吉林省和黑龙江省蜱种分布及3种重要蜱传微生物分子流行病学调查

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分类号：Q958.9单位代码：10193密级：公开学号：20140283硕士学位论文吉林省和黑龙江省蜱种分布及3种重要蜱传微生物分子流行病学调查Surveyonticksspeciesdistributionandmolecularepidemiologyofthreeassociatedtick-bornemicroorganisminJilinandHeilongjiangprovince作者姓名：刘欢欢学位类别：学术型硕士专业名称：微生物学研究方向：分子病原微生物学与分子免疫学指导教师：魏峰教授所在学院：生命科学学院2017年6月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要蜱属于节肢动物门，是仅次于蚊的第二大病原体传播媒介。蜱可传播200多种病原体，给人类健康及畜牧业经济发展产生严重影响。我国东北地区是蜱虫高发区，随着气候及环境变化，东北地区蜱传疾病发生率呈上升趋势，因此对蜱虫种类及蜱传病的研究十分必要。本研究通过布旗法采集东北部分地区蜱虫样本，经形态学与分子生物学鉴定蜱虫种类，并通过分子生物学方法获取蜱携带立克次体、无形体及埃立克体流行本底，为东北地区蜱传疾病的防控提供数据支持。吉林省和黑龙江省蜱种调查结果。2015年3-6月从吉林省延吉市、敦化市、蛟河市和黑龙江省佳木斯市、双鸭山市、伊春市、绥芬河市、虎林市、同江市应用布旗法采集2928只蜱。经形态学与分子生物学鉴定，吉林省和黑龙江省蜱种如下：森林革蜱204只、草原革蜱253只、嗜群血蜱412只、长角血蜱390只、全沟硬蜱1669只；全沟硬蜱是吉林省和黑龙江省共有优势蜱种，比率分别为38.6%、66.8%，而嗜群血蜱是黑龙江省第二优势蜱种，比率为21.6%，吉林省未发现嗜群血蜱。蜱传立克次体、无形体、埃立克体的流行情况。通过PCR法对采集的蜱进行扩增、克隆、测序并进行同源性分析与系统进化树分析。吉林省蜱传立克次体、无形体、埃立克体阳性率分别为3.8%、4.5%、1.5%；黑龙江省立克次体阳性率为7.7%、无形体为7.5%、埃立克体为2.0%，黑龙江省3种蜱传病的阳性率均高于吉林省。立克次体在森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱、全沟硬蜱阳性率分别为6.1%、7.5%、3.9%、5.5%、6.5%。无形体在森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱、全沟硬蜱阳性率分别为2.3%、1.7%、3.5%、7.2%、9.4%。埃立克体在长角血蜱、嗜群血蜱、全沟硬蜱阳性率分别为0.8%、0.7%、3.1%。经系统进化树分析发现，吉林省和黑龙江省存在已知3种立克次体、2种无形体、2种埃立克体；在吉林省长角血蜱中发现1个立克次体新种（CandidatusRickettsiajingxinensis）、在黑龙江省嗜群血蜱和长角血蜱中发现1个埃立克体变异株(Ehrlichiasp.hc-hlj209)。关键词：蜱、立克次体、无形体、埃立克体I AbstractTicks,belongingtoarthropods,aresecondonlytomosquitoesastransmittingvector.Morethan200kindsofpathogencanbetransmittedbyticks,whichseriouslyaffectedhumanhealthandanimalhusbandry.TickswerewidelydistributedinthenortheastofChina.Withthechangesofclimateandenvironment,theincidenceoftickbornediseasesisrisinginnortheasternChina.Therefore,itisofverypracticalsignificancetoperformastudyonticksandtick-bornediseasesinthisarea.Inthisstudy,tickswerecollectedbyflaggingvegetable.Thesespecieswereidentifiedbybothmorphologicalandmolecularbiologymethods.Prevalencesoftick-borneRickettsiaspecie,AnaplasmaspeciesandEhrlichiaspecieswereobtainedbymolecularbiologicalmethods.Theresultslaidthefoundationsforthepreventionandcontroloftick-bornediseasesinnortheasternChina.TickspeciesinJilinandHeilongjiangprovinces.2928tickswerecollectedbyflaggingvegetablein9citieslocatedinYanjiCity,DunhuaCity,JiaoheCityofJilinandJiamusiCity,ShuangyashanCity,YichunCity,SuifenheCity,HulinCityandTongjiangCityofHeilongjiangprovincesinChina.Tickspeciesofthesearthropodswereidentifiedbasedonmorphologicalandmolecularrules.Dermacentorsilvarum(n=204),Dermacentornuttalli(n=253),Haemaphysalislongicornis(n=390),Haemaphysalisconcinna(n=412),Ixodespersulcatus(n=1699)tickswereacquiredfromJilinandHeilongjiangprovinces;I.persulcatuswasdominanttickspeciesinbothJilinandHeilongjiangprovinces.TheratioofI.persulcatuswere38.6%and66.8%inJilinandHeilongjiangprovincerespectively.TherewasnoH.concinnainJilinprovince,however,H.concinnawassecondmosttickspeciesinHeilongjiangprovince,withtheratioof21.6%.InfectionratesofRickettsiaspp.,Anaplasmaspp.,Ehrlichiaspp.inticks.ThetickswereamplifiedbyPCR,cloned,sequenced,analyzedofhomologyandphylogenetictree.InJilinprovince,thepositiverateofRickettsiaspp.,Anaplasmaspp.andEhrlichiaspp.wererespectively3.8%,4.5%,1.5%.InHeilongjiangprovince,thepositiverateofRickettsiaspp.,Anaplasmaspp.andEhrlichiaspp.wererespectively7.7%,7.5%,2.0%.Theoverallinfectionrateoftick-bornediseasesinHeilongjiangprovincewashigherthanthatinJilinprovince.ThepositiverateofRickettsiaspp.wererespectively6.1%、7.5%、3.9%、5.5%、6.5%inD.silvarum,D.nuttalli,H.longicornis,H.concinnaandI.persulcatus.ThepositiverateofAnaplasmaspp.wererespectively2.3%、1.7%、3.5%、7.2%、9.4%inII