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位代码：１０１８３分类号：Ｑ８１９单４Ｅ００１密级：公开研究生学号：２０１４３吉林大学硕士学位论文业学位（专）ＨＰＶ１６病毒样颗粒疫苗在昆虫细胞表达系统中的优化表达－ｔｆｌｌｅｘｒｅｓｓｉｏｎｓｓｔｅｍｏ１６ｖｉｃｌｅｓｉｎｉｎｓｅｃｃｅＨＰＶｉｒｕｓｌｉｋｅｐａｒｔｐｙｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ作者姓名：白鹭类别：生物工程领域（方向）：生物工程指导教师：姜春来教授培养单位：生命科学学院２０１７年１２月 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、、发行出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年ａ月丨日 HPV16病毒样颗粒疫苗在昆虫细胞表达系统中的优化表达HPV16virus-likeparticlesininsectcellexpressionsystemofoptimization作者姓名：白鹭领域（方向）：生物工程指导教师：姜春来教授学位类别：工程硕士论文答辩日期：年月日 中文摘要HPV16病毒样颗粒疫苗在昆虫细胞表达系统中的优化表达HPV对于大多数女性而言，是一过性感染，大约80%的女性一生之中至少要感染一次HPV，在其引起细胞发生异常改变之前可以通过人体自身免疫力将它完全清除，不会对健康构成危害，也无法进行检测据研究结果表明，自从首次在宫颈癌组织中发现了HPV，则证实大约15种高危基因型HPV持续感染宫颈可以导致宫颈癌，癌前损害以及3级宫颈上皮内瘤病变（CIN3）、原位腺癌（AIS）。伴随着现代基因工程技术的飞速发展,已经建立了很多种异源蛋白的表达系统。昆虫细胞-杆状病毒表达系统自二十世纪八十年代问世，至今已不断改进完善，是重组蛋白表达技术的重要组成部分。与哺乳细胞的表达系统相比，昆虫细胞的表达量高，培养方式多样，且安全性好，具有广泛的应用。本文着重研究在昆虫细胞表达系统中，病毒的不同病毒感染复数（MOI）、不同的细胞感染密度(DOI)、不同细胞收获时间（TOH）对与HPV16L1的表达的影响。HPV16L1的构建表达：通过PCR合成16L1的基因，按照去除核定位信号设计PCR引物扩增截短型HPV16型目的基因，测序无误后重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBacTM1，将目的基因片段重组入Bacmid基因组，提取重组的BacmidDNA，M13引物PCR鉴定正确，将重组的杆状病毒Bacmid-HPVL1用转染的方法转染sf9细胞大量感染昆虫细胞后获得P1,P1继续感染细胞获得P2,依次类推，获得大量P4代滴度稳定的毒种原液。在确定毒种能在昆虫细胞中稳定表达后，设计以下三个优化表达的实验，⑴对病毒不同感染复数(MOI)的摸索：将细胞的接种密度(DOI)定在2.5×106个/ml，加毒后的第72小时收获，用不同的病毒感染复数(MOI)分别在昆虫细胞中表达后，收获细胞进行SDS电泳鉴定，确定最佳的病毒MOI；⑵对不同的细胞感染密度(DOI)的摸索：选取病毒感染复数(MOI)为0.5，加毒后的第72小时收获，用不同的细胞的感染密度I (DOI)中接种毒种，在昆虫细胞中表达后，收获细胞进行SDS电泳鉴定，确定最佳细胞感染密度(DOI)；⑶对不同收获时间（TOH）的摸索：选取病毒感染复数(MOI)为0.5，细胞的感染密度(DOI)定在2.5×106个/ml，接毒后按时间段分别取样收获后进行SDS电泳鉴定，确定最佳的收获时间。通过上述三个优化实验后，确定HPV16L1在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的最佳表达参数，在病毒感染复数（MOI）为0.5，细胞感染密度(DOI)在2.5×106个/ml，在感染细胞后72小时收获，HPV16L1在昆虫细胞中的表达量可达到150μg/ml，大量表达后进行超速离心纯化，通过免疫小鼠获得血清，应用假病毒中和抗体实验来检验免疫原性。本文通过对HPV生产工艺的初步研究，对未来生物制品在工业上的生产放大有一定指导意义。关键词：人乳头瘤病毒昆虫细胞优化表达抗体中和实验II AbstractHPV16virus-likeparticlesininsectcellexpressionsystemofoptimizationHPVformostwomen,isatransientinfection,about80%ofthefemalelifeatleastonceHPVinfection,beforeitcausedabnormalcellsthroughthebody'sownimmunesystemwillcompletelyremoveit,noharmtohealth,cannotbedetectedaccordingtotheresultsofthestudyshowthat,forthefirsttimesincethediscoveryofHPVincervicalcarcinoma,confirmedabout15high-riskgenotypesofHPVpersistentinfectioncancausecervicalcancer,precancerouslesionsand3cervicalintraepithelialneoplasia(CIN3)andadenocarcinomainsitu(AIS).Inrecentyears,somestudiesfoundthatHPVmayandothercancersaswellascorrelation,throatcancer,forexample,oftenoccurinmen,peopleoftenthinkbeforeitsassociatedwithsmoking,drinking,chewingbetelnut,butnowithasevidencetoprovethat,about30-40%oftheoccurrenceofcertaintypeofthroatcancerassociatedwithHPV.IntheHPVpositiveofthroatcancerinthecrowd,withtherapiddevelopmentofmoderngeneticengineeringtechnology,hassetupalotofkindsofheterologousproteinexpressionsystem.Fornow,theexpressionofprophylacticHPVvaccinesystemincluding1e.coliexpressionsystem,2yeastexpressionsystem,insectcellexpressionsystem.Insectcellbaculovirusexpressionsystemsincethe1980s,hasbeencontinuouslyimproved,isanimportantpartoftheexpressionofrecombinantproteins.Comparedwithmammaliancellexpressionsystem,insectcellexpressionquantityhigher,cultivatingwaymorediverse,andbettersecurity,ithasawiderapplication.Thispaperstudiesonthestabilityoftheknowninsectcellexpressionsystem,thedifferentvirusinfectionofthevirustheplural(MOI),differentcelldensity,themutualcontactandinfluencebetweendifferentcellharvesttime.HPV16typeVLPbuildexpress:synthesistype16genesbyPCR,accordingtotheapprovedasignaldesignPCRprimersamplificationtruncatedtypeHPV16type,genesequencingrightafterthereorganizationintotheshuttleplasmidpFastBac1baculovirusexpressionsystem,throughgeneticshiftfunctionwillaimgenerecombinantBacmidgenome,extracttherestructuringBacmidDNA,M13primerIII PCRidentificationiscorrect,therecombinantbaculovirusBacmid-HPVL1transfectionsf9cellsinfectedaftertheinsectcellsofP1,P1continuetoinfectcellsgetP2andsoon,getalotofstabletiterofpoisonouskindofconcentrate.AnddeterminethepoisonoftheMOI.Experiment1:suspensioncultureSF9cells,thecellgrowthundertheconditionofnormalgrowthcurvedrawing,withcertainvirusesMOIvaluesagainstpoisoneverypointonthegrowthcurve,post-harvestwesternblotappraisal,lookatthatpoint,theexpressionofthehighestamount.Experiment2:fixedapointonthegrowthcurve,withdifferentvirusattackMOIpoisonedthis,afterharvestwesternblot,beholdaMOIexpressionquantityisbest,thenpurifiedbycolumnchromatography,andfinallythroughtheantibodyneutralizationexperimenttotestwhetherthereisimmunogenicity.TheexperimentalresultsshowthattheMOI,mustberepresentedinSF9cellsafter72hoursoftheattackpoisontoexpressthehighestamount.InSF9cellsonthegrowthcurveoffixed72hoursafterthewedding,whenthevirusMOIis0.5,theexpressionofpoisonattackthehighestamount.ThisarticlethroughtoHPVthepreliminaryresearchontheproductionprocess,biologicalproductsforthefuturehascertainguidingsignificanceforindustrialproductionofamplification.Keywords:humanpapillomavirus,insectcell,optimizedexpression,neutralizationtestIV 