到的多糖类生物大分子。壳聚糖可以直接抑制病原体的孢子萌发、生殖管伸长和菌丝生长，间接诱导防御酶，如甲壳素酶，β-1-3-葡糖苷酶，苯丙氨酸氨裂解酶，过氧化物酶等，从而有效地降低水果的病害[50-54]。基因工程保鲜技术是利用转基因技术，上调或下调某些相关基因在果蔬中的表达水平，从而延缓果蔬的氧化衰老，或者增强其自身的抵抗力。随着转基因技5 合肥工业大学硕士学位论文术的高速发展，可以将某些抗病基因，如将降解细胞壁的几丁质酶基因转入到植物中，增强对真菌病害的抵抗力[55][56]。Liu等[57]研究发现Pti4、Pti5基因过量表达的转基因番茄植株，在叶片上接种病原菌PstDC3000后，转基因植株叶片和茎秆上的病斑、叶片菌落总数与野生型相比均有明显的减少，提高番茄对PstDC3000的抗性。生物保鲜的方法具有天然、安全、绿色等优点，已成为食品保鲜技术的研究热点之一，有着广阔的研究前景。随着人们对食品安全性认识的提高，探索一条绿色、高效、简便的果蔬保鲜途径具有重要意义。1.4姜黄素及其抑菌机理的研究现状1.4.1姜黄素简介姜黄（拉丁学名：CurcumalongaL.），姜黄芭蕉目，姜科、姜黄属，是一种多年生草本植物。酷爱温暖湿润的气候，好阳光充足，雨水丰富的环境，害怕严寒霜冻的气候，怕干旱。主要分布在中国福建、台湾、广东、云南、广西、西藏等省区；东亚及东南亚广泛栽培[58-60]。姜黄自唐朝以来一直是一种重要的药物，并在以后历代均有记载。在李时珍所著的《本草纲目》中提到的的宝鼎香，就是我们今天说的姜黄素。姜黄素最早是在1870年从姜黄中首次分离出来一种低相对分子质量多酚类化合物，1910年阐明了其双阿魏酰甲烷的化学结构，分子式为C21H20O6，结构图如图1.3所示。姜黄素是一种橙黄色结晶粉末，具有特殊芳香气味，味微苦，不溶于水，可溶于冰醋酸和碱性溶液，在碱性条件下呈红棕色，在中性、酸性条件下呈黄色，由于姜黄素分子两端具有两个羟基，在碱性条件中会发生电子偶联效应，即共轭效应，因此当PH逐渐升高的条件下，姜黄素就会从黄色变为红色。在化学研究中，可用做酸碱指示剂[61]。图1.3姜黄素的分子结构图Fig.1.3Themolecularstructureofcurcumin6 第一章文献综述姜黄素着色性强，一经着色后就不易退色，目前是世界上销量最大的天然食用色素之一，是世界卫生组织和美国食品药品管理局以及多国准许使用的食品添加剂[62-64]。1.4.2姜黄素的提取方法传统的姜黄素提取方式有碱溶液法、有机溶剂萃取法等。这些方法对设备要求低，容易实现工业化生产，但这些有机溶剂用来提取姜黄色素也存在一些缺点。比如萃取液中会夹带大量酯类等杂质难以除去，并且生产周期长，操作繁琐，污染大，提取率并不高。为了提高提取效率，越来越多的现代技术被运用到提取过程中，比如：超声波辅助提取法、二氧化碳超临界流体提取法、高压液相色谱法辅助提取法、液压辅助提取法、酶辅助提取法等[65-66][68]。VIngale等[67]研究发现HPLC法提取姜黄素比传统方法提高了7.73%；SUN等[69]用超声波辅助法提取姜黄素，产量也高于传统提取。纤维素酶及果胶酶等可降解植物细胞壁的纤维素，促进活性成分析出，董海丽等采用复合酶从姜黄粉末中萃取的姜黄素，也有比传统方法更高的效率[70]。姜黄素近些年来逐渐成为国内外研究的热点，所涉及到的研究领域也越来越广泛，姜黄降脂降压、抗肿瘤、抗凝、抗炎、抗氧化、抑菌作用等活性日益受关注[71-73]。1.4.3姜黄素的抗氧化作用活性氧（ReactiveOxygenSpecies,ROS）产生在生物有氧代谢的过程中，这类自由基具有高度活跃的化学性质的氧化活性基团，主要包括过超氧阴离子（O2•−）、氧化物（H2O2）和含氧自由基（•OH）等。这些自由基作为第2信使，通过改变氧化还原状态，调节细胞信号转导通路。ROS生物活性极高，很容易与生物大分子发生直接反应，能够直接损害或间接通过一系列过氧化应激反应而引起生物结构发生大范围的破坏。其抗氧化作用是指在以低浓度存在的物质条件下就能有效抑制自由基的氧化反应的，其作用机理是直接作用于自由基，或是间接消耗容易生成自由基的物质，防止进一步反应的发生[74-76]。姜黄素保护生物膜的机理是通过抗过氧化脂质，而其抗过氧化脂质的主要作用机制是清除自由基。姜黄素之所以具有抗氧化作用与它的分子结构是有着密切关联的，分子中的活性基团在抗氧化过程中提供质子，从而产生抗氧化作用。姜黄素是由2个不饱和酮双键、2个酚羟基、1个β-二酮和1个亚甲基组成的对称分子结构。姜黄素的2个苯环上各有1个甲氧基和1个酚羟基，丙烯基与1个β-双酮/烯醇式结构连接，酚羟基和β-二酮这2个活性中心，均可以提供质子，阻断自由基的化学反应，从而调控多条信号转导通路，例如：Nrf2-ARE信号通路[77-80]、NF-kB7 合肥工业大学硕士学位论文信号通路[81-84]、NADPH/ROS信号通路[85-87]、AMPK信号通路[88-90]和MAPK信号通路[91][92]等，当相关信号转导分子被激活后，调控相应的功能基因表达水平，进一步相关蛋白的表达水平也被调控，进而诱导抗氧化酶的表达水平上升，发挥抗氧化作用。Nrf2是一种氧化应激基因表达的关键转录因子，ARE是一个特异的DNA-启动子结合序列，Nrf2-ARE信号通路是机体抗氧化应激反应的主要载体，激活并促进II型代谢酶的合成，使细胞内维持着氧化还原反应的一个动态平衡。研究发现姜黄素通过控调Nrf2-ARE信号通路，Nrf2-Keap1发生解偶联，Nrf2因子转移，对HO-1的表达产生上调作用，从而减轻细胞氧化应激中所受的损伤[77]。促分裂原活化蛋白激酶MAPKs是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是植物受到外界生物和非生物因子干扰时早期的信号分子,MAPK级联途径由分裂原激活的蛋白激酶（MAPKs）、分裂原激活蛋白激酶的激酶（MAPKKs）和分裂原激活蛋白激酶的激酶激酶（MAPKKKs）组成，通过MAPKKK-MAPKK-MAPK逐级磷酸化,将外来信号级联放大并传递给下游信号，并引起一系列的生理生化反应，在信号传导过程中起着枢纽作用。MAPK级联反应是高度保守的信号模式，从单细胞物种到高等生物中皆存在。真菌病原菌中的MAPK主要有三条通路，分别是调控细胞壁完整性的Slt2-MAPK信号通路，介导病原真菌菌丝交配和生长的Fus3/Kss1-MAPK信号通路以及调节细胞渗透压的Hog1-MPAK信号通路。大量研究数据表明真菌病原菌中的MAPK级联途径在真菌菌丝的生长和侵染、细胞壁的完整性、附着胞的生成、应激反应和致病性强弱等方面有着非常重要的作用。1.4.4姜黄素的抗炎作用炎症是一种常见的病理变化，诱发炎性的因子有机械损伤、微生物感染、异物感染等，会使机体产生功能性障碍，并与肿瘤等其他病理变化存在密切联系，因此抗炎治疗是最重要的医学领域研究难题[73]。Claus等人发现姜黄素能够作为药物前体，其代谢产物具有抗炎活性。通过氧化反应产生的姜黄素代谢产物能够以共价键的方式与NF-kB结合，从而可以达到抑制炎症反应的效果[93]。1.4.5姜黄素的防腐作用姜黄素是一种天然食品色素及天然食品防腐剂，在国内外广泛用于食品加工及食品烹饪中，在休闲食品、果蔬饮料、面包西点等食品中的防腐应用同样广泛。以及脐橙贮藏保鲜上的应用，在果脯蜜饯生产中的防腐抑菌应用等[94][95]。1.5ROS的检测机理在非生物胁迫下，真菌会产生过量的活性氧，当细胞无法清除完积累的活性氧，就会对生物体造成一定的损伤，具体有DNA的损伤、蛋白质的氧化和脂质的氧化8 第一章文献综述等表现形式[96]。每种生物体都有一定的抗性水平，它们的细胞中存在清除ROS的各种酶类，可以减轻机体由活性氧带来的的损伤，但细胞不能得到完全的清除积累过多的ROS时，会加快机体氧化损伤的速度，致使许多细胞功能发生不可修复的损伤，会导致细胞的活性迅速地降低，甚至可能出现细胞死亡的现象。目前对于活性氧的检测，主要是根据活性氧在细胞内产生的位置和细胞的活性状态进行检测，对总体或者部分ROS水平的高低进行判断[97-98]。本实验中用到的荧光染料探针2′,7′-二氯氢化荧光素乙二脂（H2DCFDA）可被用于来检测活性氧的水平[99]，H2DCFDA可以和含氧自由基（-OH）、过氧化氢（H2O2）等不同类型的活性氧发生结合，它的灵敏性非常高。不发光的H2DCFDA能渗透到植物组织细胞内，并被稳定保留在细胞中，直到在酯酶的作用下脱去二酯基团生成2′,7′-二氯氢化荧光素（DCFH）。本身无荧光的DCFH能够与细胞内的ROS激活，发生氧化反应，生成高强度荧光的2′,7′--二氯荧光素（DCF），荧光的强度与ROS含量成正比，我们可以通过激光共聚焦显微镜检测荧光强度来定量活性氧的水平。