D.silvarum,D.nuttalli,H.longicornis,H.concinnaandI.persulcatus.ThepositiverateofEhrlichiaspp.wererespectively0.8%、0.7%、3.1%inH.longicornis,H.concinnaandI.persulcatus.PhylogeneticanalysesshowedthattherewerethreeRickettsiaspp.,twoAnaplasmaspp.,twodeterminedEhrlichiaspp.inbothJilinandHeilongjiangprovince.Onepotentialnewspecies(CandidatusRickettsiajingxinensis)wasfoundinJilinprovinceandoneEhrlichiavariant(Ehrlichiasp.hc-hlj209)wasfoundinHeilongjiangprovince.Keywords:Tick,Rickettsia,Anaplasma,EhrlichiaIII 目录摘要........................................................................................................................................IAbstract........................................................................................................................................II目录......................................................................................................................................IV前言........................................................................................................................................1第一章文献综述...........................................................................................................................21.1蜱......................................................................................................................................21.2蜱传疾病..........................................................................................................................5第二章吉林省、黑龙江省蜱种类调查....................................................................................102.1材料................................................................................................................................102.2方法................................................................................................................................112.3结果................................................................................................................................152.4讨论................................................................................................................................202.5小结................................................................................................................................21第三章3种重要蜱传微生物分子流行病学调查....................................................................223.1材料................................................................................................................................223.2方法................................................................................................................................223.3结果................................................................................................................................