缩略词表缩写英文中文HPVHumanPapillomavirus人乳头瘤病毒L1Late1protein晚期蛋白1型VLPsVirusLikeParticles病毒样颗粒MOIMultiplicityOfInfection感染复数TOHHarvestOfTime收获时间PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应DMEMDulbeccoModifiedEagleMedium改进后的MEM培养基ATCCAmericantypeculturecollection美国典型物保藏中心DOIdensityofinfection细胞感染密度FBSFetalBovineSerum胎牛血清BESBaculovirusexpressionsystem当杆状病毒表达系统CFDAChinaFoodandDrugAdministration中国食品药品监督管理总局V 目录第一章前言............................................................................................................11.1人乳头瘤病毒研究的概述...............................................................................11.2人乳头瘤病毒及其相关疫苗研究...................................................................21.3VLP疫苗的前景与发展...................................................................................51.4表达系统的选择...............................................................................................71.5昆虫细胞-杆状病毒表达体系在疫苗中的应用..............................................71.6本篇论文的设计思想.......................................................................................9第二章实验方法......................................................................................................112.1材料..................................................................................................................112.1.1质粒、菌株以及细胞系...........................................................................112.1.2主要试剂...................................................................................................112.1.3仪器与设备...............................................................................................122.1.4溶液配置...................................................................................................132.2实验方法.........................................................................................................152.2.1昆虫细胞的培养.......................................................................................152.2.2293FT细胞的培养...................................................................................162.2.3杆粒构建...................................................................................................172.2.4重组杆粒的转染以及毒种的传代...........................................................172.2.5毒种滴度的测定.......................................................................................182.2.6SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法.......................................................192.2.7HPV16L1病毒样颗粒在昆虫细胞中的优化表达................................202.2.8HPV16L1病毒样颗粒的大量表达及纯化............................................212.2.9HPV16L1病毒样颗粒的小鼠免疫........................................................212.2.10假病毒中和抗体滴度测定.....................................................................21I 第三章结果和讨论..................................................................................................233.1HPV16L1序列的扩增与构建杆状病毒转移载体......................................233.2重组杆粒的转染和毒种的传代.....................................................................243.3HPV16L1病毒样颗粒在昆虫细胞中的优化表达.......................................263.3.1HPV16L1病毒样颗粒在昆虫细胞中的表达及鉴定............................263.3.2昆虫细胞的生长曲线...............................................................................273.3.3对不同病毒的MOI的摸索.....................................................................283.3.4对不同细胞感染密度的摸索...................................................................293.3.5对不同收获时间的摸索...........................................................................303.4杆状病毒的大量表达及纯化.........................................................................323.5假病毒中和抗体滴度测定.............................................................................33结论..........................................................................................................................34参考文献......................................................................................................................35致谢..........................................................................................................................40II 第一章前言第一章前言1.1人乳头瘤病毒研究的概述人乳头瘤病毒(HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，外壳直径50-55nm，为20面对称体。是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，例如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的乳头状瘤[1]。自从首次在宫颈癌组织中发现了HPV，则证实大约15种高危基因型HPV持续感染宫颈可以导致宫颈癌，癌前损害以及3级宫颈上皮内瘤病变（CIN3）、原位腺癌（AIS）[2]。HPV与宫颈癌的发生可用一个简单的四步模型来描述：见图1.1HPV的感染HPV持续发展发生侵袭性癌症出现癌前损害图1.1HPV对于大多数女性而言，是一过性感染，大约80%的女性一生之中至少要感染一次HPV，在其引起细胞发生异常改变之前可以通过人体自身免疫力将它完全清除，不会对健康构成危害，也无法进行检测[3]。大部分感染在一两年内可自动消除或被自身免疫力抑制，不会引起病变。HPV导致宫颈癌的生物学特征具有连续性，不应简单的区分为致癌HPV和非致癌HPV。HPV促发宫颈癌主要与HPV感染暴露的时间和数量有关，与感染是否持续存在有关，此外，也与预防措施有关。HPV持续感染就可能意味着癌前损害，然而癌前损害和微侵袭性癌间的转化并不明确，多长时间持续HPV感染就可称为癌前损害也不确定[4]。宫颈癌产生的重要一步是存在明显的HPV感染，尤其是超过1年或是2年1 第一章前言者强烈提示可能出现宫颈癌的癌前损害，如皮内瘤变3级（CIN3）或原位腺癌(AIS)。如果小的癌前损害未检测到，可能会逐渐增大并累积遗传学改变，这将增加侵袭潜能。