1.6本课题研究的目的和意义随着国家的进步与发展，我国的经济水平在不断地提高，人们的生活质量同样发生重大的改变，顺应着时代的潮流。相对于过去，如今人们对身体健康的重视程度也越来越高，所以合理、健康、绿色的饮食是必不可少的，水果和蔬菜在绿色的饮食习惯中是必不可少的。为了身体各方面的健康需求，人们不但追求果蔬的多样性，而且对果蔬的品质的有了一个更高的标准。水果和蔬菜在收获后期常常由于机械损伤、时间温度导致的的生理失调、病原菌的侵染等发生严重损失，其中占据主导地位的就是因微生物的侵染引起的果实坏死。果蔬采后病害所导致的巨大经济损失已成为全球性问题，探索一条绿色、高效、简便的果蔬抗病途径具有重要意义。姜黄素作为一种天然的化合物，其良好的性能而被逐渐应用于果蔬的抗病及防腐方面，越来越多的研究表明姜黄素在果蔬采后保鲜中发挥着重要的作用，各种抗病通路也被报道。本文首先对猕猴桃进行霉菌孢子液接种实验以及姜黄素对拟茎点霉菌和灰霉菌菌丝生长和孢子萌发的抑制实验，并验证姜黄素对病原菌生长是否具有抑制，是否延缓猕猴桃上病原菌的发病时间；其次验证姜黄素是否能清除菌丝中活性氧的积累，提高过氧化物酶的活性；最后验证姜黄素是否能抑制灰霉菌的致病基因表达，增强酶活相关基因的表达。研究结果表明，经过姜黄素处理后的猕猴桃接种病原菌孢子液后发病率和病斑直径也有所下降；体外接种下，姜黄素能够抑制灰霉菌和拟茎点霉菌菌丝的生长和孢子的萌发；姜黄素的处理能清除菌丝中活性氧的积累，下调致病相关基因表达并上调酶活相关基因的表达水平。本研究对姜9 合肥工业大学硕士学位论文黄素控制病原菌生长和控制猕猴桃采后病害提供了新的理论基础，也为姜黄素在新型的天然的杀菌防腐剂在其他果蔬上的应用提供的新的思路，具有重要的理论和实践价值。10 第二章材料与设备第二章材料与设备2.1实验材料2.1.1猕猴桃于水果超市购买的海沃德猕猴桃，选取新鲜的、外观大小均一的、成熟度一致的、表面无机械损伤、无病虫害造成的伤口和腐烂的果实用于本实验研究。首先把海沃德猕猴桃用2%（v/v）的次氯酸钠NaClO溶液浸泡消毒2min，再用自来水冲洗2~3次猕猴桃果实，使表面的NaClO冲洗干净后将处理的猕猴桃果实置于实验台上自然晾干。2.1.2病原真菌本研究所使用的病原菌分别为灰霉菌和拟茎点霉菌，这两种霉菌皆是从本实验室在合肥工业大学翡翠湖校区基地中染病的猕猴桃上分离获得的，将发病部分果肉接种到PDA培养基上，经过多次纯化并经过权威鉴定后保存于-80℃备用。2.1.3姜黄素姜黄素购买于北京百灵威科技有限公司，植物提取，纯度为98%，保存于4℃。2.2常用试剂与仪器2.2.1常用生化试剂表2.1主要试剂Table2.1regentsforexperiments试剂名称生产厂家葡萄糖成都市科龙化工试剂厂十六烷基三甲基溴化铵国药公司磷酸二氢钾国药公司磷酸二氢钠国药公司磷酸氢二钾国药公司磷酸氢二钠国药公司β-巯基乙醇国药公司乙二胺四乙酸国药公司11 合肥工业大学硕士学位论文乙二醇双四乙酸国药公司十六烷基三甲基溴化铵国药公司苯甲基磺酰氟国药公司2′,7′-二氯氢化荧光素乙二脂Sigma公司十二烷基硫酸钠国药公司愈创木酚国药公司2,4-二硝基苯肼国药公司三氯乙酸国药公司甘油国药公司次氯酸钠国药公司异丙醇国药公司氯化钠成都市科龙化工试剂厂2.2.2主要仪器与设备表2.2仪器和设备Table2.2Instrumentandequipment仪器设备生产厂家Haier冰箱成都市科龙化工试剂厂激光扫描共聚焦显微镜日本OLYMPUS普通光学显微镜上海光学仪器厂GL-312台式紫外分析仪海门其林贝尔仪器制造有限公司XB-K-25血球计数板上海求精玻璃仪器厂TGL-16B台式离心机上海安亭科学仪器厂ZHJH-C1118B超净工作台上海智城P2,P20,P100,P1000移液枪美国EppendorfZHWY-2102摇床上海智城GelDocXR+凝胶成像美国BIO-RAD12 第二章材料与设备RCT基本型加热磁力搅拌器德国IKAXC47/11-型液氮生物容器美国MVEMLS-3780高压蒸汽灭菌锅日本SANYOAllegra64R台式高速冷冻离心机美国BeckmanCoulterMJX-100B-Z型霉菌培养箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂UV-1201紫外可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司打孔器扬州美佳臣医教仪器厂mini-subcellGT小型水平电泳仪美国BIO-RAD微波炉青岛海尔股份有限公司PCR扩增仪杭州博日科技有限公司2.2.3常用试剂盒表2.3常用试剂盒及用途Table2.3Kitsusedcommomlyandtheirapplication试剂盒生产厂家用途5×All-In-OneMasterMix爱必梦RNA反转录（withAccuRTGenomic生物科技有限公司为cDNADNARemovalKit）TransStartTopGreenqPCR北京全式金生物技术定量PCRSuperMixKit有限公司分析总超氧化物歧化酶南京建成生物科技测量SOD酶活性（T-SOD）测试盒有限公司谷胱甘肽过氧化物酶南京建成生物科技测定谷胱甘肽（GSH-PX）测试盒有限公司过氧化物酶活性2.2.4常用试剂配方和配置方法（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基13 合肥工业大学硕士学位论文表2.4PDA培养基配方Table2.4ElementofPDAmedium成分含量（g/L）马铃薯200g葡萄糖20g琼脂15~20gddH2O至1000mL（2）50×TAE缓冲液表2.550×TAE缓冲液Table2.550×TAEbufferpreparation试剂名称终浓度（M）Tris2Na2EDTA2H2O0.1冰乙酸2ddH2O-（3）10×TE缓冲液表2.650×TE缓冲液Table2.650×TEbufferpreparation试剂名称终浓度（mM）1M-TrisHCl10050mMEDTA10ddH2O-（4）6×DNA上样缓冲液14 第二章材料与设备表2.76×DNA上样缓冲液Table2.76×loadingbufferpreparation试剂名称终浓度EDTA30mMGlycerol36%(w/v)XyleneCyanolFF0.05%（w/v）BromophenolBlue0.05%（w/v）（5）Tirs-HCl缓冲液表2.81MTirs-HCl缓冲液Table2.81MTirs-HClbufferpreparationpHTris(g/L)HCl(ml/L)7.4121707.6121608.012142（6）姜黄素母液的配制准确称取50mg的姜黄素，溶解于10ml的甲醇，用已灭菌的有机相滤器过滤后，配置成5mg/ml的母液，避光存于-20℃备用。（7）2’,7’-二氯氢化荧光素乙二脂（H2DCFDA）荧光染液配制：准确称取4.87mg染料粉剂溶解于1ml二甲亚砜（DMSO）中，配制成10mM的母液，分装后置于-20℃或-80℃条件下低温保存。染色前根据所需染色的样品的体积，按照最终浓度为25μmol/L加入相应体积的10mM母液。（8）0.2MPBS母液的配制：准确称取71.6gNa2HPO4-12H2O和31.2gNaH2PO4-2H2O，分别溶于1000ml水，作为母液备用。根据实验需要按照比例配置并稀释成不同浓度、不同pH的PBS缓冲液。（9）0.5%TBA溶液(硫代巴比妥酸)的配制：准备称取0.5g的2-硫代巴比妥酸和15g三氯乙酸溶解于蒸馏水并定容至100mL，该试剂需要现配现用。（10）0.3%愈创木酚溶液的配制：30ml0.05MPBSpH7.0缓冲液中加入30μl的愈创木酚溶液，愈创木酚见光易分解，该试剂需现配现用。（11）0.1M过氧化氢溶液配制：取100μl的30%的过氧化氢溶液加入到9.9ml的0.05MPBSpH7.0缓冲液中，过氧化氢易分解，需要现配现用。15 合肥工业大学硕士学位论文（12）考马斯亮蓝G-250溶液的配制：准确称取20mg考马斯亮蓝G-250溶解于10mL90％乙醇中，再加入85％（W:V）的磷酸10mL，用蒸馏水定容至100mL。此溶液可于常温下存放一个月。（13）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒试剂配制试剂一应用液：试剂一贮备液需稀释100倍配制成应用液，取0.1mL加入蒸馏水定容至10mL，根据需要量配制，现配现用，配制好后置于4℃保存。