263.4讨论................................................................................................................................443.5小结................................................................................................................................45结论......................................................................................................................................47参考文献......................................................................................................................................48作者简介......................................................................................................................................57致谢......................................................................................................................................59IV 前言蜱属于节肢动物门，是一种十分重要的传播媒介，可传播细菌、病毒、原虫等200多种病原[1]。全世界有800多种蜱，其中硬蜱种类最多，约为700多种；软蜱次之，有100多种；纳蜱数目最少，仅有1种[2-4]。蜱多存在草原、森林、半荒漠等地区，呈点状和带状分布。我国蜱历史悠久，早在东汉时期就有记载，明代《本草纲目》一书中也曾提到蜱，而蜱的分类和命名却从18世纪才开始。传统上，主要依据蜱种间形态学差异进行蜱虫分类，但此方法具有一定局限性。首先，需要蜱形态完整；其次，蜱不能吸血，且不能为幼虫；最后，鉴定人员要有足够的鉴定经验。随着分子生物学技术的不断发展，将传统的形态学与分子生物学相结合，使分类系统更加完善。蜱可传播多种病原体，严重威胁人和动物的健康及经济发展[5]。据报道，全世界10%的蜱可携带病原体，有的蜱同时携带几种病原体[6]。我国地域辽阔，地形复杂，蜱种类繁多且分布范围广，导致蜱传疾病遍及我国多个省市。常见的蜱传疾病有莱姆病、森林脑炎、Q热、发热伴血小板减少综合征、新疆出血热、立克次体病、焦虫病等。近年来，我国几乎所有省市都有蜱传疾病的报道，且其流行率逐年上升。本研究利用形态学特征与PCR技术相结合的方法，确定吉林省和黑龙江省9个市蜱种类及其分布。利用PCR法检测蜱携带立克次体、无形体、埃立克体情况，为我国东北地区蜱传病原分布提供理论依据，为建立相关监测机构及防控工作提供科学依据。1 第一章文献综述1.1蜱蜱是第一个被证实可传播病原体的节肢动物，是仅次于蚊的第二大传播媒介[1]。蜱分为硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)和纳蜱科(Nuttalliellidae)。硬蜱科包含硬蜱属(Ixodes)、牛蜱属(Boophilus)、血蜱属(Haemaphysalis)、扇头蜱属(Rhipicephalus)、异扇蜱属(Anomalohimalaya)、花蜱属(Amblyomma)、璃眼蜱属(Hyalomma)、革蜱属(Dermacentor)及盲花蜱属(Aponomma)[2]。软蜱科包括耳蜱属(Otobius)、赝蜱属(Nothoaspida)、锐蜱属(Argas)、穴蜱属(Antricola)和钝蜱属(Ornithodoros)[2]。纳蜱科仅有一个蜱属即纳蜱属(Nuttalliella)，图1-1[2,3]。图1-1蜱亚目进化树Fig.1-1Phylogenyofthesubfamiliesofticks1.1.1硬蜱硬蜱因其背部具有壳质化盾板而被命名。若蜱、幼蜱和雌蜱盾板仅占躯体背面1/3左右，雄蜱盾板几乎笼罩整个躯体背部。不同蜱属之间盾板形状及特点不同，如眼的有无、珐琅斑的有无及珐琅斑颜色深浅等[4]。硬蜱叮咬时无刺痛感，通常不会引起宿主的注意。蜱直到吸饱血才离开宿主，这个过程可能持续几天或数周。我国东北野生哺乳动物的体外寄生虫多为硬蜱，因为硬蜱分布广泛，且能通过吸血增加与宿主的联系。我国东北地区硬蜱属、血蜱属、革蜱属较为常见，花蜱属数目较少[5,6]。2 硬蜱属是全世界数目最多的蜱属，现已记载的硬蜱有250种。硬蜱为小型蜱(体长2–4mm)，盾板无眼和花纹，口下板较长，气门板呈圆形或卵圆形，肛沟位于肛门前侧[7]。雄蜱体型小于雌蜱[8]，见图1-2。图1-2硬蜱属形态特征，(A)雌蜱，雄蜱背部特征；(B)雌蜱，雄蜱腹部特征Fig.1-2MorphologicalfeaturesofgenusIxodes,(A)dorsalfemaleandmale;(B)ventralfemaleandmale革蜱为中型蜱(体长为2–6mm)，主要寄生在大型动物体表[8]。盾板有眼、缘垛和银白色珐琅斑，口下板和须肢较短。雄蜱无腹板。多为三宿主蜱。幼蜱从宿主吸取血液后，离开宿主，隐藏于土壤或植被，蜕化为若虫。若虫吸血后蜕化为成虫[9]，见图1-3。图1-3革蜱形态特征。(A)雌蜱，雄蜱背部特征；(B)雌蜱，雄蜱腹部特征Fig.1-3MorphologicalfeaturesofthegenusDermacentor.(A)dorsalfemaleandmale;(B)ventralfemaleandmale血蜱为小型蜱(体长2–3mm)，体色单一，盾板无眼和珐琅斑，有缘垛，假头基多为矩形，须肢较短，第二节须肢向外延伸成角状。雄蜱无腹板[8]，见图1-4。3 图1-4血蜱形态特征，(A)雌蜱，雄蜱背部特征；(B)雌蜱，雄蜱腹部特征Fig.1-4MorphologicalfeaturesofthegenusHaemaphysalis,(A)dorsalfemaleandmale；(B)ventralfemaleandmale花蜱为大型蜱(体长4–8mm)。可寄生在多种野生动物体表。体型呈卵圆形，盾板有珐琅斑，口下板和须肢较长，第二节须肢显著较长。花蜱叮咬可引起宿主贫血、麻痹同时传播多种病原体，严重可引起宿主死亡[10]。1.1.2软蜱科目前已知软蜱共有5个属，分别为耳蜱属(Otobius)、赝蜱属(Nothoaspida)、锐蜱属(Argas)、穴蜱属(Antricola)、钝蜱属(Ornithodoros)。软蜱的分布具有区域性。软蜱无坚硬的盾板，多数无眼，身体呈椭圆形，体前端较窄，表皮皱缩。有的软蜱具有顶突。若虫、成虫假头位于腹部。软蜱吸血后体色由黄灰色变为灰黑色[9]。雌蜱与雄蜱差别较小，不易区分[8]，见图1-5。图1-5软蜱形态特征Fig.1-5Morphologicalfeaturesofsoftticks软蜱与硬蜱的生活习性和形态特征均不相同。