中年女性未经治疗的癌前损害，大约经过15年的累积变化，在其后30年内成为侵袭性癌的风险为30%[5]。1999年国际病毒分类委员会（ICTV）正式取消多瘤空泡病毒科，代之以乳头瘤病毒科。目前已经分离出130多种HPV病毒，感染率最高的是16、18型，他们可以引起71%宫颈癌，60%的阴道肿瘤，40%的外阴癌，不同性别可以引起不同的临床表现，具体见以下表1.1[6]。表1.1HPV病毒类型种类与其相关的疾病皮肤低危型HPV-1、2、3、4、5、7、10、12、15等寻常疣、扁平疣、跖疣等皮肤高危型HPV-5、8、14、17、20、36、38疣状表皮发育不良以及外阴癌、阴茎癌、肛门癌、前列腺癌、膀胱癌黏膜低危型HPV-6、11、13、32、34、40、42、43、44、生殖器、肛门、口咽部、食53、54等道黏膜等处的感染黏膜高危型HPV-16、18、30、31、33、35、39宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等由于人体感染了人乳头瘤病毒（HPV）[7]之后所引起的宫颈癌，是仅次于乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌的世界女性第四大癌症[7]。HPV的感染途径主要分为以下五种：1性传播途径；2密切接触；3间接接触：通过接触感染者的衣物或生活用品；4医源性感染；医务人员在治疗护理时防护不好，造成自身感染或通过医务人员传给患者；5母婴传播：是由婴儿通过孕妇产道的密切接触。由于HPV是导致宫颈癌的必要因素，最近几年世界卫生组织已经在这一领域研制出具有预防疾病传染效果的疫苗。通过研究，采取了各种不同的方法来设计合成这种癌症的预防疫苗。1.2人乳头瘤病毒及其相关疫苗研究根据选定的疫苗抗原，HPV疫苗被分为L1和L2两种类型（J.W.王等，2015b）。2 第一章前言L1（主要的衣壳蛋白）和L2（次要的衣壳蛋白）是HPV病毒衣壳中发现的两种后期蛋白（Wu等，2015）。目前已经有三种疫苗上市，分别是HPV预防性疫苗、宫颈癌二联疫苗（GlaxoSmithKline）以及Gardasil®四联疫苗和九联疫苗（Merck&Co.Inc.）2016年7月12日，中国食品药品监督管理总局（CFDA），批准葛兰素史克（GlaxoSmithKline）公司的预防用生物制品--人乳头瘤病毒吸附疫苗的进口注册申请。2017年7月31日，HPV疫苗——希瑞适在中国内地正式上市供应。目前这三种已经得到广泛认可的疫苗都是由L1蛋白包装成的病毒样颗粒（VLP）制成的[8]。这三种疫苗可以预防HPV16型和HPV18型，而恰恰是这两种类型的HPV是发病最普遍的高风险类型，它们各自引起了50%和20%的宫颈癌[9]。另外，Gardasil®四联疫苗也覆盖了HPV6型和HPV11型，这两种病毒就可以造成90%的良性生殖器疣。此外Gardsil®九联疫苗则主要针对5种高风险HPV类型：31型、33型、45型、52型和58型[10,11]。由于VLPs上抗原表位密集重复的排列，所以它们在持续有效的免疫诱导下产生的抗体是十分有效的[12,13]。然而，L1免疫原性主要通过病毒原颗粒的形式体现[14,15]。而且，由于真核生物的宿主的生产过程十分复杂，例如杆状病毒[16]，以及运输储藏都需要冷链技术配合，它们的前期准备工作和后期的转移都是非常昂贵的[10,11,14,17]。据调查，发展中国家的宫颈癌发生率是最高的，由宫颈癌引起的死亡也是最高的[18]。可是其昂贵的价格已经成为了这些疫苗在许多国家尤其是发展中国家得到普遍免疫注射的严重阻碍。这时，作为HPV预防疫苗的替代品---L2蛋白的氨基端（前120种氨基酸）已经被广泛研究。L2蛋白的氨基端有着线性的大致跨中和保护性表位。这个地点得到了最好的保存，并且可以曝露在病毒颗粒的表面。大肠杆菌中廉价的基于L2疫苗的产物能很好的解决HPV疫苗的价格问题。L2主要被其低免疫原性所限制，表现在淋巴细胞（1和2）活动的缺乏上，这是亚单位肽疫苗的普遍问题。尽管这种疫苗在一个小的临床试验中显示了成功，并且一些L2同其他表位的组合已经被调查得出是有效的治疗疫苗。而且其动物模型的抗体滴度有所升高，但是基于L2的预防疫苗仍未通过临床试验.就目前来看，使用强力佐剂或者多价表达是解决L2抗原的低免疫原性最可能的方式。最近几年，Toll样受体（TLR）-激动剂被称为有希望的佐剂。TLRs是一组模式识别受体（PRRs），它们可以通过识别细菌中一种受保护的分子结构激活先天免疫系统。这种分子结3 第一章前言构被称为病原相关分子模式，TLRs可以通过同抗原递呈细胞（APC）的密切联系增强同载抗原的处理能力。TLR4作为配体的佐剂广泛应用于一些商业疫苗中，例如Fendrix®和Cervarix®。鞭毛蛋白，一种TLR5配体，也能有效激活先天和适应性免疫系统，因而在许多研究中都被作为一种有效的疫苗佐剂使用。现在，在已出台的现行实验性研究中，一些生物信息学知识的工具使用，可在不同的生物学领域进行预测。尤其在疫苗开发中，免疫信息学服务者在鉴别潜在的T细胞粘合表位、评估蛋白质不同的特色等等中非常重要。在这项研究中，为了开发一种新的治疗HPV16的多表位预防性疫苗，不同的免疫信息学工具被用于研究L2蛋白顺序，以找到能够刺激体液和细胞免疫的表位。一些佐药，包括鞭毛蛋白，被组合在一起来解决多肽疫苗的低免疫原性问题。所提出的疫苗结构和TLR5的构成、稳定性以及相互作用由分子动力学模拟研究。目前在我国供应的HPV疫苗为葛兰素史克（GlaxoSmithKline）公司的二价疫苗，接种该种疫苗对接种人有以下要求：女性应于9-25岁未开始性生活，没有感染HPV病毒前的女孩或女青年接受HPV疫苗接种，疫苗的有效性持续时间大约为5-15年左右，对于已经有性生活并感染HPV病毒的女性，疫苗是无治疗效果的。今年5月，由默沙东公司生产的四价疫苗已获得了国家食品药品监督管理总局批准，据了解，该疫苗有望在2017年年底上市销售，四价疫苗的接种人群适用年龄为20-45岁。疫苗覆盖几种型别的HPV，就称为几价，价数越高，HPV病毒覆盖面越广，如下表1.2所示，4 第一章前言表1.2三种多价疫苗对疾病的覆盖情况【9合1】HPV疫苗【4合1】HPV疫苗【2合1】HPV疫苗6、11、16、18、31、33、预防HPV类型6、11、16、1816、1845、52、58适用年纪女性≥9岁男性≥9岁女性≥9岁男性≥9岁女性≥9岁男性≥9岁子宫颈癌覆盖——覆盖——覆盖——外阴癌前病变覆盖——覆盖——覆盖——阴道颈癌前病变覆盖——覆盖——覆盖——子宫颈癌前病变覆盖——覆盖——————生殖器官湿疣覆盖覆盖覆盖覆盖不覆盖——肛门癌覆盖覆盖覆盖覆盖覆盖——阴道癌覆盖——不覆盖——————外阴癌覆盖——不覆盖——覆盖——从上表中可以看出，HPV2价疫苗依旧有其积极的意义，2价疫苗主要用于女性，不推荐男性接种，不过对于男性来说，直接接种4价或者9价疫苗才是明智的选择。1.3VLP疫苗的前景与发展自从在感染人群[19]的血液中发现了非传染性乙肝病毒（HBV）颗粒，使用非传染性病毒颗粒来开发预防性人体疫苗就成为了一个诱人的想法。病毒颗粒是绝佳的疫苗抗原，因为它们在其表面显示出一系列抗原表位，这些抗原表位能更形象地模拟天然病毒体。VLP由病毒衣壳蛋白组成，病毒衣壳蛋白自我组成类似于天然病毒体的颗粒，病毒衣壳蛋白源于天然病毒体。由于缺乏任何传染性遗传物质，VLPs不能复制，也不能传染[20]。由于非常类似于其天然病毒，即使没有佐剂，VLPs也能够引起体液性免疫和细胞免疫反应。VLPs通过联合表达和其在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞中进行自组装。基于类病毒颗粒（VLPs；见词汇表）的方法是一种更为安全的预防接种方法，因为重组的VLPs不包含病毒性基因。直径22nm的球形微粒由HBV表面抗原（HBsAg）组成，并产生于人体血浆；1981年它们在美国通过许可被归为疫苗[21]。随着DNA重组技术的开展，在酵母中（酿酒酵母）合成出的22nm的5 第一章前言HBsAg微粒在1986年作为第一种重组人体疫苗由默克公司生产出来，产品的商标-RECOMBIVAXHB[22]-[24]。衍生于酵母的HBsAg微粒从本质上同衍生于血浆的微粒在形态学、表面特征和免疫学特性上是同样的[25]。第一种基于VLPs的重组疫苗取得了巨大成功，并且与其类似的HBsAg乙肝疫苗在许多国家获得生产许可[26]。但是，20年后新一代基于VLP的重组疫苗才获得许可用于人类-Gardasil（Merck），这种疫苗用于抵抗和人乳头瘤病毒（HPV）相关的疾病。通过美国疾病控制与预防中心[27]的研究，数据显示：由于这种疫苗的广泛应用，到2013年中期，青少年HPV感染减少了50%。由此可见HPV疫苗的接种对疾病的控制还是相当成功的。在临床上，要把实验室研究转换为合格的疫苗供人类使用，仍然需要很长的时间。据研究，世界范围内近半的宫颈癌都是由HPV16造成的，运用这种病毒Frazer等在1991年通过研究获得了合成VLPs的方法[28]，因为要表达两种衣壳蛋白-L1和L2，必须使用重组牛痘病毒在哺乳动物细胞里的表达系统[28]表达，所以这些方法昂贵而复杂，一年后，JohnSchiller、DouglasLowy和其他人使用了一种似牛模型，表明主要的衣壳蛋白L1能够自己组合成VLPs，而不用L2，并在动物实验中产生了高水准的中和抗体[29]。实际上，“仅含L1”的VLP很大程度上模仿了HPV病毒体，同时通过透射电子显微镜法，L1的五聚体，或者“衣壳粒”在VLP表面清晰可见。后来，Schiller的研究小组证实，当HPV16L1在杆状病毒中表达时，不管有没有L2的表达，它能有效地自己组合成VLPs。“仅含L1的”VLPs为VLP生产的商业化的生物工艺和生物分析提供了一种更为简单的途径。约在Gardasil在美国得到允许的3年后，第二种基于VLP的HPV疫苗也获得了许可，Cervarix（GlaxoSmithKline）,它是在基于杆状病毒的昆虫细胞表达系统中生产的。基于VLP的重组疫苗Hecolin（XiamenInnovaxBiotech）2011年在中国获得生产许可，预防戊型肝炎病毒（HEV）感染，这种感染是基于VLP疫苗预防的疾病的的第三种疾病[30,31]。目前，对加强型研究对象的研究是基于VLP的疫苗的新方向，包括有关病原体的新型研究，例如经历肾移植的病人身体中的BK多瘤病毒[32]；以及新的方法，比如将新的表位移植到已研究充分的病原体现存的VLP平台上，例如流感病毒[33]。这些疫苗在人体健康方面依然扮演着重要角色。6 第一章前言1.4表达系统的选择随着现代基因工程技术的飞速成长,已经创立了很多种异源蛋白的表达系统。就目前看来，预防性的HPV疫苗的表达体系就包括1、大肠杆菌表达系统，2、酵母表达系统，3、昆虫细胞表达系统（BES）。自从1983年来，当杆状病毒表达系统（BES）首次被用于在昆虫细胞[17]中表达人体干扰素β时，BES已成为一种外源蛋白表达的普遍且强大的真核生物表达系统。与其他常用的重组蛋白表达系统相比，昆虫杆状病毒表达系统具有外源基因表达水平高，易于表达异源多聚蛋白以及安全性等一系列优势。目前，有两种广泛地应用于BES的杆状病毒属作为媒介在昆虫细胞或桑蚕幼虫中制造特异蛋白，即苜蓿银纹夜蛾多型核型多角体病毒（AcMNPV）和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)。在高度表达晚期启动子的控制下（包括多角体蛋白(polh)和纤维多肽（p10）启动子），两种病毒都能表达外源基因。