试剂二应用液：向试剂二的甲粉剂中加入90~100℃的蒸馏水170mL，保证粉剂完全溶解后与乙液充分混合。配制好的应用液为过饱和溶液，室温静置冷却，配置好后置于4℃保存，如果有结晶，则取上清进行实验。试剂三应用液：向试剂三粉剂中加入200mL蒸馏水待充分溶解后装于塑料瓶中4℃中保存。试剂四应用液：向试剂四粉剂中加入50mL蒸馏水，充分溶解后置于4℃中保存。试剂五应用液：向试剂五粉剂中加入10mL蒸馏水，充分溶解后，4℃避光保存。试剂六应用液：取一支3.07mg的GSH标准品粉剂加入到试剂七应用液中，定容至10mL配成1mmol/L的GSH溶液，该溶液需现配现用。吸取1mmol/L的GSH溶液0.2mL加试剂七应用液定容至10mL，即为20μmol/L的GSH标准溶液。试剂七应用液：将试剂七贮备液和蒸馏水按1:9的比例混合，也即10倍稀释配制成应用液，现配现用，4℃保存备用。（14）总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒试剂配制试剂一应用液：用时每瓶5ml贮备液加蒸馏水稀释至50ml，4℃保存1年。试剂二应用液：于4℃保存一年。试剂三应用液：于4℃保存一年。试剂四应用液：用时按贮备液：稀释液=1:14比例配制，用多少配多少。4℃保存，不可冷冻。试剂五应用液：用时加37.5ml70℃~80℃蒸馏水溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，配制后的试剂避光4℃保存一年。试剂六应用液：用时加37.5ml蒸馏水溶解后备用，配好后试剂避光4℃冷藏保存6个月。显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3:3:2的体积比配显色剂，用多少配多少，配好的显色剂4℃避光冷藏3个月。16 第三章病原菌分离纯化鉴定第三章病原菌分离纯化鉴定3.1猕猴桃病原菌的分离和纯化超净台紫外灭菌40min，将两个染病的猕猴桃分别用70%酒精棉球擦洗干净后置于台面，取干净的镊子在酒精灯火焰上灼烧灭菌直至镊子尖部烧红，待镊子冷却后，在猕猴桃病斑部位与健康部位交界处撕去猕猴桃的外皮，并用镊子夹取含有染病部位与健康部位交界处的果肉（大小约0.3mm×0.3mm），放置于备好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseagar,PDA）的正中央，用封口膜包好培养皿后置于25℃的霉菌培养箱中培养。待7d左右，菌丝在PDA培养基上长满培养基表面时，用灼烧过已冷却的打孔器打孔取样，用已灭菌的镊子小心夹取菌饼，将有菌丝的那一面菌饼接种到新鲜的PDA培养基中并继续进行25℃纯化培养。重复纯化3代后得到纯净的病原菌。3.2病原菌的回接挑选健康的猕猴桃果实，用70%酒精棉球消毒后，无菌水冲洗2~3次，收集分离纯化得到的两种病原菌的孢子悬浮液，接种到猕猴桃人为制造的伤口中，并用蒸馏水接种做为对照。将接种的猕猴桃贮藏于25℃下，并定期观察发病情况。3.3病原菌的鉴定3.3.1CTAB提取液的配制取10ml1MpH8.0的Tris-HCl缓冲液与4ml0.5MpH8.0的EDTA混合溶解于蒸馏水中，加入8.186g的氯化钠和2g的CTAB并定容至100ml。3.3.2病原菌DNA的提取本文采用CTAB法提取真菌病原菌的菌丝DNA，方法如下：（1）准确称取100mg的新鲜菌体，置于1.5mlEP管中，加入液氮后用塑料小研磨棒用力研磨至细粉状；（2）在装有样品的EP管中加入600μlCTAB缓冲液，并置于涡旋震荡仪上混合均匀后，于65℃水浴锅中处理1h，中途震荡数次；（3）冷却至室温后，加入等体积的氯仿，上下震荡混匀后于室温静置3min；（4）将样品配平后于离心机12000r/min离心10min，取400μl上清液至干净的EP管中，加入等体积的异丙醇后于-20℃放置30min；（5）12000r/min离心10min，弃上清，用75%酒精清洗沉淀两次；（6）12000r/min离心10min，弃上清，瞬离，吸干液体；（7）将EP管置于通风橱吹干沉淀，加入100μlddH2O保存于-20℃。17 合肥工业大学硕士学位论文3.3.3PCR扩增以提取的病原菌菌体DNA稀释5倍后作为PCR模板，用微生物真菌菌种鉴定的通用引物：ITS1(F)：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4(R)：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′进行PCR鉴定，扩增使用EasyTaqPolymerase进行PCR，反应程序如下表：表3.1PCR反应体系Table3.1PCRreactionsystem试剂剂量（μl）DNA模板1MIX3EasyTag0.2ITS10.5ITS40.5ddH2O14.8各项试剂加完后放置样品于微型离心机中离心混匀后再将样品放置PCR仪中，PCR反应程序如下表：表3.2PCR扩增程序Table3.2PCRamplificationprocedure步骤温度（℃）时间第一步945min第二步9430s30cycle5530s7250s第三步723minPCR程序运行结束后，通过琼脂糖凝胶电泳进行初步验证是否扩增出目的条带。3.3.4琼脂糖凝胶的制备将制胶模板调节好水平位置，取有机玻璃内槽洗净，静置晾干，固定于水平模具上，放置好梳子。向干净的锥形瓶中加入30mL1xTAE缓冲液，和0.3g琼脂糖，轻轻摇晃混匀后放置于微波炉中，使用中火加热约30s，取出摇匀再次放入18 第三章病原菌分离纯化鉴定微波炉加热至沸腾并持续10s，小心取出锥形瓶后置于凉水中稍微冷却同时摇晃瓶身，保证溶液不会发生局部凝固，待溶液稍微冷却后小心地、匀速地倒入上述已调平的胶板中，使胶液缓慢而均匀地铺满玻璃内槽，使整个有机玻璃板内槽形成厚度约为3~5mm均匀的胶层。保证插入的梳子齿下或齿间不出现气泡，若有气泡可在胶层未凝固钱使用枪头刺破[101]。室温下静置20~30min左右，待胶完全凝固后，可沿垂直胶面的方向轻轻拨出梳子，可以看到胶面上形成了间距均匀且大小相同的上样孔。将凝胶放置于装有TAE缓冲液中，缓冲液液面需没过琼脂糖凝胶1mm以上。3.3.5电泳吸取3μlPCR扩增的目的基因片段与混有GelRed荧光染料的10×loadingbuffer混合均匀，用移液枪点入放置在电泳槽中的琼脂糖凝胶的胶孔中，使用2kPlusDNAMarker，用作参照来确定条带的大小，电泳条件为120v，20min。电泳结束后取出凝胶放置于凝胶成像仪中，进行成像分析。3.3.6测序将PCR产物送至上海生工生物工程公司，检测在GenBank中的核酸数据库进行同源性比对和分析。3.3.7菌株的保存在冻存管中加入600~800μl的PDA和300μl30%甘油，用打孔器取下菌饼，放入冻存管中，存于-80℃冰箱备用。3.4实验结果将从两个腐烂的猕猴桃发病部分和健康部分交界处分离的果肉放在PDA培养基上，放置于25℃霉菌培养箱中进行培养得到的2种病原菌，在培养7d后长满盘再次进行纯化培养，分离后纯化3代，如图3.1所示，由左往右分别是拟茎点霉菌和灰霉菌的菌落形态。将纯化的菌株回接到健康的猕猴桃上，回接的猕猴桃腐烂病状与最初染病的猕猴桃发病情况相同，如图3.2所示，由左往右分别是拟茎点霉菌和灰霉菌侵染猕猴桃的状态，接回实验均可使猕猴桃腐烂。再次分离纯化出病原菌，其菌落形态与最初分离的形态相同。因此，分离得到的这2种真菌为猕猴桃坏死的致病菌。19 合肥工业大学硕士学位论文图3.1病原菌的菌落形态Fig.3.1Pathogenicfunguscolonymorphology图3.2病原菌回接猕猴桃的发病情况Fig.3.2Incidenceofkiwifruitinfectedwithpathogenicbacteria收集两种真菌的菌丝，提取其DNA作为模板，使用微生物真菌菌种鉴定特异性引物ITS1和ITS4做为配对引物，用EasyTaqPolymerase进行扩增，退火温度为55℃，放置于PCR仪中对目的条带进行扩增后用琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带片段的长度为约为500bp，如图3.3。将PCR产物测序后得到的序列结果在GenBank中的核酸数据库进行同源性比对，结果显示是分别与拟茎点霉菌和灰霉菌的基因组序列有99%的序列同源性，测序对比结果见附录1和附录2。