软蜱叮咬具有明显刺痛感。吸食快速，仅在宿主停留数分钟。软蜱流动性小，抗低温，耐热，多分布于干旱及半干旱地区，常在夜间吸食[11]。4 1.1.3纳蜱纳蜱仅有一个属，一个种。最早发现于南非[12]。纳蜱与硬蜱、软蜱形态特征、生活方式均有异同，如纳蜱无刚毛、外壳皱缩及气孔位置与其他蜱科均不同[13]。纳蜱既具有类似硬蜱的伪盾和尖颚口，又具有类似软蜱的表皮，因此纳蜱被认为是硬蜱和软蜱进化缺失的环节[14]，见图1-6。图1-6纳蜱形态特征Fig.1-6MorphologicalfeaturesofNuttalliellidae纳蜱有多个宿主。其对宿主具有选择性，优先选择蜥蜴、岩狸、燕子、啮齿动物、猫鼬[14]。若蜱和成蜱可在宿主自然栖息地采集，如石头下、地面、燕子窝、废弃的鹰巢、岩石裂隙和岩面等[15]。1.2蜱传疾病蜱是第二大传播媒介，携带、传播多种病原体[16]。蜱大量寄生于动物体表，可造成宿主贫血、消瘦、甚至死亡[17]。蜱与其他节肢动物媒介显著区别是蜱具有与病原体协同进化能力，这有助于蜱对病原体的感染、复制和传播[18]。蜱传疾病是重要的媒介传染病，呈世界范围内分布，多为人畜共患疾病和自然疫源性疾病，常发生在森林、灌木、半荒漠、草原等地区[19]。蜱传疾病是由蜱虫叮咬宿主传播病原体引起的疾病。当蜱叮咬人或动物皮肤，皮肤出现红肿，并以此作为病原体入口点。蜱可同时携带多个病原体，因此当人被蜱叮咬后，可能同时感染多个病原体，这增加了诊断和治疗的难度。随着蜱传疾病发病率的增加、蜱地理区域的扩大，区分具有相似临床症状的蜱传病十分重要。就全球而言，具有流行病学意义的蜱传疾病主要有森林脑炎、贾萨努尔森林病、克里米亚–刚果出血热、落基山斑点热。在过去30年这些疾病发病率大幅增加[20]。我国广袤的国土、复杂的地理环境，增加了蜱物种多样性，也使蜱传疾病在我国多数地区盛行，严重影响人类健康[21]。近年来，蜱传疾病几乎在我国所有省份/自治地区/自治市均有存在，感染率逐年增加。我国常见的人类蜱传疾病有莱姆病、森林脑炎、克里米亚–刚果出血热、Q热、兔热病、北亚蜱传斑点热、近年来还出现了人粒细胞无浆体病(HGA)，发热伴血小板减少综合征5 等具有重要流行病学意义的蜱传疾病[22]。蜱传疾病感染率的增加，促使人们更多的关注蜱和蜱传病。然而，蜱分布的复杂性，物种的多样性，导致人们无法完全了解蜱虫相关病原体和疾病。1.2.1蜱传麻痹病蜱传麻痹病仅由蜱传播，而不是通过感染病原体进行传播。该病由蜱唾液腺分泌的神经毒素引起，只在蜱叮咬时存在[23]。麻痹开始时出现身体四肢不协调和行走能力的丧失，最后可发展为口齿不清，呼吸浅且不规则[6]。通常拔除蜱，症状会迅速下降。然而，患者未意识到被蜱叮咬，可引起患者死亡。文献报道，因蜱麻痹导致的死亡率约为10%[24]。大约有40种软蜱和硬蜱唾液腺能分泌毒素引起人和动物麻痹。有报道称引起麻痹的蜱主要为硬蜱属和革蜱属。北美、亚洲和南非蜱麻痹报道较多，我国相关报道较少[25]。1.2.2蜱传立克次体科疾病1.2.2.1蜱传埃立克体病蜱传立克次体病是由立克次体引起的一种新兴人畜共患病，呈世界范围内流行，传播媒介主要为硬蜱[26]。立克次体病临床症状多为发热、无力、恶心、厌食、头痛等[27]。有人曾预言，全球变暖可能会增加立克次体病发生的概率[28]。立克次体分为3个种群，即斑点热群(spottedfevergroup，SFG)、斑疹伤寒群(typhusgroup)和遗传群(TFG)[29]，见图1-7。斑点热群立克次体引起的疾病主要有落基山斑点热、北亚蜱传斑点热、黑龙江斑点热、日本斑点热等。斑疹伤寒群立克次体引起的疾病主要为地方性斑疹伤寒与流行性斑疹伤寒[30]。遗传群立克次体引起的疾病主要为立克次体痘、未知斑点热及昆士兰热[29]。图1-7串联序列构建立克次体种群进化树Fig.1-7Phylogenetictreedepictingtherelationshipsoftherickettsiaespecieswithconcatenatedsequencedata6 落基山斑点热(RockyMountainspottedfever，RMSF)是由硬蜱传播的立氏立克次体引起的一种疾病。1989年首次在美国西北部落基山山脉附近发现，现今几乎遍及美国各个州。立氏立克次体为美国最常见和致病力最强的立克次体。1983-1998年，美国报道每年有5-39人死于落基山斑点热。此病最初症状为突发性发热、头痛、肌肉疼痛，随后出现皮疹，严重可出现神经疾病、肾功能衰竭、心肌炎、肢体坏死[26,31]。北亚蜱传斑点热(North-Asiatick-bornespottedfever，NATBSF)，也称西伯利亚蜱传斑疹伤寒，是由蜱传播的西伯利亚立克次体引起的一种疾病。1936年首次在俄罗斯发现[32]。其后，在西伯利亚的东部和南部、中国北部、蒙古及哈萨克斯坦均发现此病原体。北亚蜱传斑点热临床表现为高热、接种焦痂、区域性淋巴结肿大、头痛、肌肉疼痛、消化道症状和皮肤皮疹[31]。草原革蜱是西伯利亚立克次体主要传播媒介，边缘革蜱及森林革蜱也可传播此病原体[33]。黑龙江斑点热，又称远东斑点热，是由黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)引起的一种畸形传染病。临床症状主要为发烧、头痛、皮疹、区域淋巴结病、结膜炎。1983年我国首次在东北森林革蜱中发现此病原体[34]，此后在嗜群血蜱及日本血蜱中均检测到此病原体。蜱传淋巴结病(Tick-bornelymphadenopathy，TIBOLA)主要是由蜱传播的Rickettsiaraoultii引起的一种疾病。临床主要表现为发热、乏力、头痛、淋巴结肿大、焦痂等症状[35]。1999年，首次在俄罗斯发现R.raoulti的存在[36]。我国，R.raoultii最早在吉林省发现[37]。森林革蜱、草原革蜱和短小扇头蜱是其主要传播媒介[36,38]。1.2.2.2蜱传无形体病无形体病是由寄生在反刍动物红细胞内的无形体引起的一种疾病。具有重要卫生意义的无形体有嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum)、边缘无形体(Anaplasmamarginale)、扁平无形体(Anaplasmaplatys)[39]。人粒细胞无形体病(HGA)是由蜱传播的嗜吞噬细胞无形体感染中性粒细胞引起的一种人畜共患疾病，硬蜱为主要传播媒介。1990年首次发现此病。之后，美国、欧洲及中[40]国等多个国家均发现此病原体。人粒细胞无形体病为非特异性流感样疾病，通常表现为发热、肌痛、头痛、寒战、乏力、恶心、咳嗽、关节痛、血液异常及白细胞减少症，致死[40,41]率约为0.6%。患者常在被蜱叮咬的10天后发病。边缘无形体可引起牛溶血性贫血，其主要传播媒介是革蜱和扇头血蜱，还可通过虻、螫蝇及多种蚊虫的叮咬而传播。偶尔会发生应用被污染的针头、听诊器、手术器具等而感染。牛感染边缘无形体后会出现发烧、流产、黄疸、贫血和体重下降，严重时会导致死亡。1.2.2.3蜱传埃立克体病埃立克体病(Ehrlichiosis)是由硬蜱传播的埃立克体(Ehrlichiia)引起的疾病。具有重要卫生意义的埃立克体有5种：犬埃立克体(Ehrlichiiacanis)、查菲埃立克体(Ehrlichiiachaffeensis)、伊氏埃立克体(Ehrlichiiaewingii)、鼠埃立克体(Ehrlichiiamuris)、反刍动物埃立克体(Ehrlichiaruminantium)[42]。