最常用的源自草地贪夜蛾鳞的翅目昆虫细胞系（Sf9和Sf21）以及粉纹夜蛾（Tn5，商业上称为HighFiveTM），它们最适合在避光条件下27℃生长但不需要CO2,而且培养方式灵活，可以根据实验需要选择贴壁培养或悬浮培养，且悬浮培养的昆虫细胞十分易于放大，有利于大规模表达重组蛋白，使得蛋白质在大多数实验室的放大培养成为可能。作为一种强大的真核表达系统，BES能后翻译地修饰和处理体外或体内表达的异种蛋白，它在VLPs的自我组合和释放中起着关键作用。然而，许多研究证明鳞翅类细胞无法合成哺乳型N-聚糖[27]，这是传统型BES的限制[28]。此外，VLP构成物的化学计量法、结构蛋白的自我组合效率以及由包膜包裹的VLPs的出芽过程都由BES决定。1.5昆虫细胞-杆状病毒表达体系在疫苗中的应用杆状病毒表达的异源蛋白存在多种修饰方式，比如折叠、寡聚化、磷酸化、糖基化、酰化、二硫键形成、溶蛋白性裂解等等，这些修饰同发生在哺乳动物细胞中的修饰类似甚至一样。这一优势较原核表达系统而言具有同时表达多种蛋白和可形成多亚基的病毒源颗粒的特点，并且他形成的VLP与天然颗粒十分类似。7 第一章前言因而BES已经广泛用于异源蛋白的表达和生产，还可以用于实验室中[23,24]类病毒颗粒（VLP）的生产以及亚单位疫苗的开发。在本篇论文中选用的是己经改良并且商品化的Bac-to-Bac杆状病毒的表达系统。这个系统是Luckow等在于1993年创建的，因为它需要历经从细菌(Bacteria)至杆状病毒(Baculovirus)的一系列过程，所以称它为Bac-to-Bac杆状病毒表达系统[38,39]。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由两个成分构成的。第一个成分是pFastBacTM1质粒，它是用来克隆目的基因的。pFastBac1TM穿梭质粒的要点为:转移的质粒都含有杆状病毒Promoter，且表达阅读框都处于mini-Tn7左右臂之间。第二个主要成分是大肠杆菌的DH10BacTM菌株，而作为pFastBacTM1的转化菌株，DH10BacTM菌株必须含有辅助质粒以及杆粒（baculovirusplasmid）。在DH10Bac大肠杆菌中包含：低拷贝的微型F复制子；含有卡那霉素的抗性标记；另外辅助质粒（pMON7124，13.2kb）能表达转座酶且含有四环素(tetracycline)抗性基因。还有辅助质粒也提供了Tn7的转化功能。Bac-to-Bac系统重组病毒具体实验步骤见图1.3。图1.2Bac-to-Bac系统重组病毒具体实验步骤8 第一章前言Bac-to-Bac表达系统有多种类型可以表达质粒，用以满足表达各种各样异源蛋白的特殊要求。质粒pFastBac™/HBM-TOPO®含有HoneyBeeMellitin(HBM)信号肽的序列，而异源蛋白在信号肽的指引下可分泌到培养基，大大减少了下游纯化的难度。质粒pFastBacTMDual含有两个强启动子（PH、P10），可以在同一个杆状病毒系统中同时表达两种不同的蛋白。质粒pFastBacTMHTN-末端存在6XHis，可用来进行重组蛋白的纯化，还可以被TEV蛋白酶切掉；在本篇论文中所使用的pFastBac1TM质粒，均含有可以高水平表达的AcMNPV（PH）强启动子，用以满足那些高表达量的实验需求，见图1.3图1.3pFastBacTM1质粒图谱1.6本篇论文的设计思想人乳头瘤病毒(HPV)感染机体的生殖系统,为生殖道肿瘤高危的因素之一,HPV感染更是导致宫颈癌的重要因素。本篇论文从HPV的病理组织中获得了16型L1全长片段。经过转座反应将目的基因的片段重组进入杆状病毒基9 第一章前言因组，然后将16型重组杆状病毒Bacmid-HPVL1转染入Sf9细胞中，获得大量毒种后进一步感染细胞，通过摸索不同的表达参数确定最佳表达参数后进行大量表达，然后应用超速离心的方法进行纯化，免疫小鼠后获得血清，再应用基于荧光素酶的假病毒中和抗体评价方法。评价16L1HPVVLP疫苗免疫原性。10 第二章实验方法第二章实验方法2.1材料2.1.1质粒、菌株以及细胞系质粒：含HPV16阳性病理组织DNA由四川省肿瘤医院查晓教授提供。pFastBacTM1质粒购买于Invitrogen公司。Peshell16由Dr.JohnT.Schiller赠予pcDNA3.1-Luc+由本实验室提供菌株：Top10、DH5α由本实验室提供DH10Bac购买于Invitrogen公司细胞株：细胞购买于Invitrogen公司293FT由本实验室提供2.1.2主要试剂表1.3实验试剂统计表试剂名称试剂公司转染试剂CellfectinⅡReagentInvitrogen公司（美国）SFX无血清昆虫细胞培养基Hyclone公司（美国）pGEM-TEasyPromega公司（美国）琼脂糖上海生工生物技术公司（中国）低熔点琼脂糖上海生工生物技术公司（中国）溴乙锭（Ethidiubromide，EB）上海生工生物技术公司（中国）苔酚蓝（TrypanBlue）Invitrogen公司（美国）酵母浸出液Invitrogen公司（美国）DTT上海生工生物技术公司（中国）EDTA上海生工生物技术公司（中国）BenzonaseSigma公司（美国）Brj58Sigma公司（美国）11 第二章实验方法DMSOGibco公司（美国）DMEMGibco公司（美国）胰酶上海生工生物技术公司（中国）胎牛血清上海生工生物技术公司（中国）Plasmid-SafeATP-DependentDnaseEpicenter公司（美国）Lipofectmin2000Invitrogen公司（美国）氯化铯北京鼎国昌盛（中国）2.1.3仪器与设备表1.4实验所用仪器统计表仪器名称及型号厂家全温摇床上海智成仪器公司(中国)倒置显微镜Olympus公司（日本）细胞超净台苏州金晶公司(中国)二氧化碳培养箱Thermoforma公司(美国)PCR仪(Mastercyclerprot)Bio-rad公司(美国)酶标仪biorad公司(美国)超速离心机Eppendorf公司(德国)凝胶成像系统（240）天呈公司（中国）核酸电泳仪、电泳槽北京晨曦勇闯科技有限公司(中国)紫外分光光度计(721)上海精学(中国)4℃冰箱华日(中国)-20℃冰箱(OW-YL170)华日(中国)-80℃低温冰箱(725GORMA)Thermo公司(美国)小型台式离心机湘仪公司(中国)台式冷冻离心机湘仪公司(中国)恒温培养箱上海智成仪器公司(中国)超声破碎仪(VCX750)Sonics(美国)电子天平上海耀华(中国)蛋白电泳仪(PBC300)天呈公司(中国)电泳半干转化仪(Mini-PORTEIN3Cell)天呈公司(中国)干胶仪(583)天呈公司(中国)12 第二章实验方法2.1.4溶液配置（1）蛋白电泳溶液（5×RunningBuffer）：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用电子天平依次称取Tris固体粉末7.575克，甘氨酸固体粉末35.1克，SDS固体粉末2.5克，取加500mLddH2O搅拌直至溶解均匀，5倍稀释后使用。50×TAE：Tris242克，冰醋酸溶液57ml,0.5mol/LEDTA100ml,加水定容到1L,调PH值到8.4.30%丙烯酰胺溶液：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，在电子天平上依次称取丙烯酰胺固体粉末87.6克，甲叉双丙烯酰胺粉末2.4克，加ddH2O溶解充分混匀定容至300mL，用锡纸全面包裹置于避光条件下4℃保存待用。（2）蛋白电泳脱色液：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用量筒或量杯称量，将甲醇溶液450mL，ddH2O450mL和冰醋酸溶液100mL混匀，混合过程中可能产生部分热量属正常放热，室温密封保存。考马斯亮蓝染色溶液：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用电子天平称取考马斯亮蓝R-250固体粉末0.75克，把粉末加入（2）中配制的蛋白电泳脱色液300mL中进行搅拌，待溶解完全后用0.45μm一次性滤膜过滤，室温放置保存。（3）磷酸缓冲盐溶液PBS：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用量筒或量杯称量800ml水，用电子天平称量8克NaCL加入水中，之后依次0.2克KCl，1.44克Na2PO4,0.24克KH2PO4加入其中，然后用盐酸将PH值调到7.4，最后加水定容到1L。（4）无血清昆虫培养基SFX：①穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，将商品化的SFX-Insect干粉加入到细胞培养级超纯水中，在此过程中必须用玻璃棒不停的搅拌，否则培养基干粉会凝集成团，后期不容易完全溶解。搅拌均匀后使终体积浓度大概在41.32g/L。②向配置好的①中加入0.35g/L碳酸氢钠和1.5ml甘油，充分混合直至完全溶解。13 第二章实验方法③用0.5MHCL溶液将PH值调到6.1-6.4。④用干净容器加超纯水使其终体积达到1L.然后室温继续混合20分钟。⑤测PH值和渗透压，使溶液的PH达到6.1-6.4.而渗透压达到350-380mOsm/kg。⑥用滤膜除菌过滤并且分装到合适的容器中，凉暗处保存。培养细胞时必须放置到室温才可以使用。（5）昆虫细胞的冻存液：在无菌超净台中操作，90%的SFX昆虫无血清培养基+10%的DMSO溶液，现用现配，配制完成后放在4度冰箱中暂时保存至使用时。（6）昆虫细胞的复苏液：在无菌超净台中操作，取水浴中加热至27度的SFX昆虫无血清培养基即为复苏液，太凉或太热都会影响复苏后SF9细胞的生长。（7）293FT细胞的冻存液：在无菌超净台中操作，取70%DMEM培养基+20%胎牛血清+10%的DMSO溶液，现用现配，配制完成后放在4度冰箱中暂时保存至使用时。（8）293FT细胞的复苏液：在无菌超净台中操作，取80%DMEM培养基+20%胎牛血清配制成完全培养基，复苏细胞时需在水浴中加热至37度才可以使用，太凉或太热都会影响复苏后293FT细胞的生长。（9）293FT细胞的生长培养基，在无菌超净台中操作，配制DMEM完全培养基：90%DMEM培养基+10%胎牛血清，水浴加热至37度方可在细胞传代中使用。（10）细胞裂解液：0.5%Brij58、商品化的0.2%Benzonase、商品化的0.2%Plasmid-SafeATP-DependentDnase的DPBS-Mg溶液。①10%Brij58:穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用天平取1gBrij粉末溶于10ml水中，用0.22μm一次性滤膜过滤除菌后获得。②DPBS-Mg:穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，取有9.5mmol/L的MgCl2的DPBS溶液，用0.22μm一次性滤膜过滤除菌后获得。（11）5MNaCl:穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用电子天平称取29.2克NaCl溶于100ml水中，用0.22μm一次性滤膜过滤除菌后获得。