图3.3病原菌的ITS扩增电泳图Fig3.3ITSamplificationelectrophoresisfigureofpathogenicfungus20 第四章姜黄素对猕猴桃发病情况的影响第四章姜黄素对猕猴桃发病情况的影响4.1不同浓度姜黄素对病原菌在猕猴桃上生长的影响4.1.1不同浓度姜黄素溶液的选择和配置根据预实验结果，选用拟茎点和灰霉菌的孢子悬浮液浓度为l×l05个/mL，姜黄素溶液用无菌水稀释终浓度为100mg/L，200mg/L，300mg/L，400mg/L，600mg/L。其中拟茎点霉菌的处理组浓度选择为0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L，灰霉菌的处理组浓度选择为0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L。4.1.2猕猴桃接种病原菌的处理用酒精灯对干净铁钉尖端灼烧进行火烧式灭菌，待钉子冷却，将猕猴桃洗干净后置于超净台中晾干，用无菌的钉子在猕猴桃果实的赤道处钻孔。每个猕猴桃果实上钻4个大小为深4mm×宽3mm的孔后晾干。以拟茎点处理组为例，将晾干的猕猴桃分别分为四组，其中三组分别用无菌枪头接种30μL100mg/L、200mg/L、300mg/L的姜黄素溶液，一组接种无菌水作为对照，接种后静置30min以上直至每个孔中的姜黄素晾干。将稀释好的浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液振荡混匀，用无菌枪头吸取5μl的孢子悬浮液分别注入到猕猴桃果实的伤口中并晾干，整个实验过程在无菌超净台中操作。将处理后的猕猴桃放入塑料筐中，并用干净的塑料袋密封贮藏在25℃中，保持相对湿度在80%左右，在贮藏期间每天统计猕猴桃的发病率，测量病斑直径大小。接种灰霉菌孢子悬浮液的猕猴桃同样按上述方法操作。每个处理都有5个重复，整个实验也重复3次。发病率=感染病原菌的果实个数/总果实个数×100%4.2实验结果4.2.1姜黄素处理对猕猴桃果实上拟茎点霉菌的抑制把拟茎点孢子悬浮液（1×105个/ml）注射到经过不同浓度姜黄素处理的猕猴桃伤口中，25℃下连续贮藏一周，并记录第1、3、5天的发病率，测量并记录第3、5、7天猕猴桃果实上的病斑直径，实验结果如图4.1所示。我们可以从图4.1A中看到，随着接种天数的增加，猕猴桃的发病率都是呈升高趋势的。在接种后第1天，不作处理的猕猴桃发病率约为42%，用100mg/L姜黄素处理的猕猴桃发病率约为12.5%，而用200mg/L和300mg/L姜黄素处理的猕猴桃发病率均为0，且组间存在显著性差异。在接种后第3天，对照组的发病率均要高于处理组，同样存在显著差异。在第5天，用300mg/L姜黄素处理的猕猴桃发病率约为80%。在图4.1B中我们可以看出，随着天数的增加，病斑的直径均呈上升趋势，姜黄素的浓21 合肥工业大学硕士学位论文度与病斑直径的大小基本呈反比。图4.1C是猕猴桃在第7天的发病图，可直观地看出对照组和处理组病斑直径的差别。图4.1姜黄素对接种拟茎点霉菌的猕猴桃发病情况的影响Fig.4.1EffectofcurcuminontheincidenceofkiwifruitinoculatedwithPhomopsis图4.1A表示的是经过不同浓度姜黄素处理的猕猴桃在接种拟茎点孢子液后第1、3、5天的发病率，P＜0.05。图4.1B表示的是经过不同浓度姜黄素处理的发病的猕猴桃在接种拟茎点孢子22 第四章姜黄素对猕猴桃发病情况的影响液后第3、5、7天的病斑直径，P＜0.05。图4.1C表示的是接种拟茎点孢子液第七天，对照组和处理组猕猴桃病斑形态。4.2.2姜黄素处理对猕猴桃果实上灰霉菌的抑制把灰霉孢子悬浮液（1×105个/ml）注射到经过不同浓度姜黄素处理的猕猴桃伤口中，25℃下连续贮藏一周，并记录第1、3、5天的发病率，测量并记录第3、5、7天猕猴桃果实上的病斑直径，实验结果如图4.2所示。图4.2A中显示的是猕猴桃的发病率，同样随着接种天数的增加，猕猴桃的发病率都是呈升高趋势的。在接种后第1天，不作处理的猕猴桃发病率约为67%，用200mg/L、400mg/L和600mg/L姜黄素处理的猕猴桃发病率分别约为50%、25%和17%，组间存在显著性差异，可以看出在姜黄素处理后均能延缓猕猴桃果实的发病时间。在图4.2B中我们可以看出，随着天数的增加，果实病斑直径均呈上升趋势，因此姜黄素对于猕猴桃上病原菌的侵染也有一定的抑制能力。图4.1C是猕猴桃接种灰霉孢子液后在第7天的发病图，可直观地看出对照组和处理组之间病斑直径的差别。23 合肥工业大学硕士学位论文图4.2姜黄素对接种灰霉菌的猕猴桃发病情况的影响Fig.4.2EffectofcurcuminontheincidenceofkiwifruitinoculatedwithBotrytiscinerea图4.2A表示的是经过不同浓度姜黄素处理的猕猴桃在接种拟茎点孢子液后第1、3、5天的发病率，P＜0.05。图4.2B表示的是经过不同浓度姜黄素处理的发病的猕猴桃在接种拟茎点孢子液后第3、5、7天的病斑直径，P＜0.05。图4.2C表示的是接种拟茎点孢子液第七天，对照组和处理组猕猴桃病斑形态。24 第五章姜黄素对病原菌的作用第五章姜黄素对病原菌的作用前面的实验中我们发现，姜黄素可以对病原菌在猕猴桃果实上的发病率以及菌斑的扩展具有一定抑制作用。本章内容主要是研究在离体条件下姜黄素对病原菌的抑制，以及姜黄素对灰霉菌的抑制作用机理。5.1姜黄素对病原菌生长情况的影响5.1.1姜黄素对病原菌菌落扩展的影响取菌丝长满整个平板的拟茎点霉菌和灰霉菌各一盘，放置超净工作台中，用直径为5mm的打孔取样器取下距离中心点相同距离的拟茎点菌饼，分别置于含姜黄素终浓度为0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L的PDA固体培养基中央位置；同样方法取灰霉菌菌饼一片，分别置于含姜黄素终浓度为0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L的PDA固体培养基中央位置。将培养皿用封口膜包裹好，置于25℃霉菌培养箱中培养，分别在第3、5、7天，用游标卡尺采用十字交叉法测量霉菌菌落直径，统计菌落扩展直径大小。每个浓度做5次重复，整个实验也重复3次。5.1.2姜黄素对病原菌孢子萌发的影响将纯化好长满盘的霉菌置于无菌超净台上，用灭菌的镊子夹取一块菌饼于无菌培养瓶中，加入适量的无菌水，盖好瓶盖后用涡旋振荡器震荡15~20s，尽量地使孢子从真菌的菌丝上脱离。用枪头吸取该培养瓶中吹打后的液体，小心地用已灭菌的擦镜纸过滤到另一个干净的无菌培养瓶中，拦截留住菌丝，得到霉菌孢子悬浮液。用移液枪吸取10μL于血球计数板上，用普通光学显微镜观察计数，可以通过无菌水稀释或者收集更多的孢子来调节到实验所需要的孢子液浓度。在超净台中，吸取姜黄素终浓度为0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L的PDA液体培养基于1.5mlEP管中，把浓度为1×105个／mL的孢子悬浮液振荡混匀后，吸取50μL于加了不同浓度姜黄素PDA液体培养基中，在25℃180rpm摇床中连续培养10~12h后，在普通光学显微镜下观察200个孢子的萌发状况，计算拟茎点霉菌的孢子萌发率。每个浓度选取3次不同视野计算，整个实验也重复3次。姜黄素对灰霉菌孢子的影响采用同样的方法进行。5.1.3姜黄素对病原菌菌丝ROS累积的影响实验前把浓度为1×105个/mL的拟茎点霉菌孢子悬浮液振荡混匀后，吸取30μL加于500μLPDA液体培养基中，在25℃180rpm摇床中连续培养48h后，取3管分别加入1、2、3μL5mg/ml的姜黄素溶液，使姜黄素终浓度分别为0mg/L、25 合肥工业大学硕士学位论文100mg/L、200mg/L、300mg/L并继续培养24h。在文献[100]所使用的方法上稍有改善，收集不同浓度处理的拟茎点菌丝，使用细胞内活性氧ROS敏感探针：2′，7′-二氯氢化荧光素乙二脂（H2DCFDA）来检测菌丝的ROS累计水平。用500μL磷酸盐缓冲液PBS（pH7.0）清洗收集到的拟茎点菌丝，5000g离心3min收集菌丝，除去上清，再用含有25μMH2DCFDA的磷酸盐缓冲液PBS（pH7.0）重新悬浮。将重新悬浮的细胞置于25℃恒温水浴锅中黑暗孵育30min，再用PBS（pH7.0）缓冲液清洗2次，使用带有紫外光源的激光共聚焦扫描显微镜，调节激发光488nm和散射光510nm来检测菌丝的染色情况，从显微镜视野随机观察3个区域拍照记录，并对ROS荧光强度进行统计，实验重复3次。姜黄素对灰霉菌菌丝的ROS累积水平影响也采用同样的方法。