7 1935年，在一只病犬中首次分离出犬埃立克体(Ehrlichiiacanis)。1987年人单核细胞埃立克体病(Humanmonocyticehrlichiosis，HME)最早于美国发现[43]。1994年人粒细胞埃立克体病(Humangranulocyticehrlichiosis，HGE)首次在美国报道，此后，美国、中国、日本、韩国、意大利等均有此病的报道[43]。。人单核细胞埃立克体病是由蜱传播的查菲埃立克体引起的一种新型人畜共患疾病。查菲埃立克体主要感染宿主单核细胞和巨噬细胞[44]。临床主要表现为发烧、发冷、头痛、恶心、白细胞和血小板减少、转氨酶水平升高及肌酐升高，病死率约1.9%[43]。1999年，我国首次发现人单核细胞埃立克体病的存在，此后在内蒙古、黑龙江、广东、广西、福建、新疆和云南7个省有此病报道[41]。1.2.3莱姆病莱姆病是由蜱传播的伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferisensulato)引起的一种急性传染病。在欧洲大约有85000人感染此病，美国超过300000人患有此病。莱姆病是北半球常见疾病[45,46]。我国北方是莱姆病高发区[47]。感染者最常见症状是游走性红斑，其他早期症状还表现为发烧、头痛和疲倦[46]。1975年在美国首次发现莱姆病。1985年，我国黑龙江省最早发现此病，之后在我国多个省市均有该病的报道[48]。在我国北方，全沟硬蜱是螺旋体的主要传播媒介。南方主要由中华硬蜱、粒形硬蜱及二棘血蜱进行传播[49]。1.2.4蜱传病毒性疾病1.2.4.1蜱传脑炎蜱传脑炎(Tick-borneencephalitis)又名森林脑炎，是由黄病毒科、黄病毒属中蜱传脑炎病毒(Tick-borneencephalitisvirus，TBEV)引起的一种急性传染病[50]。蜱传脑炎病毒有欧洲或西方型、西伯利亚型及远东型3个亚型。1936年首次从病人体内分离出脑炎病毒[51]。1952年，我国首次发现脑炎病毒[50]。脑炎病毒可以感染脑、脑膜或同时感染脑和脑膜，致死率为1%-2%[52]。患者一般在神经系统症状发作后5-7天内死亡，有10-20%的感染病人产生长期或永久性的神经后遗症。我国蜱传脑炎多发生在北方的山区或林区，如黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古自治区等[53]。旅游业的发展和森林生态环境的破坏，导致蜱传脑炎的患病率逐年上升[54]。蜱传脑炎病毒在不同地区，传播媒介不同。如在我国北方全沟硬蜱是森林脑炎的主要传播媒介，南方的主要传播媒介是卵形硬蜱[55,56]。极少数地区发现森林革蜱也可携带脑炎病毒。1.2.4.2克里米亚-刚果出血热克里米亚–刚果出血热(Crimean-Congohemorrhagicfever，CCHF）是由蜱虫传播的克里米亚–刚果出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagicfevervirus，CCHFV）引起的一种急性传染病，在我国又称为新疆出血热[57]。广泛存在非洲、巴尔干半岛、中东、亚洲等地区[57]。刚果出血热病毒为布尼亚病毒科、内罗毕病毒属成员[58]。1944年，首次在乌克兰的克里米亚半岛发现[59]。临床主要表现为急性出血、肝肿胀、急性肾功能衰竭、休克等症状，死亡率约3-30%[60]。在我国，仅在新疆和准格尔发现该病原体。8 刚果出血热的自然疫源地是沙漠和牧场，主要传播媒介是亚洲璃眼蜱，硬蜱可能是其贮存宿主[61]。流行地区牧场中羊和野兔是主要感染源，急性感染的患者也可能是感染源。1.2.4.3发热伴血小板减少综合征发热伴血小板减少综合征(Severefeverwiththrombocytopeniasyndrome，SFTS)是由发热伴血小板减少综合征病毒(Severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus，SFTSV)引起的一种急性传染病，又称新型布尼亚病毒[62]。该病多发生在森林和丘陵地区，林区作业的工作人员及农民是主要感染人群[62]。新型布尼亚病毒是一种新发现的病毒，隶属于白蛉病毒属[63]。临床表现为发热、血小板及白细胞减少、丙氨酸、天冬氨酸氨基转移酶和蛋白尿升高，致死率约8%[64]。2009年，我国河南省最先发现发热伴血小板减少综合征病毒，到2012年在11个省市，超过2500人患有此病[65,66]。此外，在美国、韩国和日本也发现类似的疾病[67-69]。春季和夏季为发热伴血小板减少综合征高发期，可通过直接接触患者血液或被长角血蜱和微小牛蜱叮咬进行传播[70-72]。1.2.5蜱传原虫病1.2.5.1蜱传巴贝斯虫病巴贝斯虫病(Babesiosis)是经蜱传播的巴贝斯虫(Babesia)在红细胞内寄生引起的一类人畜共患疾病，呈世界范围内流行[73]。目前已发现100多种巴贝斯虫，而感染人的巴贝斯虫仅有Babesiamicroti、Babesiadivergens、Babesiaduncani和Babesiavenatorum4种[73]。巴贝斯虫病引起炎症反应的临床症状主要有头痛、发热、恶心、呕吐、肌痛、精神不济、播散性血管内凝血、贫血、低血压、呼吸窘迫、肾功能不全、肝肿大[74]。作为新型蜱传人畜共患病，巴贝斯虫病获得越来越多的关注[75]。日本、美国主要由Babesiamicroti引起人巴贝虫病[76]，欧洲主要由Babesiadivergens引起人巴贝虫病[77]，我国人巴贝虫病主要由Babesiamicroti和Babesiavenatorum引起。Babesiamicroti主要由全沟硬蜱传播，长角血蜱和嗜群血蜱也能进行传播[78]。Babesiadivergens在全沟硬蜱、嗜群血蜱及日本血蜱中均有发现。Babesiavenatorum仅由全沟硬蜱传播[78]。1.2.5.2肝原虫病肝原虫病是由寄生性肝原虫(Hepatozoon)引起的一种疾病。已发现的肝原虫有300多种，其中超过120种可感染蛇，超过50种可感染哺乳动物[79]。肝原虫由摄入感染肝原虫的节肢动物进行传播[80]。蜱、螨、沙蝇、蚊子、跳蚤、虱子、水蛭为其终末宿主[80]。2004年首次在俄罗斯病人血液中检测到肝原虫[81]。犬肝原虫病是欧洲、亚洲、非洲和拉丁美洲等最常见的疾病[82-85]。我国北京、山西、河南、江苏、新疆都有犬肝原虫的报道。Hepatozooncanis，Hepatozoonamericanum和Hepatozoonfelis均可引起犬和猫的肝原虫病，但它们引起的临床症状不同，Hepatozooncanis主要存在于血淋巴组织，主要症状有发热、嗜睡、体重减轻、贫血和高球蛋白血症；Hepatozoonamericanum多存在于肌肉组织，可引起肌炎和跛行。9 第二章吉林省、黑龙江省蜱种类调查蜱是一类专营吸血性寄生虫，包含硬蜱科、纳蜱科和软蜱科3个科。全世界已记载的蜱有800多种，其中硬蜱科种类最多，超过700种。我国已知的硬蜱有9个属，101个种[86]。其中蜱种类最多的是血蜱属，硬蜱属次之，其余蜱属数目较少[86,87]。地理环境、植被、气候等影响蜱的地理分布，蜱携带病原体与蜱种类相关[88]。蜱传统分类主要依据蜱形态学鉴定，但此方法需要鉴定人员有足够经验、蜱形态必须完整、不能吸血且不能是未成熟个体如卵、幼虫。