14 第二章实验方法（12）细胞重悬液：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用量筒或量杯量取20mmolTris50mmolNaCl，并将溶液的PH调至8.0（13）卡那霉素抗性（Kanamycin）：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用电子天平称取50mg卡纳霉素溶于1mLddH2O中，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，按1:1000（v/v）加入LB培养基中使用，分装保存于-20℃。（14）LB培养基：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用电子天平称取胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、NaCl10克，然后加入950mlddH2O，摇动容器直至颗粒溶解，用ddH2O定容到1000ml.高压灭菌后待温度降到室温方可使用。（15）4%低熔点琼脂糖：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用电子天平称取4克低熔点琼脂糖加入100mlddH2O中，摇动容器直至颗粒溶解，高压灭菌后待用。（16）中性红：穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，用电子天平称取中性红粉末200mg加到200mlddH2O中，摇动容器直至颗粒溶解，用0.22μm一次性滤膜过滤除菌后4度冰箱保存。2.2实验方法2.2.1昆虫细胞的培养2.2.1.1昆虫细胞（悬浮）的复苏穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，从液氮中取出细胞株后，马上置于27度水浴中，快速摇动直至细胞株内残留一点冰簇时停止，然后在超净台中进行无菌操作，用酒精棉擦拭细胞株外表面，再将细胞株内的细胞混合液转移至无菌离心桶中1000转5分钟离心，弃去上清液，用新鲜的SFX培养基重悬细胞沉淀，将混合后的液体加入一定体积的SFX培养基中，使细胞混合液终浓度达到0.5×106个/ml，并且留样计数，计算细胞活率（一般将细胞活率达到98%以上的状态默认为好的复苏后状态）。将悬液放入27度恒温摇床中，转速为110转/min，避光培养，并每天取样观察细胞状态。15 第二章实验方法2.2.1.2昆虫细胞（悬浮）的传代穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，取状态良好的昆虫细胞，在超净台中进行无菌操作，计数，计算存活率（一般为95%-98%）按比例（通常为1:4-1:8）将细胞悬液分装至各个细胞培养瓶中，补加新鲜SFX培养基直至终浓度到0.5-1×106个/ml，将传代后的细胞悬液放入27度恒温摇床中，转速为110转/min，避光培养，并每天取样观察细胞状态。2.2.1.3昆虫细胞（贴壁）的传代穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，取状态良好的昆虫细胞，在超净台中进行无菌操作，计数，计算存活率（一般为95%-98%），按照每25cm2铺2.5×106个细胞计算，将细胞均匀的铺到工作任务所需培养的细胞瓶中（T25每瓶加2.5×106个、T75每瓶加7×106个、T150每瓶加1.5×106个），补加相应体积（T25补加5ml，T75补加15ml，T150补加50ml）的新鲜SFX培养基，将贴壁传代后的细胞放入27度恒温培养箱中避光培养，大概3-4天传代一次。若有转染或者做空斑实验的需求，提前一天将细胞铺好。2.2.1.4昆虫细胞（悬浮）的冻存穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，在超净台进行无菌操作，配制冻存液（90%SFX＋10%DMSO），并放置于4度冰箱中待用。取状态良好、代次适宜的昆虫细胞，计数，（最好取用细胞浓度在2×106个/ml-3×106个/ml之间的细胞，细胞这时处于对数生长期，状态和活率都很好，适于冻存），将细胞悬液1000转5分钟离心，去掉上清。用冷却之后的冻存液（90%SFX＋10%DMSO）重悬细胞沉淀，使细胞悬液的终浓度为0.5×106个/支—1×107个/支。分装进2ml的冻存管中，每支1ml，并分别标记。然后将冻存管收集放入冻存盒中，再将冻存盒放入-80度冰箱保存过夜，第二天将细胞转移至液氮中保存。定时向液氮罐中补加液氮，如果长时间没有复苏计划，需每三个月复苏一支，以确保液氮罐中细胞的复苏后活率是合格的。2.2.2293FT细胞的培养穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，在超净台进行无菌操作，配制DMEM完全培养基（90%DMEM培养基+10%胎牛血清），然后和胰酶一起16 第二章实验方法放在37度水浴中预热，取出293FT贴壁细胞镜下观察，看细胞的汇合率是否达到80%，如果没有则需要继续培养。将符合要求的细胞放置在超净台中操作，去掉上清，然后加入胰酶进行消化，消化时间不能太长以免细胞由于过度消化而死亡，消化完全后加入DMEM完全培养基（90%DMEM培养基+10%胎牛血清）中止消化，取出细胞悬液1000转5分钟离心，去掉残留的胰酶，后用新鲜的DMEM完全培养基重悬并按比例（1：3-1：4）分种至新的细胞培养瓶或者96孔板中，放入通有二氧化碳的37度细胞培养箱中培养（如果细胞瓶不是由透气栓封口，则需要在培养箱内将封口栓打开一点点，以便二氧化碳进入），大概3-4天传代一次。如果需要做感染，提前一天铺好细胞。2.2.3杆粒构建用HPV16型阳性病理组织经过PCR获得16型L1序列，连接到pGEM-Teasy载体中，酶切鉴定正确后，将阳性克隆送去测序并将结果进行序列对比分析。然后进行双酶切将16型的L1片段回收，回收后连接入pFastBacTM1中，接着双酶切进行鉴定。然后将构建好的16型pFastBacTM1-HPVL1与DH10Bac中的Bacmid发生转座重组，最后得到含有目的基因的重组杆粒。2.2.4重组杆粒的转染以及毒种的传代（1）提在转染的前一天用SF9细胞铺一个T25（或者T75）。穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，在超净台进行无菌操作，向细胞培养瓶T25中铺入代次适宜状态良好的的SF9细胞，每瓶细胞数为2.5×106个的Sf9细胞，且其中含有5ml新鲜SFX培养基，27度恒温培养箱避光培养，直至细胞完全贴壁。（2）第二天转染之前仔细观察细胞，确定细胞状态良好，将构建后的杆粒用0.22μm一次性滤膜过滤除菌后，按比例和转染试剂CellfectinⅡ分别加入500微SFX培养基中孵育（T25细胞培养瓶进行转染的比例为杆粒：转染试剂=30：22.5，其他以此类推），5分钟内将二者混合，并且室温放置20-30分钟，（3）将已用SF9细胞铺好的T25中的上清液去掉，用新鲜的SFX培养基将步骤（2）中的液体补齐到2.5ml（T75补齐到7.5ml、T150补齐到15ml），加入T25中，27度孵箱避光孵育4-6小时。17 第二章实验方法（4）4-6小时后，将细胞瓶中上清去掉，重新加入新鲜的SFX培养基5ml（T75加15ml、T150加30ml）,放入27度恒温培养箱中避光培养7天，每日观察记录。（5）7天后，观察转染后细胞，胀大，破碎，或者细胞停止生长，皆属于阳性病变，将T25（T75或T150）中的上清收获，经过1000转5分钟离心后取上清，用0.22μm一次性滤膜过滤除菌、再分装至灭菌后的西林瓶中，与-80度冰箱保存，标记为毒种库的P1代毒。（5）将毒种P1按照比例加入细胞数为7×106个的SF9细胞铺成的T75细胞培养瓶中，27度恒温培养箱避光培养7天，若细胞有病变，则收上清为P2，以此类推直至P3。（6）将每次收获的毒种除菌、分装后，放入-80度冰箱保存。2.2.5毒种滴度的测定（1）试验用溶液-1.3×SFX事先放在27度恒温培养箱孵育，4%低熔点琼脂糖需提前放在70度水浴中融化后，再将水浴温度降至37度直至后来使用。（2）细胞铺板：实验前一天，取代次适宜状态良好的SF9细胞，计数并确定细胞活率95%以上，用新鲜的SFX培养基稀释细胞悬液，将细胞浓度调整至0.5×106细胞/ml，轻柔的混匀，用移液器在6孔板各孔中分别加入2ml配置好的细胞悬液，待细胞贴壁后，放置于27℃恒温培养箱避光孵育过夜。（3）稀释病毒液：实验第二天，首先取出6孔板观察细胞状态和细胞覆盖率，当细胞状态良好且覆盖率达到60%以上时，认为细胞可以进行之后的实验。取出需检测的病毒原液用SFX培养基进行10倍梯度稀释，即取120μl病毒原液加入1080μlSFX培养基中为10-1病毒液，从中取出120μl再加入1080μlSFX培养基中为10-2病毒液，依次类推10-3、10-4、10-5、10-6、10-7...每个样品在一块6孔板上加5个稀释梯度的病毒悬液各1ml，设置一孔细胞阴性对照，先弃去孔中原细胞培养液，再将系列稀释的病毒液依次加入6孔板相应孔中，左右前后晃动混匀后，放置26℃培养箱孵育4-6小时。正确标记病毒名称、代次及稀释度等。（4）加入琼脂糖培养基18 第二章实验方法将预先准备好的4%低熔点琼脂糖培养，与1.3×SFX培养基和单纯的SFX培养基以体积比1:3:1进行混合，放置36-38℃水浴锅中平衡1-2小时，待用；病毒液孵育结束后，先弃去孔内病毒悬液，然后轻轻加入2ml已平衡至36-38℃的低熔点琼脂糖培养基（以1.3×SFX和SFX稀释）覆盖细胞，勿移动培养板，等到低琼脂糖培养基不再流动后，再放入27℃恒温培养箱避光培养1个星期左右。（5）空斑计数和中性红染色：定期在显微镜下观察病毒感染情况和空斑形成情况，待空斑清晰可数时，肉眼和镜下进行空斑计数后再加入中性红染色，每个孔加入2ml的中性红。室温孵育1-2小时，然后吸去各孔内过量的中性红染料，封板，4℃避光倒置，待斑点清晰，计算病毒斑点数。通过空斑来计算病毒滴度的公式：病毒滴度=1/稀释倍数×每孔空斑数×1/每孔接种病毒的的毫升数。MOI=感染病毒数/被感染的细胞数感染所需的病毒量=(MOI×细胞总数)/病毒液的滴度2.2.6SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法（1）待测样品与样品品缓冲液按体积比为3：1的比例混合，100℃水浴加热3～5分钟。（2）制备分离胶(12.5%)：各溶液按如下剂量加入25ml烧杯中：1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液4ml，30%丙烯酰胺-0.8%N,N'-甲叉双丙烯酰胺溶液6.7ml,1%十二烷基硫酸钠溶液1.6ml,注射用水3.3ml,10%四甲基乙二胺溶液0.1ml,10%过硫酸铵溶液0.1ml混匀。（3）灌胶先将玻璃板用胶条封好,固定在电泳槽内作为模具,将分离胶灌入模具内至一定高度，加少量水封顶,室温下聚合。待胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层。（4）制备浓缩胶(4.5%)各溶液按如下剂量加入25ml烧杯中：30%丙烯酰胺-0.8%N-甲叉双丙烯酰胺溶液1.35ml,1%十二烷基硫酸钠溶液0.9ml,注射用水4.33ml,0.5mol/L三羟19 第二章实验方法甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液2.25ml,10%四甲基乙二胺溶液液0.07ml,10%过硫酸铵溶液0.07ml混匀。