5.1.4姜黄素对病原菌菌丝中MDA含量和POD活性的影响在已灭菌的15ml试管中加入5mlPDA培养基，添加适量姜黄素溶液，使姜黄素终浓度分别为0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L，在长满盘的拟茎点菌落上，用直径为5mm的打孔取样器取下距离中心点相同距离的拟茎点菌饼，用烧过的镊子小心夹取放置装有PDA的试管中，在25℃180rpm摇床中连续培养72h，直到菌丝长得较为茂盛。使用离心机转速8000g2min，弃上清，收集菌丝。称量100~200mg的菌丝，液氮研磨后装入已灭菌的1.5mlEP管中，称取重量并记录(已知空管重量)，加入10mL的0.1MpH7.0的磷酸缓冲液(含1mMEDTA，5%PVP，1%TritonX-100)，于4℃13000g/min，离心20min，分离得到的的上清液即为粗酶液。菌丝中MDA含量的测定采用TBA法，吸取300μl上清液加到500μl0.5％TBA溶液的中，将1.5mlEP管放入95℃水预锅中加热20min后迅速取出并冰浴5min，在4℃下，10000g/min条件下离心10min。吸取300μl上清液用酶标仪分别检测波长在450nm、532nm和600nm处的吸光度。根据公式即可计算出MDA大小。每个浓度重复5管，整个实验重复3次，灰霉菌采用同样方法进行。MDA浓度(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450MDA含量(μmol/gFW)=MDA浓度(μmol/L)×提取液体积(mL)/植物组织鲜重(g)本实验采用愈创木酚法测定POD的活力值，吸取60μl粗酶液，加入210μl的0.3％愈创木酚，30℃条件下孵育10min后，向EP管中加入30μl0.1M过氧化氢溶液，摇匀后立即检测在470nm处的吸光度，每隔30s测量一次470nm处的吸光度，连续10个动力循环，并以蒸馏水代替H2O2溶液作为空白管对照。每个浓度重复5管，整个实验重复3次。26 第五章姜黄素对病原菌的作用5.1.5姜黄素对病原菌菌丝中CAT活性的影响吸取30μl粗酶液，加入240μl0.05MpH7.0的PBS缓冲液，最后加入30μl0.1MH2O2后立即在240nm处检测吸光度的变化，每隔30s检测一次，连续10个动力循环。每个浓度重复5管，整个实验重复3次。5.1.6姜黄素对病原菌菌丝中GSH-Px活性的影响取两支试管，分别标注为酶管和非酶管。在非酶管中加入1mmol/LGSH0.2mL，酶管中加入1mmol/LGSH0.2mL和0.2mL粗酶液，在37℃水浴锅中加热5min后再分别加入0.1mL试剂一应用液（试剂一应用液提前在37℃中预热），再放入37℃水浴锅中准确反应5min。反应完成后两支试管分别加入试剂二应用液2mL，非酶管中加入0.2mL粗酶液。混匀后3500rpm/min离心10min，取1ml上清液作显色反应。第二步的显色反应中取四支干净试管分为非酶管、酶管、空白管和标准管，其中：空白管加入1mlGSH标准品溶剂应用液、试剂三应用液1mL、试剂四应用液0.25mL、试剂五应用液0.05mL；标准管加入20μmol/LGSH标准液1mL、试剂三应用液1mL、试剂四应用液0.25mL、试剂五应用液0.05mL；非酶管加入非酶管上清液1mL、试剂三应用液1mL、试剂四应用液0.25mL、试剂五应用液0.05mL；酶管含有酶管上清液1mL、试剂三应用液1mL、试剂四应用液0.25mL、试剂五应用液0.05mL。混合均匀后于室温中静置15min后取300μl于酶标板，1cm光径，使用蒸馏水调零，在波长412nm下，测定各管的吸光度值。酶活力单位U定义为：规定每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶促反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个活力单位。每个浓度重复5管，整个实验重复3次。5.1.7姜黄素对病原菌菌丝中SOD活性的影响取干净试管分别标为测定管与对照管，对照管只需一份，在测定管中分别加入1.7ml粗酶液、1ml试剂一应用液、试剂二、试剂三和试剂四应用液分别0.1ml，在对照管中分别加入1ml试剂一应用液、1.7ml蒸馏水、0.1ml试剂二、0.1ml试剂三、0.1ml试剂四应用液，用涡旋混匀器充分混匀后，于37℃水浴加热40min后，分别加入2ml显色剂，充分混匀，取300μl于酶标板，使用双蒸水调零，在波长550nm下检测样品吸光度。酶活力单位U定义为：规定每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。每个浓度重复5管，整个实验重复3次。采用考马斯亮蓝法[93]测定病原菌菌丝蛋白质含量，步骤如下：（1）蛋白质标准曲线的绘制取6只带盖的试管，分别编号为0-5。按照表2.1所示，分别加入蒸馏水，牛27 合肥工业大学硕士学位论文血清蛋白，考马斯亮蓝G-250，配置成不同浓度的牛血清蛋白反应液。表5.1牛血清蛋白标准曲线的绘制Table5.1Drawingofbovineserumalbuminstandardcurve编号100ug/mL牛血蒸馏水考马斯亮蓝蛋白含量吸光度清蛋白（mL）（mL）（mL）（mg）001.05010.20.850.0220.40.650.0430.60.450.0640.80.250.0851.0050.1盖紧试管盖，上下颠倒混匀后，室温下放置5min，吸取300µL混合液于酶标板上，检测在595nm处的吸光度，0号管作为调零点。以蛋白含量为横坐标，595nm处的OD值为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线。（2）样品蛋白含量的测定称取适量样品，加液氮研磨成粉末，装入15mL的试管中。加入5mL冰上预冷的PBS（pH7.0）缓冲液，振荡混匀后于4℃转速10000g/min下离心10min。吸取0.2mL上清液并加入5mL考马斯亮蓝g-250，用蒸馏水补溶液体积至6mL，混匀后室温下放置5min。吸取300µL混合液于酶标板上，检测在595nm处的吸光度。根据牛血清蛋白标准曲线计算提取液中的蛋白质含量的毫克数。样品蛋白值得含量（mg/gFW）=（根据标准曲线所得的毫克数×提取液总体积）/（测定所用的样品体积×取样重量）5.2菌丝组织RNA的提取和mRNA的反转录5.2.1灰霉菌菌丝中RNA的提取菌丝的RNA提取采用Trizol法[102]，Trizol中含有苯酚和异硫氰酸胍，可防止RNase对RNA的降解。实验中所用的试管与枪头均是采购的无RNase产品，同去的具体实验步骤如下：（1）清洗研钵与研磨棒等器皿，在烘箱烘干后，加少许乙醇高温灼烧。后续操作中要勤换手套和口罩，确保无RNA酶污染。（2）在已灭菌的15ml试管中加入5mlPDA培养基，添加适量姜黄素溶液，使姜黄素终浓度分别为0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L，取下生长状况一致的28 第五章姜黄素对病原菌的作用灰霉菌菌饼一块，小心夹取放置装有PDA的试管中，在25℃180rpm摇床中连续培养72h，使用离心机转速8000g2min，弃上清，收集菌丝。取大约50～100mg菌丝材料，置于经过液氮冷却的研钵中，加入液氮后研磨成呈细小的粉尘状，装入经过液氮预冷的1.5mL的EP管中。（3）向EP管中加入1mLTrizol变性缓冲液，室温放置5~10min，之间上下颠倒数次，让细胞充分裂解，分离核蛋白。（4）加入0.2ml氯仿，用涡旋震荡仪使溶液混匀，室温下静置3~5min。（5）在4℃转速12000rpm/min的条件下，离心10min。小心吸取0.6mL的上清液（中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质）至1.5mL去RNA酶的EP管中，再加入0.5mL的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，溶液呈均匀乳浊状，室温下静置3min。（6）于4℃转速12000rpm/min的条件下离心10min，去上清液，管底残留的白色沉淀为含RNA的混合物。（7）加入1mL75%乙醇（用DEPC水稀释）清洗沉淀，上下颠倒离心管，注意不要打散沉淀。重复该步骤两次。（8）于4℃转速8000rpm/min下离心5~8min，尽量去除上清液。（9）将EP管置于通风橱中，盖上干净的一次性手套，大约5~10min后，使乙醇挥发干净，乙醇的残留会对后续实验造成影响，晾干时间太长，会导致RNA难溶解。（10）加入30~50μL去RNA酶的水（或DEPC水）溶解RNA，室温静置5min，以便使RNA全部溶解。可用核酸分析仪初步检测RNA的质量。