相对于传统形态学鉴定的局限性，分子生物学操作简单、对鉴定蜱种无限制、鉴定结果更加准确。本实验通过形态学及分子生物学方法对吉林省3市，黑龙江省6市蜱种类进行调查，为蜱传疾病的防控提供实验数据。2.1材料2.1.1蜱样本采集2015年3-6月在吉林省的延吉市、敦化市、蛟河市，黑龙江省的佳木斯市、双鸭山市、伊春市、绥芬河市、虎林市、同江市的林场通过布旗法采集蜱样本。蜱虫用75%的酒精清洗两遍，4°C保存2.1.2仪器与试剂全自动样品快速研磨仪购自上海净信科技；PCR仪购自美国BIORAD公司；凝胶成像系统购自美国WEALTEC；倒置式研究型显微镜购自Olympus公司；生物安全柜购自海尔电器有限公司；高压蒸汽灭菌器购自日本SANYO；EXTaq，pMD18-T载体购自TaKaRa公司；质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、基因组提取试剂盒购自Axygen；2.1.3主要试剂的配制（1）Amp(50μg/mL)：称量100μgAmpicillin，溶于2mL去离子水，先后用0.45μm和0.22μm滤膜过滤，分装，-20°C保存。（2）LB液体培养基：称量5gTryptone，5gNaCl，2.5gYeastextract，去离子水定容至500mL，121°C，20min高压灭菌，4°C存放。（3）LB固体培养基：称量5gTryptone，5gNaCl，2.5gYeastextract，1agarose，去离子水定容至500mL，121°C，20min高压灭菌，4°C存放。（4）50×TAE缓冲液：称量37.2gTris，242gNa2EDTA·2H2O，800mL去离子水搅拌均匀，加入57.1mL的乙酸，ddH2O定容至1L，室温保存。10 2.2方法2.2.1蜱种形态学鉴定根据《中国经济昆虫志》对蜱种进行分类鉴定[86]。根据有无刚毛、外壳皱缩及气孔位置区分纳蜱；根据有无坚硬的盾板区分软蜱和硬蜱；硬蜱科蜱属形态区分：肛沟的有无区分牛蜱属，肛沟的位置区分硬蜱属；假头基的形状区分扇头蜱属；须肢形态及长短区分血蜱属；盾板花纹及眼的有无区分璃眼蜱属；盾板有明显珐琅板为革蜱属；盾板有色斑，体型较宽，为花蜱属。常见蜱外部形态特征如下[86,89]：（1）森林革蜱中型蜱，背部盾板有眼、缘垛及银白色珐琅斑，假头基宽短，呈矩形，宽度远超其长度，须肢粗短，颈沟深短，刻点粗细混杂，气门板为逗点形，末端触及盾板边缘，基节IV外距超出后缘。雌蜱假头基后缘平直，基突粗短，孔区小，呈卵圆形，口下板前后端齿式分别为4/4和3/3。雄蜱假头基后缘、侧缘平直，基突长与宽近似相等，口下板齿式为3/3，基节Ⅰ-Ⅳ逐渐变大，基节Ⅳ向后伸长，外距超过后缘。（2）草原革蜱中型蜱，背部盾板有眼、缘垛和银白色珐琅斑，假头基宽短，呈矩形，宽度远超其长度，须肢粗短，颈沟深短，气门板为逗点形，末端未达盾板边缘。雌蜱基突不明显，孔区呈卵圆形，须肢粗短，颈沟深短，口下板前后端齿式分别为4/4和3/3，盾板为多角形，刻点小，大致均匀。雄蜱基突短小，口下板齿式为3/3，刻点粗细混杂，基节逐渐增大，基节Ⅳ外距未超过该基节后缘。（3）长角血蜱小型蜱，体色单一，无眼，有缘垛，假头基宽短，呈矩形，第2节须肢外缘外突呈角状，侧缘平行，口下板齿式为5/5，大小均一，Ⅱ-Ⅳ基节的內距均超过其后缘，刻点密且均匀。雌蜱基突短，颈沟长且明显，气孔板近似圆形，基节Ⅰ內距呈锥形，跗节Ⅳ窄长。雄蜱基突呈三角形，颈沟短，侧沟明显，气门板呈卵圆形，基节Ⅰ內距呈锥形。（4）嗜群血蜱小型蜱，体色单一，无眼，有缘垛，假头基宽短，呈矩形，宽度远超其长度，第2节须肢外缘外突呈角状，第3节须肢呈三角形，刻点稠密且均匀分布。雌蜱盾板近似圆形，颈沟宽且浅，间距宽，假头基侧缘、后缘平直，口下板粗而短，齿式可能为5/5，6/6或4/4。雄蜱具有卵圆形的盾板，颈沟短且浅，假头基侧缘平行，后缘平直，口下板较短，齿式为6/6，大小均匀。（5）全沟硬蜱小型蜱，无珐琅斑、眼和缘垛，肛沟位于肛门前侧，假头基宽短，侧缘内倾，后缘外11 弯，颈沟浅，基节Ⅰ內距细长，基节Ⅱ-Ⅳ无內距，表面着少量细毛。雌蜱盾板呈卵圆形，耳状突粗短，口下板前、中、后端齿式分别为4/4、3/3、2/2，刻点大小中等，生殖沟外倾。雄蜱盾板呈长卵形，耳状突明显，口下板齿6-7排，侧缘齿较大，中部齿很小，刻点小，生殖孔与基节Ⅲ后缘水平。2.2.2分子生物学鉴定蜱种2.2.2.1蜱基因组DNA提取每只蜱加入2个铁珠、350μLbufferPBS和0.9μLRNaseA，70HZ研磨2min，DNA提取采用axygen公司基因组提取试剂盒。具体操作如下：①生物安全柜内取350μL研磨液加入到干净的1.5mL离心管。②离心管加入150μLBufferC-L，震荡15s，混合均匀。③离心管加入40μLProteinaseK，震荡15s，混合均匀。56°C水浴6h。④离心管加入350μLBufferPD，震荡15s，混合均匀，10000rpm离心1min。⑤将步骤4溶液移入吸附柱中，10000rpm离心1min，弃废液。⑥吸附柱加入700μLBufferW1，10000rpm离心1min，弃废液。⑦吸附柱加入700μL含无水乙醇BufferW2，10000rpm离心1min，弃废液。⑧重复步骤7。⑨13000rpm空离2min，弃废液。⑩吸附柱置入新的离心管，悬空加54μLEluent，室温放置5min，13000rpm离心2min，收集溶液，-20°C保存。2.2.2.2蜱基因组DNA提取从NCBI上下载硬蜱属、血蜱属的所有蜱种16SrRNA序列，利用DNAMAN进行同源性比对，找出各蜱属保守区，利用软件primer6.0设计引物，革蜱鉴定引物参考文献[87]。引物由北京金唯智生物科技公司合成见表2-1。表2-1蜱16SrRNA基因片段扩增引物Tab.2-1PrimersforPCRto16SrRNAoftick扩增蜱种引物名称PrimersSequence(5’-3’)扩增片段大小(bp)革蜱属、Der-FAAAAATACTCTAGGGATAACAGCGTAATAA126长角血蜱Der-RGGTCTGAACTCAGATCAAGTAGGA嗜群血蜱Hae-FGGTATTTTGACTATACAAAGGTATTG280Hae-RTTATTACGCTGTTATCCCTAGAGTATT硬蜱属Ixo-FTACGAAGGTATTGAAATAAGATTTTAAATG394Ixo-RATGTAGGAATTTAAAAGTTGAACAAACTTC2.2.3PCR扩增蜱种16SrRNA基因序列利用引物Der-F、Der-R检测森林革蜱、草原革蜱及长角血蜱；引物Hae-F、Hae-R检测嗜群血蜱；引物Ixo-F、Ixo-R检测全沟硬蜱。反应体系见表2-2。12 表2-2PCR反应体系Tab.2-2ReactionsystemofPCR成分用量(μL)10×Buffers2.5dNTPs2上游引物1下游引物1模版2ExTag0.2ddH2O16.3总计25PCR反应条件：预变性：94°C5min；变性：94°C30s，退火：53°C30s，延伸：72°C30s，35个循环；后延伸：72°C5min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.4PCR产物的纯化回收（1）紫外投射仪下切目的条带，放入干净1.5mL离心管中，加入300μLDE-A，65°C水浴8min。（2）离心管加入150μLDE-B，颠倒混匀。（3）离心管加入100μL异丙醇，震荡混匀。