（5）将浓缩胶溶液倒入模具内，缓慢恒速的将样品梳插上，才能避免气泡出现。（6）加样:待浓缩胶溶液凝固后拔出样品梳，用电极缓冲液注满电泳槽前后槽，用移液器在待测孔中分别加入待测样品溶液或标准品溶液，每孔供试品量不低于10μl。（7）电泳：打开电泳仪，以120V条件下开始电泳，至供试品溶液进入分离胶后将电流调至为180V，待指示剂至底线处，停止电泳，关闭电泳仪。（8）染色与脱色将电泳后的凝胶完全放入染色液中染色过夜后取出，再完全泡入脱色液中脱色，直至凝胶的蓝色底色几乎脱没，取出凝胶保存在水中。2.2.7HPV16L1病毒样颗粒在昆虫细胞中的优化表达（1）对不同病毒的MOI的摸索：平行培养三瓶体积为400ml，起始浓度为0.5×106个/ml且代次适宜状态良好的昆虫细胞，待细胞密度达到2.5×106个/ml时，将HPV16L1的P3代重组病毒用空斑法测定滴度后，分别选取病毒的MOI为0.1、0.5、2.5，将毒依次加入细胞中，加毒后的72小时收获细胞，用SDS电泳分别鉴定表达量，以确定最佳的攻毒病毒MOI.（2）对不同细胞感染密度（DOI）的摸索：平行培养8瓶体积为400ml，起始浓度为0.5×106个/ml且代次适宜状态良好的昆虫细胞，选取病毒的MOI值为0.5，待细胞密度长到0.5×106个/ml、1.0×106个/ml、1.5×106个/ml、2×106个/ml、2.5×106个/ml、3×106个/ml、3.5×106个/ml、4×106个/ml时分别向8瓶细胞中加毒，每瓶都在加毒后第72小时取样，用SDS电泳分别鉴定表达量，来确定最佳细胞接种密度。（3）对不同收获时间（TOH）的摸索：培养1瓶体积为400ml，起始浓度为0.5×106个/ml且代次适宜状态良好的昆虫细胞，待细胞密度达到2.5×106个/ml20 第二章实验方法时，选取病毒的MOI值为0.5，向细胞中加入病毒，并且在加毒后每12个小时取一次样，共取9次，计数，用SDS电泳分别鉴定表达量，以确定加毒后最佳的收获时间。2.2.8HPV16L1病毒样颗粒的大量表达及纯化穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，在超净台进行无菌操作，平行培养8瓶代次适宜状态良好的体积为400ml，起始浓度为0.5×106个/ml的昆虫细胞，按照优化后的最佳表达参数，MOI=0.5，DOI为2.5×106个/ml，用HPV16L1重组杆状病毒P3代毒种感染细胞后72小时收获，细胞收获后，在冰水浴下，将离心后的昆虫细胞用PBS缓冲液洗涤2次，按1×107细胞/ml再加入PBS缓冲液。超声强度40%，每次超声5s，等待10s后再进行下一次，一共超声90s。超声后4°C16000转离心30min，收集上清与沉淀。然后通过蔗糖垫将目的蛋白进行浓缩，最后进行Cscl密度梯度超速离心，离心结束后，在不同的密度梯度中应出现明显的蛋白环。小心吸取30％-40％CsCl密度梯度的蛋白环，加到MW=10KDa透析袋，透析液透析24h，每8小时换一次透析液20mMPB+300mMNacl。透析完成后，12000rpm，离心10min，去沉淀，留蛋白上清液，分管冻存于-80℃度冰箱中备用。2.2.9HPV16L1病毒样颗粒的小鼠免疫以HPV16型VLP为研究对象，设计单价HPV疫苗免疫程序，取5只6周龄的Balb/c雌鼠，在第0、14、28天腹腔注射一定量的HPVL1VLP,分别在0、1、2、3、4、6、8、10周尾静脉取血，将取出的血2000转离心5分钟，吸取上层血清，分装并且保存至-80度冰箱。2.2.10假病毒中和抗体滴度测定穿无菌服，佩戴好口罩、眼镜、手套等护具，在超净台进行无菌操作，提前培养一瓶293FT细胞分装至T75细胞培养瓶中，待细胞汇合率达到80%以上时开始进行转染。将报告基因pcDNA3.1-Luc+和结构基因Peshell16通过转染试剂Lipofectmin2000共转染入293FT细胞（转染比例为质粒：转染试剂=24微克：30微升），48小时后将细胞从细胞瓶体上吹下来，1000转5min离心，收获细21 第二章实验方法胞，用DPBS清洗1-2次，后加入一定体积的裂解液，使裂解液于细胞沉淀的体积比为5:：1。然后将混合物放入37度二氧化碳孵箱培养至少16小时，再将混合物冰浴5min,之后加入1/5体积的5MＮａＣｌ,再次冰浴10min，最后1000转5min离心取上清，进行分装，-80度冰箱保存。此为HPV16型假病毒。用293FT细胞铺96孔板，第二天，观察细胞，待细胞汇合率达到80%时，按照从10-1、10-2、10-3、10-4直到10-8将HPV16型假病毒进行稀释,每个稀释梯度做4个复孔，每孔加100μl病毒液，加完后将96孔板放入37度二氧化碳孵箱培养72小时，然后将板中的上清去掉150μl，再向每孔中加50μl荧光素酶底物，2分钟避光等待，最后将降混合物反复吹打再取出50Μl上清加入白板中，用酶标仪进行检测，以10倍空白对照值Cutoff值，计算假病毒的滴度。HPV16L1VLP免疫小鼠后，获得的血清与假病毒1：1混合，冰浴后，加入293FT传代的96孔板中，37度二氧化碳孵箱培养72小时，之后酶标仪检测荧光素酶活性值，以10倍空白对照值Cutoff值，计算假病毒的滴度细胞培养半数感染量。22 第三章结果和讨论第三章结果和讨论3.1HPV16L1序列的扩增与构建杆状病毒转移载体以HPV16L1阳性病理组织DNA基因组为模板，结合引物用PCR的方法扩增出目的片段，大小在1500bp左右。将目的片段连接到T-Easy载体上，测序正确后，再与pFastBacTM1质粒连接，得到含有目的基因的转移载体，酶切（BamHl:Xhol）鉴定正确，如下图1.5。123Lane1：pFastBacTM1-16L1Lane2：markerLane3：16L1(BamHl:Xhol)图1.5pFastBacTM1-16L1酶切图谱应用PCR的方法鉴定重组杆粒中是否含有目的基因，运用M13引物从16亚型的Bacmid-HPVL1中扩增相应片段，而16亚型的Bacmid-HPVL1的阳性杆粒经引物扩增后片段大小为3800bp,如下图1.6。23 第三章结果和讨论12Lane1：Bacmid-HPV16L1Lane2：marker图1.6Bacmid-HPV16L1PCR鉴定图谱3.2重组杆粒的转染和毒种的传代昆虫细胞SF9在转染后的变化很有规律，首先出现的是细胞停止生长（与空白对照相比），一般这种情况出现在转染后2-3天。然后个别细胞开始涨大，慢慢的涨大的细胞会陆续破碎，细胞核状的阴影会逐渐出现，这中状态会一直持续到转染结束。有图1.7、图1.8如下。图1.7转染前的Sf924 第三章结果和讨论图1.8转染后7天的Sf9转染过后所收获的上清为病毒P1,P1通过继续感染昆虫细胞得到P2,依此类推得到P3、P4.除P1外，其他代次的毒种均可以悬浮培养，通过加毒后取样计数，计算细胞存活率来判断细胞的感染情况，毒种扩增时，一般当细胞存活率降至20-30%时收获。而用毒种在细胞中大规模表达时，一般当细胞存活率降至50%时就必须收获了。如图1.9、图1.10。图1.9加毒前的SF925 第三章结果和讨论图1.10加毒后的SF9待细胞有上述变化时，将所传代的毒种收获，梯度稀释后进行空斑试验，如图1.11。图1.11P3代毒种空斑试验结果将图1.11中所示的空斑数代入公式，计算可得出P3代毒种MOI=3.7×106pfu/ml3.3HPV16L1病毒样颗粒在昆虫细胞中的优化表达3.3.1HPV16L1病毒样颗粒在昆虫细胞中的表达及鉴定将HPV16L1重组杆状病毒在SF9昆虫细胞中进行表达。感染的细胞收获后，超声将细胞破碎后，将超声上清液分别进行蔗糖垫和氯化铯超速离心，通过透析除去残余氯化铯，然后进行western鉴定，有图1.12如下。26 第三章结果和讨论12Lane1：16L1-BacmidLane2：marker图1.12超速离心后重组杆状病毒的western鉴定图谱由图可见，HPV16L1重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞后表达出52kd大小的目的蛋白，经western鉴定，能与camvirl单克隆抗体产生特异性反应，证明含有HPV16L1的重组杆粒在Sf9昆虫细胞中可以正确表达HPV16L1蛋白。3.3.2昆虫细胞的生长曲线选取单次悬浮培养的昆虫细胞，通过每天取样计数来计算细胞浓度以监测细胞生长趋势，见表1.5、图1.13。表1.5细胞数及细胞活率培养时间（天）细胞数（106）细胞活率（%）00.4599%10.4599%20.5098%31.0098%41.4098%52.8398%64.4297%77.4095%84.9678%92.2340%27 第三章结果和讨论图1.13SF9细胞生长曲线由上述图表中可以看出，单次培养SF9昆虫细胞到第七天时，细胞浓度可以达到最高，而细胞的活率也是在第七天开始大幅度下降，这张图也为我们以后做表达优化时提供了数据参考。昆虫细胞作为此篇论文中最重要的细胞基质，在培养方面很具有典型性。我们在不断的持续研究中发现，当SF9细胞的传代代次超过20代后，细胞的倍增时间由原来的26小时缩短为16小时，细胞密度虽然短时间内可以达到很高，但表达量下降，所以在此篇论文所涉及的所有关于SF9细胞的实验中，细胞代次均控制在20代以内。3.3.3对不同病毒的MOI的摸索悬浮培养三瓶昆虫细胞，起始浓度为0.5×106个/ml，体积为400ml。每天取样计数，观察细胞状态，当细胞浓度达到2.5×106个/ml时，分别取MOI为0.1、0.5、2.5的HPV16L1重组杆状病毒P3代毒，感染细胞后的72小时，三瓶细胞分别取样计数，计算细胞存活率，具体数据见表1.6。28 第三章结果和讨论表1.6不同MOI攻毒后细胞的密度及活率MOI细胞数（106）细胞活率（%）0.11.090%0.50.370%2.50.150%将取样后的三个样品进行SDS电泳鉴定，见图1.14。1234Lane1：MOI为0.1时HPV16L1样品Lane2：MOI为0.5时HPV16L1样品Lane3：MOI为2.5时HPV16L1样品Lane4：marker图1.14不同MOI收样后SDS电泳鉴定由图可见，当MOI为0.5时病毒的表达量最高。3.3.4对不同细胞感染密度的摸索平行培养8瓶体积为400ml，起始浓度为0.5×106个/ml的昆虫细胞，选取病毒的MOI值为0.5，根据细胞的生长曲线得知，单次培养Sf9细胞的生长密度最高可达到7.4×106个/ml，选取最高生长密度值的10%、20%、30%、40%、50%附近的几个梯度细胞密度，进行感染，待细胞密度长到0.5×106个/ml、1.0×106个/ml、1.5×106个/ml、2×106个/ml、2.5×106个/ml、3×106个/ml、3.5×10629 第三章结果和讨论个/ml、4×106个/ml时分别向8瓶细胞中加入HPV16L1重组杆状病毒P3代毒10ml，每瓶都在加毒后第72小时取样，用SDS电泳分别鉴定表达量，来确定最佳细胞接种密度，见图1.15。12345678910Lane1:细胞密度:0.5×106个/mlLane2:细胞密度:1.0×106个/mlLane3:细胞密度:1.5×106个/mlLane4:细胞密度:2.0×106个/mlLane5:细胞密度:2.5×106个/mlLane6:细胞密度:3.0×106个/mlLane7:细胞密度:3.5×106个/mlLane8:细胞密度:4.0×106个/mlLane9：阳对Lane10：1kbmarker图1.15通过不同细胞接种浓度接毒表达后各样品SDS电泳鉴定由图可见，当细胞的接种密度在2.5×106个/ml时，病毒的表达量最高。