（11）提好的RNA放于-80℃下保存。5.2.2灰霉菌菌丝cDNA的反转使用abmGood公司的5×All-In-OneMasterMix(withAccuRTGenomicDNARemovalKit)试剂盒进行反转录，反应体系为20μl，具体步骤如下：（1）冰上加入如下样品：TotalRNA5~6μL4×Reaction-Mix2μLNucleasefreeH2Oto8μL混匀反应液后，42℃孵育2min，或室温静置5min。（2）将小EP管放于冰上，继续加入如下样品：5×AllinoneMix4μL5×ReactionStopper2μLNucleasefreeH2O6μL29 合肥工业大学硕士学位论文混匀反应液，25℃孵育10min后在42℃下孵育50min，85℃热激5min使反应中的酶失活。将反转录产物至于-20℃保存备用。5.3实时定量PCR检测菌丝中相关基因的表达将反转的cDNA产物稀释5倍，作为实时定量PCR扩增模板，用于基因定量检测，实时定量PCR体系如表5.2：表5.2RT-qPCR反应体系Table5.2RT-qPCRreactionsystem试剂剂量（μl）cDNA模板3引物（F、R）12×TransStartTipGreenqPCRsuperMix10Dye0.5RNase-freeWaterupto20RT-qPCR扩增反应设定程序如下表5.3：表5.3RT-qPCR反应程序Table5.3RT-qPCRreactionprocess步骤时间预变性阶段5min循环阶段5s（40cycles）20s20s延伸阶段1min用于RT-qPCR的灰霉菌Bmp3/Sak1和SOD1/10823/6200基因的寡核苷酸引物序列如下表5.4所示，用于数据对比的灰霉菌内参基因为Actin，每个基因5个重复。30 第五章姜黄素对病原菌的作用表5.4用于扩增Bmp3/Sak1和SOD1/10823/6200基因的寡核苷酸引物Table5.4SequenceofoligonucleotideprimersusedforamplificationofBmp3/Sak1andSOD1/10823/6200genes引物名称引物序列BcBmp3-F:5′-GGAAGGTGTCGCAATTAAGAAAGT-3′BcBmp3-R:5′-GAAATGTGCATCAGTGAGGGGT-3′BcSak1-F:5′-AAGTTGATGTTTGGAGTGCGG-3′BcSak1-R:5′-CAAGGTATTTTCACTGGCAATGG-3′BcSOD1-F:5′-GGAAACTTCAAGACTGATGCCC-3′BcSOD1-R:5′-TCGTTCTCTCCCTTACCGAGAT-3′Bc10823-F:5′-GACTTTACTTCCTTGAGCGTGTGT-3′Bc10823-R:5′-GGATGTGGATAGAGATGTAGGGGT-3′Bc06200-F5′-TATCAAAAAGCCGTTCGCCT-3′Bc06200-R5′-CGATCATATTGTTTCCCCTCAAG-3′BcActin-F5′-CTCTATTCAAGCCGTCCTCTCC-3′BcActin-R5′-TAATCAGTCAAATCACGACCAGC-3′5.4实验结果5.4.1姜黄素对扩展病原菌菌落扩展的抑制分别取下纯化的拟茎点霉菌和灰霉菌菌饼数片，置于含不同姜黄素浓度的PDA培养基中央连续培养，观察并记录其第3天、第5天、第7天菌落直径大小，实验结果如图5.1所示。我们从中可看出，不同浓度的姜黄素对两种菌落的扩展均有一定的抑制效果，并与在实验选取的的姜黄素浓度范围内呈正比，拟茎点霉菌在含300mg/L姜黄素的PDA培养基中，对菌落的扩展抑制效果达到最大值，灰霉菌在含600mg/L姜黄素的PDA培养基中，对菌落的扩展抑制效果最好。随着培养时间的增加，姜黄素对两种病原菌菌落扩展的抑制效果也在逐渐减弱，可能是由于长时间的培养，病原菌已经适应含姜黄素的生长环境，对其产生了一定的抗性，从而使抑制效果有一定的下降，但具体的原因还需要后续设计实验加以论证。图5.2和5.3是拟茎点霉菌和灰霉菌在含不同浓度姜黄素的PDA培养基上第3、5、731 合肥工业大学硕士学位论文天的生长状态，可直观展现出姜黄素对两种病原菌菌落扩展的抑制。图5.1姜黄素对病原菌菌落扩展的抑制Fig.5.1Inhibitionofcurcuminonpathogenicfunguscolonyextension图5.1A表示拟茎点霉菌在不同浓度姜黄素的PDA培养基上菌落直径的变化，对接种第3、5、7天不同浓度间的菌落直径做差异显著性分析，其中P＜0.05。图5.1B表示灰霉菌在不同浓度姜黄素的PDA培养基上菌落直径的变化，对接种第3、5、7天不同浓度间的菌落直径做差异显著性分析，其中P＜0.05。32 第五章姜黄素对病原菌的作用图5.2拟茎点霉菌在不同浓度姜黄素的PDA培养基的生长状态Fig.5.2GrowthstatusofPhomopsisonPDAmediumwithdifferentconcentrationsofcurcumin图5.3灰霉菌在不同浓度姜黄素的PDA培养基的生长状态Fig.5.3GrowthstatusofBotrytiscinereaonPDAmediumwithdifferentconcentrationsofcurcumin5.4.2姜黄素对拟茎点霉菌和灰霉菌孢子萌发的抑制收集病原菌的孢子液，图5.4分别为在普通光学显微镜下拟茎点霉菌和灰霉菌的孢子图。将拟茎点霉菌和灰霉菌孢子悬浮液稀释到1×105个/ml，然后加到含不同姜黄素浓度的PDA液体培养基中上，10h后在显微镜下观察孢子的萌发状态。从图5.5中可以发现姜黄素对两种霉菌孢子的萌发均有一定的抑制作用，在不含姜黄素的的PDA液体培养基中，拟茎点霉菌和灰霉菌孢子萌发率均在90%以上。在含100mg/L、200mg/L、300mg/L姜黄素的PDA培养基中拟茎点霉菌的孢子萌发率分别为75.3%、65.7%和61%。在含200mg/L、400mg/L、600mg/L姜黄素的PDA培养基中灰霉菌的孢子萌发率分别为81.3%、66.8%和63.3%。说明姜黄素对33 合肥工业大学硕士学位论文孢子萌发的抑制率随着浓度的上升而增强，孢子的萌发与病原菌的致病性是息息相关的，观察经过姜黄素处理的孢子萌发率可以判断出病原菌的致病能力。图5.4病原菌的孢子形态Fig.5.4Sporemorphologyofpathogenicfungus图5.5姜黄素处理对病原菌孢子萌发率的影响Fig.5.5EffectofcurcuminoninvitrosporegerminationinPathogen图5.5A表示不同浓度姜黄素处理后拟茎点孢子的萌发率，其中P＜0.05。图5.5B表示不同浓度姜黄素处理后灰霉孢子的萌发率，其中P＜0.05。5.4.3姜黄素对病原菌ROS累积水平的影响吸取30μL浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液加于500μLPDA液体培养基中，在25℃180rpm摇床中连续培养48h后，分别加入5mg/ml的姜黄素溶液，使姜黄素终浓度分别为0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L并继续于28℃摇床中培养，分别在培养24h后取样。在黑暗的条件下，使用25µM荧光探针2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂（H2DCFDA，Invitrogen）在25℃下孵育样品30min，利用激光共聚焦显微镜（FV1000，Olympus）在488nm激发光和520nm发射光下观察菌丝组织的活性氧积累，实验结果如图5.6A所示。从图5.6A中可看出，不论是拟茎点菌丝还是灰霉菌菌丝，在经过不同浓度的姜黄素溶液处理培养24h后，活性34 第五章姜黄素对病原菌的作用氧的累积远远低于未经过姜黄素处理的样品。图5.6B是24h后样品的ROS荧光强度，我们可以看出，随着姜黄素浓度的上升，活性氧的累积水平均呈下降状态，由于菌丝在生长分化过程中会存在ROS的累积，可能是由于在姜黄素处理的情况下会抑制菌丝的生长速度，所以在24h后ROS已处于一个较低的水平，这个结果与菌丝在PDA平板上的生长状态是一致的。35 合肥工业大学硕士学位论文图5.6病原菌菌丝组织中活性氧的累积Fig.5.6AccumulationofROSinmyceliumofpathogenicfungus图5.6A表示孢子液培养48h后用不同浓度姜黄素处理后24h这个时间点，在荧光和明场下菌丝组织中活性氧的累计情况。