（4）将步骤3混合液加入吸附柱，12000rpm离心1min，倒掉废液。（5）吸附柱加入500μLbufferW1，12000rpm离心1min，倒掉废液。（6）吸附柱加入700μL含无水乙醇bufferW2，12000rpm离心1min，倒掉废液。（7）重复步骤5。（8）12000rpm离心2min。（9）吸附柱置入新的离心管，吸附膜中心加入28μLEluent，常温放置5min，13000rpm离心3min，收集目的基因。2.2.5PCR产物克隆及测序（1）PCR回收产物连接pMD18-T载体回收产物与pMD18-T载体连接，见表2-3，震荡混匀，瞬时离心，16°C过夜。表2-3pMD18-T载体连接反应体系Tab.2-3ReactionsystemofjoiningwithpMD18-T成分用量(μL)PCR回收产物4.5pMD18-T0.5SolutionI5总计10（2）转化①取100μL感受态细胞冰上融化。13 ②取5μL连接产物加入到大肠杆菌感受态细胞DH5α，旋转混匀，4°C静止40min。③42°C热激90s。迅速转移到冰中，冷却5min。④加入500μL预热后的无抗性LB液体培养基，吹打混匀，37°C180rpm温育45min。⑤向含Amp+的LB固体培养皿接种100μL已转化的感受态细胞，常温放置30min。⑥倒置培养板，37°C恒温培养14h。（3）质粒提取①生物安全柜中挑取单菌落，接种到6mL含Amp+的LB液体培养基中，37°C180rpm震荡培养过夜；②菌液移入2mL离心管，7000rpm离心4min，真空泵吸取上清。③离心管加入250μLbufferS1，震荡混匀。④离心管加入250μLbufferS2，上下颠倒4-6次。⑤离心管加入350μLbufferS3，立即上下颠倒6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min；⑥将步骤5混合液加入吸附柱，12000rpm离心1min，倒掉废液。⑦吸附柱加入500μlbufferW1，12000rpm离心1min，弃废液。⑧吸附柱加入700μl含无水乙醇bufferW2，12000rpm离心1min，弃废液，重复此步骤。⑨12000rpm离心2min。⑩吸附柱放入干净的1.5mL离心管，吸附膜中间悬空加52μLbufferEB，室温放置5min，12000rpm离心2min，收集质粒，-20°C保存备用。（4）质粒鉴定利用限制性内切酶对质粒进行单酶切鉴定，37°C酶切2h。酶切体系见表2-4。克隆成功的重组质粒送往金唯智生物有限公司进行测序。表2-4酶切反应体系Tab.2-4Reactionsystemofdigestion成分用量(µL)克隆质粒5.0BamHI0.410×buffer1.0ddH2O3.6总计10.02.2.6系统进化分析系统进化树应用MEGA5.0软件，以邻位相连法(Neighborjoiningmethod，NJ)进行构建，并进行1000次的自举检验(Bootstraptest)。14 2.3结果2.3.1蜱形态学鉴定结果经形态学鉴定，2015年3-6月采集的蜱共有5种，分别为森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱和全沟硬蜱(图2-1、图2-2、图2-3、图2-4、图2-5)。图2-1森林革蜱Fig.2-1Dermacentorsilvarum图2-2草原革蜱Fig.2-2Dermacentornuttalli图2-3长角血蜱Fig.2-3Haemaphysalislongicornis15 图2-4嗜群血蜱Fig.2-4Haemaphysalisconcinna图2-5全沟硬蜱Fig.2-5Ixodespersulcatus2.3.2分子生物学鉴定结果2.3.2.116SrRNA基因扩增结果经PCR扩增，得到片段大小分别为126bp、126bp、126bp、280bp，394bp，与预期大小一致，见图2-6。图2-6蜱种16SrRNA基因扩增结果M：marker2000；1：全沟硬蜱；2：草原革蜱；3：森林革蜱；4：嗜群血蜱；5：长角血蜱Fig.2-6PCRamplificationof16SrRNAinticksspeciesM:marker2000;1:Ixodespersulcatus;2:Dermacentornuttalli;3:Dermacentorsilvarum;4:Haemaphysalisconcinna;5:Haemaphysalislongicornis2.3.2.2系统进化树分析结果（1）森林革蜱将测得森林革蜱序列与GenBank已知革蜱序列进行同源性比对分析及系统进化树分析。分析结果显示本实验检测的森林革蜱(KY328281)与已知森林革蜱(JF979379)处于同一进化分支且同源性最高，为99.7%，见图2-7。16 图2-7基于16SrRNA基因构建森林革蜱进化树Fig.2-7Phylogenetictreewasconstructedbasedon16SrRNAgeneforD.silvarum（2）草原革蜱将测得草原革蜱序列与GenBank已知革蜱序列进行同源性比对分析及系统进化树分析。分析结果显示本实验检测草原革蜱(KX328280)与已知草原革蜱(JX051114)处于同一分支且同源性最高，为99.8%，见图2-8。图2-8基于16SrRNA基因构建草原革蜱进化树Fig.2-8Phylogenetictreewasconstructedbasedon16SrRNAgeneforD.nuttalli（3）长角血蜱将测得长角血蜱序列与GenBank已知血蜱序列进行同源性比对分析及系统进化树分析。分析结果显示本实验检测的长角血蜱(KX305958)与已知长角血蜱(FJ712721、JX051071、JF979373、KJ652225)均处于同一分支，且同源性均为99.9%，见图2-9。17 图2-9基于16SrRNA基因构建长角血蜱进化树Fig.2-9Phylogenetictreewasconstructedbasedon16SrRNAgeneforH.longicornis（4）嗜群血蜱将测得嗜群血蜱序列与GenBank已知血蜱序列进行同源性比对分析及系统进化树分析。分析结果显示实验检测的嗜群血蜱(KY328282)与已知嗜群血蜱(KP866207)位于一个分支且同源性最高，为99.8%，见图2-10。图2-10基于16SrRNA基因构建嗜群血蜱进化树Fig.2-10Phylogenetictreewasconstructedbasedon16SrRNAgeneforH.concinna（5）全沟硬蜱将测得全沟硬蜱序列与GenBank已知血蜱序列进行同源性比对分析及系统进化树分析。分析结果显示本实验检测的全沟硬蜱(KX305956)与已知全沟硬蜱(KC688349、KC688336、KP283020)位于同一进化支，且同源性均为99.9%，见图2-11。18 图2-11基于16SrRNA基因构建全沟硬蜱进化树Fig.2-11Phylogenetictreewasconstructedbasedon16SrRNAgeneforI.persulcatus2.3.3蜱种采集结果2015年3-6月在吉林省、黑龙江省9个城市共采集2928只蜱，包含森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱和全沟硬蜱5种蜱。