3.3.5对不同收获时间的摸索培养1瓶体积为400ml，起始浓度为0.5×106个/ml的昆虫细胞，待细胞密度达到2.5×106个/ml时，选取病毒的MOI值为0.5，向细胞中加入HPV16L1重组杆状病毒P3代，并且在加毒后每隔12个小时取一次样，共9次，计数，见表1.7。30 第三章结果和讨论表1.7分段收样后细胞数及细胞活率培养时间（天）细胞数（106）细胞活率（%）加毒当天2.599%加毒后12小时2.599%加毒后24小时2.698%加毒后36小时2.390%加毒后48小时1.880%加毒后60小时1.570%加毒后72小时1.260%加毒后84小时1.050%加毒后96小时0.830%加毒后108小时0.520%将收取的12小时、24小时，36小时、48小时，60小时、72小时，84小时、96小时的样品分别作SDS电泳鉴定，见图1.16。12345678910Lane1：12小时收样Lane2：24小时收样Lane3：36小时收样Lane4：48小时收样Lane5：60小时收样Lane6：72小时收样Lane7：84小时收样Lane8：96小时收样Lane9：108小时收样Lane10：marker图1.16按时间段收样后SDS电泳鉴定由图可见，在病毒感染细胞后的72小时收获，此时病毒的表达量最高。31 第三章结果和讨论3.4杆状病毒的大量表达及纯化按照优化后的最佳表达参数，将HPV16L1重组杆状病毒在SF9昆虫细胞中大量的表达。感染的细胞收获后，超声将细胞破碎后，16000转离心30分钟，然后将超声上清液先进行蔗糖垫纯化，再经过氯化铯超速离心，通过透析除去残余氯化铯，然后进行SDS鉴定，有图1.17如下。123456Lane1：纯化后样品Lane2：阳对Lane3：MarkerLane4：BSA原浓度样Lane5：BSA原浓度样稀释10倍Lane6：BSA原浓度样稀释20倍图1.17参数优化后纯化后样品鉴定由图可见，参数优化后的样品在纯化后浓度可达到150μg/ml左右。将样品放置于透射电镜下观察，形成了二十面体的VLP，见图1.18大小形态与正常的病毒颗粒相似。直径约为50-60nm。证明HPV16L1蛋白经sf9细胞表达后可组装成病毒样颗粒。图1.18HPV16L1透射电镜照片32 第三章结果和讨论3.5假病毒中和抗体滴度测定提前一天用293Ft细胞铺96孔板，每孔细胞为9×105个。第二天，选取600CCID50/50μl的假病毒接种量，取HPVL116型VLP免疫小鼠后第六周的血清，梯度稀释，从80×开始，4倍稀释，直至81920×，共6个梯度，，每个梯度4个复孔。每孔的液体体系为病毒液60μ+血清稀释液60μl，冰浴1个小时后，每孔分别取100μl混合液加入相应的96孔板中，放入37度二氧化碳孵箱培养72小时，之后用酶标仪进行荧光素酶活性值的检测，具体结果如下见表1.8。表1.8抗体中和试验的实验设计实验设计血清稀释梯度16L1VLP+血清16L1VLP+血清16L1VLP+血清16L1VLP+血清空白16L1VLP阳对80×复孔复孔复孔复孔复孔复孔320×复孔复孔复孔复孔复孔复孔1280×复孔复孔复孔复孔复孔复孔5120×复孔复孔复孔复孔复孔复孔20480×复孔复孔复孔复孔81920×复孔复孔复孔复孔327680×复孔复孔复孔复孔1310720×复孔复孔复孔复孔具体实验结果见表1.9。表1.9抗体中和实验的实验结果实验结果血清稀释梯度16L1VLP+血清16L1VLP+血清16L1VLP+血清16L1VLP+血清空白16L1VLP阳对80×38262422384546320×644018163683961280×20321062825805120×41416820732020480×250501768881920×896860790644327680×392631381021050101310720×7444637472802226由表中内容可见，将血清稀释至327680倍后，依然具有中和作用，所以证明HPV16型单价疫苗免疫小鼠后，可产生高滴度的特异性中和抗体。33 结论结论（1）成功的构建含有HPV16L1的全长片段的pFastBacTM1穿梭载体以及转化获得HPV16L1重组杆粒，经PCR鉴定正确。（2）HPV16L1重组杆粒转染昆虫细胞，获得P3代毒种，感染Sf9昆虫细胞后表达52kd大小的目的蛋白，经western鉴定，能与camvirl单克隆抗体产生特异性反应，证明含有HPV16L1的重组杆粒在Sf9昆虫细胞中可以正确表达HPV16L1蛋白。（3）对HPV16L1重组杆状病毒在昆虫细胞的表达工艺进行了优化，实验结果表明，在病毒感染复数（MOI）为0.5，细胞感染密度在2.5×106个/ml，感染细胞后72小时收获，HPV16L1在昆虫细胞中的表达量最高。（4）经表达优化获得的HPV16l1免疫小鼠后，免疫血清通过假病毒抗体中和试验检测，可产生高滴度的型特异中和抗体。34 参考文献参考文献[1]王晋.人乳头瘤病毒11型L1蛋白的突变分析及其类病毒颗粒疫苗的研制.2007。[2]魏旻希,李少伟,黄博.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究病毒学报,2009,245-250。[3]谢明辉.人乳头瘤病毒18型类病毒颗粒疫苗研制、中和抗体筛选及冷冻电镜三维结构重建.2008。[4]周朝明.马新兴,周婧怡,刘佳骅,王洪芳,雷建强.重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗免疫原性评价法的研究药物分析杂志,2011,1743-1749。[5]沈琼,雷建强,周朝明,张高峡.,人乳头瘤病毒18型L1蛋白在毕赤酵母中的表达及其病毒样颗粒的免疫原性中国生物制品学杂志,2012,129-133。[6]ShopeImmunizationofRabbitstoInfectiousPapillomatosis.TheJournalofexperimentalmedicine,219-319.[7]Bruni.L，Barrionvevo-Rosas,L，Albero.G..Aldea.M..Serrano.B，Valencia,S..BrotonsMCosao.R.,Muhoa,J，Bosch,F.,deSanjose,S.,Castellsagtt.,2016Human1'apilloiavirusandRelatedDiseasesintheWorld.Summary-ReporT.InformationCentreonHpVandCancet(HPVInformationCentre).[8]Panatto.D，Amicizia,D.,Bragazzi,.,Rizzitelli,E..Tramalloni,D..Va11e,L,CaspariniR.,2015.Chaptereighhumanpapillomavirusvaccine:stateoftheartandfutureperspectives.In:Rossen,D.(Ec1)AdvancesinProteinChemistryandStructuralBiology.Vol.101.AcademicPress,pp.231-322.[9]AadreattaeM，ICarosiene,E。Rasmussen.M..Srryhn,A.BuuseS。Sielsen,M。2015Accuratepan-specifcpredictionofpeptide-MHCclasBindingaffinitywithim-provedbindingcoreidentification.Ianmunogenetics,641-650.[10]Zhai,L，Tumban,E.,2016.Gardasilaglobalsurveyofprojectedefficacy.Antivir.Res130,101-109.[11]Tumban.E..Yeabody,J,Tyler,M..Ieabody,D.S..Chackerian,2012.VLYsdisylayingasingleL2epitopeinducebroadlycross-neutralizingantiboc'liesagainsthumanpa-pillomavirus.,49-751.35 参考文献[12]Schiller.J.T..Lowy,D.R.,2015.Raisingexpectationsforsubunitvaccine.J.Infect.Dis.211.1373-1375.[13]Lobanov,M，Bogatyreva,，Calzitskaia,，2007.Radiusofgyrationisindicatorofcompactnessofproteinstructure.Mot.Bio1.42.701-706[14]Mori,J，Vranac,T..Smrekar,B，Cernilec,M，Serbec,V.C..Horvat.S~Ihan,A，Bencina,M。Jerala,R.,2012.Chimericflagellinasthe-adjuvantingantigenfortheacti-vationofimmuneresponseagainstHeLicobacterpylori.Vaccine30,5856-5863.[15]Moyle,P.VI.2017.Biotechnologyapproachestoproducepotent.self-awantingan-ugen-auvantfusionproteinsubunitvacnes.B.technol.Adv.35,375-389.[16]Angioli,R，Lope,S，Aloisi.A，erranova.DeCicco,Scaletta,Caprighone,S.eMiranda,A。Luvero,Ricciardi,R.Montera,R.Ylotti,F.2016.TenyearsofI-1PVvaccines:stateofartandcontroversies.102,65-72.[17]WuWH，Alkutkar,T，Karanam.B，Roden,R.B..Kemer,G，lbeanu,。2015.CapsiddisplayofaconservedhumanpapillomavirusL2peptideintheadenovirus5hexonprotein:acandidateprophylactichpvvaccineapproach.Virol.J.12,140.[18]High,K.(2005)Determinationofpicomolarequilibriumdissociationconstantsinsolutionbyenzyme-linltedirimunosorberitassaywithfluorescencedetection.Anal.Bioclaen347.119-161[19]Vlillman,I.(1969)Australiaantigendetectedinthenucleioflivercellsofpatientswithviralhepatitisbythefluorescentantibodytechnictture222.181-184.