其中Bar=50µm；图5.6B分别表示在处理24h后菌丝组织中活性氧累计水平的统计，其中P＜0.05。5.4.4姜黄素对病原菌MDA和POD水平的影响丙二醛（MDA）是自由基攻击体内的脂肪产生的氧化产物,可以作为氧化损伤程度的标致。我们把拟茎点菌丝和灰霉菌菌丝通过不同浓度姜黄素溶液培养72h后，分别取样检测病原菌菌丝的丙二醛（MDA）含量以及过氧化物酶（POD）活性，实验结果如图5.7A所示。我们可以看到在拟茎点处理组中，MDA含量是随着姜黄素浓度的上升而降低的，在300mg/L姜黄素的处理下，MDA含量接近对照组的50%，在100mg/L和200mg/L姜黄素的处理下MDA的含量相当，但也明显低于对照组。而POD的活性是随着姜黄素浓度的上升有明显增强，特别是300mg/L的处理组，POD活性远远高于对照组。图5.7B表示的是处理过姜黄素后灰霉菌菌丝的MDA和POD指标的变化，我们可以看出，处理组的MDA含量与对36 第五章姜黄素对病原菌的作用照组存在显著性差异，MDA含量随浓度增加基本呈下降趋势，经过姜黄素处理的POD活性明显高于对照组，600mg/L的处理组POD活性相对于200mg/L和400mg/L处理组要低一些，这可能由于高浓度的姜黄素反而对POD酶活有一定抑制。图5.7不同浓度姜黄素对病原菌菌丝MDA含量和POD活性的影响Fig.5.7TheeffectofcurcuminonmyceliumofpathogenicfungusMDAcontentandPODactivity图5.7A表示不同浓度姜黄素处理对拟茎点霉菌菌丝组织MDA(P＜0.05)和POD(P＜0.1)指标的影响，图5.7B表示不同浓度姜黄素处理对灰霉菌菌丝组织MDA(P＜0.05)和POD(P＜0.05)指标的影响，并对各项数值进行差异显著性分析。5.4.5姜黄素对病原菌CAT活性的影响过氧化氢酶（CAT）可以把过氧化氢分解为水和氧气，可以使机体免受H2O2的侵害。我们将拟茎点菌丝和灰霉菌菌丝通过不同浓度姜黄素溶液培养72h后,取样检测菌丝中CAT活性，图5.8A中我们可以看出，拟茎点霉菌的处理组中CAT活性随着姜黄素浓度增加有一定上升趋势，但是各组之间不存在显著性差异。图5.8B表示的是灰霉菌的CAT活性，可以看出处理组于对照组间是存在显著性差异的，且在400mg/L姜黄素处理下，CAT的活性最高，这种现象的原因可能是姜黄素不能直接激活拟茎点霉菌的CAT活性基团，但具体原因还需要进一步探讨。37 合肥工业大学硕士学位论文图5.8不同浓度姜黄素对病原菌菌丝CAT活性的影响Fig.5.8TheeffectofcurcuminonmyceliumofpathogenicfungusCATactivity图5.8A表示不同浓度姜黄素处理对拟茎点霉菌菌丝组织CAT指标的影响，图5.8B表示不同浓度姜黄素处理对灰霉菌菌丝组织CAT(P＜0.05)指标的影响。5.4.6姜黄素对病原菌GSH-Px活性的影响谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）也是一种重要的过氧化物分解酶，可以把有毒的过氧化物催化还原成无毒的羟基化合物，保护细胞不受过氧化物的侵害。将拟茎点菌丝和灰霉菌菌丝通过不同浓度姜黄素溶液培养72h后取样检测GSH-Px的活性。图5.9A表示的是拟茎点菌丝的GSH-Px酶活，处理组中GSH-Px的活性明显高于对照组，并且活性水平与选定的浓度范围内呈正相关。图5.9B中显示的是灰霉菌菌丝的GSH-Px活性变化，我们可以看出经过姜黄素处理的菌丝组织中的GSH-Px活性与对照组中有显著性差异，与POD和CAT一样，用400mg/L姜黄素处理的菌丝组织中GSH-Px活性最高。图5.9不同浓度姜黄素对病原菌菌丝GSH-Px活性的影响Fig.5.9TheeffectofcurcuminonmyceliumofpathogenicfungusGSH-Pxactivity图5.9A表示不同浓度姜黄素处理对拟茎点霉菌菌丝组织GSH-Px(P＜0.05)指标的影响，图5.9B表示不同浓度姜黄素处理对灰霉菌菌丝组织GSH-Px(P＜0.05)指标的影响。38 第五章姜黄素对病原菌的作用5.4.7姜黄素对病原菌SOD活性的影响超氧化物歧化酶（SOD）可以催化超氧阴离子的分解，保护机体免受超氧阴离子的影响。我们将拟茎点菌丝和灰霉菌菌丝通过不同浓度姜黄素PDA溶液培养72h后取样检测菌丝组织中SOD的活性。图5.10A中可以看出，拟茎点处理组中，经过100mg/L，200mg/L的姜黄素处理后，菌丝中SOD活性与对照组相比具有显著性差异，300mg/L的处理组中菌丝SOD的活性具有一定抑制。在5.10B的灰霉菌处理组中，可以看出随着浓度增加，SOD的活性是呈升高趋势的，并与对照组之间存在显著差异。图5.10不同浓度姜黄素对病原菌菌丝SOD活性的影响Fig.5.10TheeffectofcurcuminonmyceliumofpathogenicfungusSODactivity图5.10A表示不同浓度姜黄素处理对拟茎点霉菌菌丝组织SOD(P＜0.05)指标的影响，图5.10B表示不同浓度姜黄素处理对灰霉菌菌丝组织SOD(P＜0.05)指标的影响。5.4.8姜黄素处理对灰霉菌中Bmp3和Sak1基因的影响将分别在0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L的姜黄素PDA培养基中培养72h的菌丝体取样，提取每个样品的RNA，并对相关基因的表达水平进行测定。如图5.1所示，Bmp3基因在用姜黄素处理后，表达水平呈下调，并随着浓度的降低，表达水平逐渐减弱。Sak1基因在用200mg/L的姜黄素处理后表达水平有上升，但是在400mg/L和600mg/L的姜黄素处理下，表达水平明显降低。Bmp3和Sak1基因皆为灰霉菌的致病基因，在姜黄素处理后表达水平的下降可以解释姜黄素对灰霉菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用[104]。39 合肥工业大学硕士学位论文图5.11灰霉菌菌丝Bmp3/Sak1基因的相对表达水平Fig.5.11RelativeexpressionofBmp3/Sak1inmyceliumofpathogenicfungus图5.11A表示在不同浓度姜黄素处理后菌丝中Bmp3(P＜0.05)基因的相对表达水平，图5.11B表示在不同浓度姜黄素处理后菌丝中Sak1(P＜0.05)基因的相对表达水平，内参为Actin。5.4.9姜黄素处理对灰霉菌中SOD1、10823和6200基因的影响将分别在0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L的姜黄素PDA培养基中培养72h的菌丝体取样，提取每个样品的RNA，并对相关基因的表达水平进行测定。我们从图5.2可以看出，处理过姜黄素的菌丝中SOD1基因的表达有所上升，10823和6200基因为NADPH两个亚基的编码基因，可以催化氧化型谷胱甘肽还原成谷胱甘肽，这三种酶在通过姜黄素处理后的菌丝中该基因表达水平显著上升，且在600mg/L处理组中，表达水平最高。这些结果说明了，姜黄素的处理可能会抑制灰霉菌致病基因的表达，提高了酶活相关基因的表达，从而可以抑制病原菌的生长和孢子萌发。40 第五章姜黄素对病原菌的作用图5.12灰霉菌菌丝SOD1/10823/6200基因的相对表达水平Fig.5.12RelativeexpressionofSOD1/10823/6200inmyceliumofpathogenicfungus图5.12A表示在不同浓度姜黄素处理后菌丝中SOD1基因的相对表达水平，图5.12B表示在不同浓度姜黄素处理后菌丝中10823(P＜0.05)基因的相对表达水平，图5.12C表示在不同浓度姜黄素处理后菌丝中6200(P＜0.1)基因的相对表达水平，内参为Actin。41 合肥工业大学硕士学位论文第六章结论与讨论6.1结论本研究以果蔬采摘后容易发生的真菌性病害的防控为出发点，在拟茎点霉菌和灰霉菌分离鉴定基础上，将姜黄素作为研究对象，通过设置不同浓度的处理，在离体和活体条件下从生理和分子层面开展姜黄素抑制病原真菌的相关研究。（1）实验用不同浓度的姜黄素分别处理猕猴桃的人造伤口后，再接种拟茎点和灰霉孢子液，贮藏并检测果实发病率和已发病果实上病斑直径的差异。结果表明姜黄素可以有效延缓病原菌在猕猴桃果实上的发病时间，对于病斑的扩展也有显著的抑制作用，这些结果说明姜黄素对于猕猴桃的贮藏时间的延长具有一定效果。（2）进行体外接种实验验证不同浓度姜黄素对拟茎点和灰霉菌菌落扩展的抑制和病原菌孢子的萌发，并检测不同浓度姜黄素处理后的菌丝组织中ROS、MDA、POD、CAT、GSH-Px、SOD等指标含量或者活性的变化。