[20]Kushnir,Virus-likepartidesasahighlyefficientvaccineplatforun:diversityoftargetsandproductionsystemsandadvancesinclinicaldevelopment.Vctccirve31,58-83.[21]Krugman,(1982)Thenewlylicensedhepatitisvaccine.Characteristicsandindicationsforuse.JAMA247,2012-2015[22]Valenzuela,(1982)Synthesisandassemblyofhepatitisvirussurfaceaigenparticlesinyeast.utrtre298,347-350[23]Mcaleer,(1984)Humanhepatitisvaccinefromrecombinantyeast.Nature307,178-180[24]Scolnick,Clinicalevaluationinhealthyadultsofahepatitisvaccinemadeby36 参考文献recombinantDA.JAMA251,2812-281b[25]Andre,F.E.(1990)Overviewofa5-yearclinicalexperiencewithayeast-derivedhepatitisvaccine.accineS74-S78discussionS79-S80.[26]Kushnir,Virus-likepartidesasahighlyefficientvaccineplatforun:diversityoftargetsandproductionsystemsandadvancesinclinicaldevelopment.Vctccirve31,58-83[27]Ylarkowitz,Reductioninhumanpapillomavirus(HPV)prevalenceamongyoungwomenfollowingHPVvaccineintroductionintheUnitedStates,ationalHealthandutritionExaminationSurveys,2003-2010.Drs.208,380-393[28]J.jsefeberg,J.O.Vaccineprocesstechnology.Biotechrrol.Bzoerr,g.109,1443-1460[29]Li,M.and,Y.X.(2013)Areviewoncurrentdownstreambio-processingtechnolo},yofvaccineprodwcts.Vnccine1264-1267[30]Greirier,V.J.(2012)ThestructureofHBsAgparticlesisriotmodifiedupontheiradsorptiononaluminiumhydroxidegel.Vaccine5240-5245[31]Wu,T.(2012）HepatitisEvaccinedevelopment:a14yearodysseyHurrc.Vaccirz.Trrznzurcother.823-827[32]Pastrana,D.V.(2012)eutralizationserotypingofBKpolyomavirusinfectioninkidneytransplantrecipients.PLoSPnthog.100-650[33]WaeniM.R.(2013)Sensitivityofimmuneresponsequalitytoinfluenzahelix190antigenstructuredisplayedamodularvirus-likeparticle.Vaccine31.4425-4435[34]Zhao.RealtimemonitoringofamtigenicitvdevelopmentofHBsAgvirus-likeparticles(VLPs)duringheat-andredoxtreatment.Bioczenz.Biopleys.Res.Conzrrcurz.447-453[35]Cuervo,M.L.(2008)ValidationofanewalternativeFordetermininginvitropotencyinvaccinescontaininghepatitisfromtwodifferentmanufacturers.Biologicals375-382[36]Shanmugham,(2010)Immunocaptureenzyme-linkedirnmunosorbentassayforassessmentofoitropotencyofrecombinanthepatitis1260vaccines.Clin.Vaccinemmuuol.1252-1324[37]GifFroy,D.(2006)ValidationofanewELISAmethodforicavitropotencyassayofhepatiisB-containingvaccines.PharmeuropaBio2006,7-14[38]Karimzadeh,H.(2010)Validationofanin-vitromethodforhepatitisBvaccine37 参考文献potencyaway:specificationsetting.PaunziczeroaMed,177-182[39]Capen,R.(2007)Establishingpotencyspecificationsforantigenvaccines.BioprocessInt.530-42[40]Towns,(2013)Pairwiseantibodyfootprintingusingsurfaceplasmonresonancetechnologytocharacterizehumanpapillomavirustype16virus-likeparticleswithdirectanti-HPVantibodyimmobilizaion.J.Inzmunol.Methods1-7[41]Pastrana,D.V.(2004)Reactivityofhumanserainasensitive.high-throughputpseudovirus-basedpapillomavimsneutralizationassayforHPV16andHPV18.Virology205-216[42]Kemp,T.J.(2012)KineticandHPVinfectioneffectsoncross-typeneutralizingantibodyandavidityresponsesinducedbyCervarixn.Vaccine31,165-170[43]Roberts,C.(2012)EvaluationoftheHPVantibodyresponseinGardasilvaccineesafternousingapseudovirionneutralizationassay.Hurz.Vaccirz.Immunotlzer.431-434[44]Marigold,C.M.andStreeck,R.E.(1993)Mutationalanalysisofthecysteineresiduesinthehepatitisvirussmallenvelopeprotein.JVirol.4588-4597[45]Li,S.W.(2005)MutationalanalysisofessentialinteractionsinvolvedintheassemblyofhepatitisEviruscapsid.J.Biol.Clzenz3400-3406[46]He,S.(2008)Putativereceptor-bindingsiesofhepatitisEvirus.Geh.Virol.245-249[47]Tang,X.(2011)StructuralbasisfortheneutralizationandgenotypespecificityofhepatitisEvirus.Proc.Natl.Acarl.U.S.A.10266-10271[48]Emerson,S.U.（2004）TnvitroreplicationofhepatitisEviruscHEVgenomesandofanHEVrepliconexpressinggreenfluorescentprotein.Virol.4838-4846[49]Huang,E.F.(2006)ConstructionandcharacterizationofinfectiouscDNAclonesofachickenstrainofhepatitisEvirusHEVi,avianHEV.J.Gen.Virol.2585-2593[50]HuangH,prophylactichumanpapillornavirusvaccinedevelopment-frombenchtoptobed-side.Clnz.arrraacoT.r.259-264[51]Melchior,V.(1980)Stackinginlipidvesicle-tubulinmixturesisanartifactofnegativestaining.J.CellBio.881-884[52]Pease.L.F.,3rd(2012)Physicalanalysisofviu'usparticlesusingelectrospiaydifferentialmobilityanalysis.TreadsBiotechrrol.216-22438 参考文献[53]Pease,L.F.,3rd(2009)Quantitativecharacterizationofvirus-likeparticlesbyasymmetrical'Rowfieldflowfractionation,electrospraydifferentialmobilityanalysis,andtransmissionelectionmicroscopy.Biotechnol.Bioeng.845-855[54]Gwha,S.(2012)Electrospray-differentialmobilityanalysisofbienanoparticles.EndsBzoteclwol.291-300[55]Chuan,(2008)uantitaticeanalysisofvirus-likepaniclesizeanddistributionbyfield-flowfractionation.BiotecTznol.Bioeng.1425-14339 致谢致谢衷心感谢我的导师姜春来教授。姜春来教授精深的学术造诣、丰富的科研经验、细致的工作作风令我深深敬佩，严谨的治学态度、实事求是的科研作风宽厚待人的学者风范更是我学习的榜样。由衷感谢刘大维博士，孙博博士，孙世阳博士在论文选题、试验设计、结果分析和论文完成过程中给予我的耐心指导，感谢百克研发中心科学部所有同仁在论文的整个完成过程中给予我的极大帮助。衷心地感谢吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室的全体师生及所有给予我帮助和支持的人。特别感谢我的家人和朋友这些年给予的关心、理解和支持。40