在含有姜黄素的PDA固体培养基上，拟茎点和灰霉菌的菌落扩展都具有显著性抑制，拟茎点霉菌在含300mg/L的姜黄素PDA中抑制效果最明显，灰霉菌在含600mg/L姜黄素的PDA培养基中，对菌落的扩展抑制效果最好。随着培养天数的增加，抑制作用会有一定的下降。姜黄素不仅对菌丝生长有抑制，对于病原菌的孢子萌发同样具有显著的抑制作用，与对菌落扩展的抑制趋势一样，抑制效果与姜黄素浓度成正比。姜黄素对于生长分化中的拟茎点和灰霉菌丝中ROS水平具有显著抑制，对照组菌丝中的ROS荧光强度远远高于用姜黄素处理24h后的荧光强度，病原菌中MDA的含量也会由于姜黄素的抑制而呈下降趋势，而两种病原菌中POD、CAT、GSH-Px、SOD等酶活性会在姜黄素处理下具有增强的表现。猜想可能在姜黄素作用下，菌丝生长受到抑制，因此产生了应激反应，从而提高了抗氧化酶的活性。（3）通过实时定量PCR检测不同浓度姜黄素处理后的灰霉菌菌丝中相关基因的表达水平，找出姜黄素与病原菌互作中可能存在的分子机制。本研究分别检测了对照组和不同姜黄素处理组灰霉菌中两个致病相关基因和三个酶活相关基因的表达水平，结果表示姜黄素处理对于灰霉菌的致病基因Bmp3和Sak1的表达水平明显下降，而SOD1、10823和6200基因在姜黄素存在的情况下，表达水平有明显的上升。从这些结果中，我们猜想姜黄素处理可能会激活了灰霉菌的MAPK信号通路，从而对灰霉菌的生长以及活性产生一定的抑制。42 第六章结论与讨论6.2讨论姜黄素是姜黄中的的一种有效成分，是一种天然的抗氧化剂，广泛用于食品保鲜和食品防腐。本研究中发现姜黄素可以有效降低猕猴桃的发病率，抑制病斑直径的扩展，显著降低了猕猴桃的病情严重度（图4.1、图4.2），这与高慧等[94]报道姜黄素能够对灰霉和扩展青霉有良好的抑制作用，延长果脯蜜饯贮藏时间的结论相符，司徒满泉等[111]也曾报道姜黄素保鲜剂可以降低马水桔的呼吸强度，提高果实的保鲜效果。这些结果表明，姜黄素在食品的抑菌、保鲜方面具有很高的应用价值。在真核细胞中，MAPK由MAPK激酶(MEK或MAPKK)对TXY基序进行双磷酸化激活，而MEK激酶(MEKK或MAPKK)又激活MAPK，MAPK级联的顺序激活最终激活转录因子和相关基因的表达[103]。在芽殖酵母中，已发现的有五条MAPK通路在调节交配、侵入性生长、细胞壁完整性、高渗透调节和孢子形成中起着枢纽作用[104]。研究发现[104]灰霉菌中bmp3突变体的气生菌丝或分生孢子座上的大型分生孢子数比野生型的少，对于芽管和菌核的形成表现出缺陷表型，这与本论文中姜黄素处理下的灰霉菌菌丝中基因Bmp3表达水平下降相符合（图5.11）。bmp3突变体对百草枯和苯吡咯杀菌剂氟二恶唑的敏感性有所提高，在穿透洋葱表皮细胞和发生坏死性病变方面有所削弱，但是[104]SLT2基因的缺失对禾谷和灰霉病菌细胞壁裂解酶和抑制剂的敏感性没有明显影响。Fus3/Kss1-MAPK信号通路中的Bmp1基因突变后会抑制灰霉病原菌的生长速度，减弱其致病性，对碳源的响应和孢子萌发方面也有缺陷[110]。但是本研究中灰霉菌菌丝在被姜黄素处理过后Bmp1基因的表达几乎没有变化，可能由于姜黄素并不能激活所有Bmp同源基因的表达。sak1突变体的致病性明显减弱，同样可以抑制菌核形成，但在附着胞中这种抑制会减弱，对于二甲酰亚胺的诱导没有明显表型，但对苯基吡咯或芳香烃杀菌剂敏感性增强[105]。Dixon等发现[106]M.oryzae中的HOG1-MAPK级联途径可能是一条单独控菌丝和孢子的信号通路，与附着胞之间没有直接关系。在几种植物病原真菌中，HOG1-MAPK通路也会调节氧胁迫和紫外胁迫下的应激反应。通常，敲除Hog1同源基因会增加对氧化剂的敏感性[106][107]，在一些丝状真菌N.crassa，C.lagenarium，和M.grisea中，当阻断HOG信号通路后，对苯吡咯、双羧肟和芳香烃杀菌剂都具有抗药性[103]。研究表明[109]，在M.oryzae中mst7和mst11突变体无法形成附着胞，大大减弱了对叶片的侵染能力。从这些研究结果中我们发现，MAPK可以通过不同级联途径调控不同病原真菌的生长分化过程，而姜黄素具体是如何激活病原菌的MAPK级联途径从而抑制病原菌的致病性，以及姜黄素处理后的猕猴桃在贮藏品质方面有没有影响，还有待进一步研究，为果实贮藏保鲜提供理论依据。43 合肥工业大学硕士学位论文参考文献[1]廖慧苹.猕猴桃产业的市场现状及发展对策[J].南方农机,2017,48(14):155.[2]兰霞,贺立静,贺立红,梁红.猕猴桃果实采后保鲜技术[J].北方园艺,2010(14):172-173.[3]AnnieOnOnChan,GigiLeung,TeresaTong,NinaYHWong.IncreasingdietaryfiberintakeintermsofkiwifruitimprovesconstipationinChinesepatients[J].WorldJournalofGastroenterology,2007(35):4771-4775.[4]刘世珍.中华猕猴桃的营养价值[J].中国食物与营养,2003(05):48-49.[5]BurdonJ,ClarkC.Effectofpostharvestwaterlosson‘Hayward’kiwifruitwaterstatus[J].PostharvestBiology&Technology,2001,22(3):215-225.[6]朱建斌,郭颖奇.猕猴桃贮藏保鲜技术[J].保鲜与加工,2005(04):43-44.[7]WilliamsonB,TudzynskiB,TudzynskiP,etal.Botrytiscinerea:thecauseofgreymoulddisease.[J].MolecularPlantPathology,2007,8(5):561.[8]StaatsM,VanBP,SchoutenA,etal.Positiveselectioninphytotoxicprotein-encodinggenesofBotrytisspecies.[J].FungalGenetics&Biology,2007,44(1):52.[9]ZhangH,LiR,LiuW.EffectsofChitinandItsDerivativeChitosanonPostharvestDecayofFruits:AReview[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2011,12(2):917-934.[10]WangS.[ProgressinProteomicStudyofthePenicillinProducer---PenicilliumChrysogenum].[J].ShengWuYiXueGongChengXueZaZhi.2015,32(6):1354-1358.[11]汪宏涛.壳聚糖抑制樱桃番茄采后灰霉病和青霉病及分子机理研究[D].合肥工业大学,2017.[12]王静,冯梅凤,杨碧敏,林丽莎,林河通.猕猴桃果实采后生理、采后病害与保鲜技术研究进展[J].包装与食品机械,2014,32(04):53-57.[13]李雪光,潘凤娟,宋洁,许艳丽.拟茎点霉属及其病害研究进展[J].大豆科技,2012(06):32-37.[14]SuttonBC．TheCoelomycetes[M]．Firstedition，CABI，1980.[15]罗利娟,习平根,姜子德,戚佩坤.纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件[J].菌物学报,2004(02):219-225.[16]DiogoELF,SantosJM,PhillipsAJL.Phylogeny,morphologyandpathogenicityofDiaportheandPhomopsisspeciesonalmondinPortugal[J].FungalDiversity,2010,44(1):107-115.[17]SchumacherJ.ToolsforBotrytiscinerea:Newexpressionvectorsmakethegraymoldfungusmoreaccessibletocellbiologyapproaches.[J].FungalGenetics&BiologyFg&B,2012,49(6):483-497.44 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