经统计，吉林省共采集1018只蜱，其中森林革蜱175只、草原革蜱206只、长角血蜱244只、全沟硬蜱393只。黑龙江省共采集1910只蜱，森林革蜱29只、草原革蜱47只、长角血蜱146只、嗜群血蜱412只、全沟硬蜱1276只，见表2-5。表2-5吉林省、黑龙江省蜱种采集总表Tab.2-5CollectionticksfromJilinandHeilongjiangprovence省样本数森林革蜱草原革蜱长角血蜱嗜群血蜱全沟硬蜱总计吉林省数目17520624403931018比率17.2%20.2%24.0%038.6%100%黑龙江省数目294714641212761910比率1.5%2.5%7.6%21.6%66.8%100%总计数目20425339041216692928比率7.0%8.6%13.3%14.1%57.0%100%吉林省延吉市采集341只蜱，森林革蜱107只、草原革蜱100只、长角血蜱134只；敦化市629只蜱，森林革蜱59只、草原革蜱109只、长角血蜱92只、全沟硬蜱369只。蛟河市48只蜱，其中草原革蜱6只、长角血蜱18只、全沟硬蜱24只。黑龙江省佳木斯市采集565只蜱，其中嗜群血蜱60只、全沟硬蜱505只；双鸭山市368只蜱，嗜群血蜱12只、全沟硬蜱356只；伊春市672只蜱，森林革蜱2只、长角血蜱111只、嗜群血蜱251只、全沟硬蜱308只；绥芬河市163只蜱，草原革蜱3只、全沟硬蜱91只；虎林市41只蜱，森林革蜱13只、草原革蜱24只、全沟硬蜱4只；同江市19 101只蜱，森林革蜱13只、草原革蜱20只、长角血蜱21只、嗜群血蜱34只、全沟硬蜱12只；见表2-6。表2-6吉林省、黑龙江省蜱种采集信息详表Tab.2-6CollectionticksfromJilinandHeilongjiangprovence省市总计蜱种数量百分比延吉市341森林革蜱10731.4%草原革蜱10029.3%长角血蜱13439.3%敦化市629森林革蜱689.4%吉林省草原革蜱10017.3%长角血蜱9214.6%全沟硬蜱36958.7%蛟河市48草原革蜱612.5%长角血蜱1837.5%全沟硬蜱2450%佳木斯565嗜群血蜱6010.6%全沟硬蜱50589.4%双鸭山368嗜群血蜱123.3%全沟硬蜱35696.7%伊春市672森林革蜱20.3%黑龙江省长角血蜱11116.5%嗜群血蜱25137.4%全沟硬蜱30845.8%绥芬河市163草原革蜱31.8%长角血蜱148.6%嗜群血蜱5533.8%全沟硬蜱9155.8%虎林市41森林革蜱1331.7%草原革蜱2458.5%全沟硬蜱49.8%同江市101森林革蜱1413.9%草原革蜱2019.8%长角血蜱2120.8%嗜群血蜱3433.6%全沟硬蜱1211.9%2.4讨论不同时期、不同生存状态的蜱形态学存在一定差异，如若虫时期蜱形态特征不够明显、蜱吸血后，形态特征完全消失，这给形态学鉴定带来极大限制，因此为更准确鉴定蜱种类，我们采用形态学与分子生物学相结合的方法。16SrRNA因其进化速率慢，结构保守，常用于物种鉴定。本研究采用16SrRNA作为目的基因进行PCR扩增。我国东北地区森林茂密，为蜱宿主提供了良好的生存环境。由于东北天气寒冷，蜱生存及种类受到限制，因此东北地区的蜱多为耐寒的林区蜱种[86]。刘国平等对我国东北地区20 动物体表蜱进行鉴定，发现东北地区蜱有7属21种[90]。崔文富等调查黑龙江省蜱种类，结果发现其优势蜱种为森林革蜱[91]。王峰等调查吉林敦化蜱种类发现敦化优势蜱种为嗜群血蜱，全沟硬蜱次之[92]。本研究从吉林省3市采集到3属4种蜱，分别为森林革蜱175只(17.2%)、草原革蜱206只(20.2%)、长角血蜱244(24.0%)、全沟硬蜱393只(38.6%)。黑龙江省6市采集到3属5种蜱，分别为森林革蜱29只(1.5%)、草原革蜱47只(2.5%)、嗜群血蜱412只(21.6%)、长角血蜱146只(7.6%)、全沟硬蜱1276只(66.8%)。吉林省和黑龙江省蜱种类及流行情况不同。虽然吉林省和黑龙江省优势蜱种均为全沟硬蜱，但其占有比率不同，吉林省全沟硬蜱仅占蜱种的38.6%，而黑龙江省全沟硬蜱比率高达66.8%。吉林省长角血蜱、森林革蜱、草原革蜱比率高于黑龙江省。吉林省未发现嗜群血蜱，而嗜群血蜱是黑龙江省第二优势蜱种。我们分析这可能是因为地理环境、气候及采集时间的差异，导致蜱采集种类及优势蜱种与已有文献存在一定差异。本研究仅从吉林省和黑龙江省9个市采集蜱样本，对其他市尚未展开调查。因此应加强东北地区蜱种类调查，了解蜱的地理分布及其携带的病原谱，为东北地区蜱传病的防控提供理论依据。2.5小结1、吉林省有3属4种蜱：森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、全沟硬蜱；黑龙江省有3属5种蜱：森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱、全沟硬蜱。2、吉林省和黑龙江省共采集森林革蜱204只(7.0%)、草原革蜱253只(8.6%)、嗜群血蜱412只(14.1%)、长角血蜱390只(13.3%)、全沟硬蜱1669只(57.0%)。3、全沟硬蜱是吉林省和黑龙江省优势蜱种。嗜群血蜱为黑龙江省第二优势蜱种蜱种，而吉林省未发现嗜群血蜱。21 第三章3种重要蜱传微生物分子流行病学调查蜱是仅次于蚊虫的第二大传播媒介，传播多种细菌、原虫、病毒，严重影响人类的健康及畜牧业的经济发展。常见的蜱传疾病有森林脑炎、发热伴血小板减少综合征、莱姆病、立克次体病等。立克次体、无形体、埃立克体均属于立克次体目，可引起人畜共患疾病。立克次体、无形体、埃立克体给人和动物的健康、安全带来严重危害，因此研究蜱携带此病原体情况具有重要的公共卫生和经济意义。本实验通过PCR方法检测吉林省3市、黑龙江省6市2928只蜱携带立克次体、无形体、埃立克体情况，为吉林省和黑龙江省蜱传疾病的防控提供数据支持。3.1材料3.1.1蜱样本采集见第二章2.1.13.1.2蜱样本分组将采集的蜱按蜱种和采集地区进行分组，每组约15只蜱。3.2方法3.2.1蜱基因组DNA提取见第二章2.2.2.13.2.2引物合成从NCBI下载相关文章，将引物用NCBIBlast比对，选择同源性高、特异性好的引物，送到上海金唯智生物公司合成，引物序列见表3-1[93-98]。表3-1引物Tab.3-1Primers病原名称扩增基因引物名称引物序列(5’-3’)扩增片段大小(bp)立克次体属23S-5SrRNA基因RCK/23-5-FGATAGGTCRGRTGTGGAAGCAC388间隔区(23S-5SRCK/23-5-RTCGGGAYGGGATCGTGTGTTTCrRNAintergenicspacer)斑点热群立克190-kDa外膜蛋白ARr190.70pATGGCGAATATTTCTCCAAAA532次体(ompA)Rr190.602nAGTGCAGCATTCGCTCCCCCT22 续表病原名称扩增基因引物名称引物序列(5’—3’)扩增片段大小(bp)柠檬酸合成酶CS2dATGACCAATGAAAATAATAAT1289(gltA)CSEndrCTTATACTCTCTATGTACA无形体属、16SrRNAEHR16SDGGTACCYACAGAAGAAGTCC345埃立克体属EHR16SRTAGCACTCATCGTTTACAGC牛无形体16SrRNAAB1fCTCGTAGCTTGCTATGAGAAC551AB1rTCTCCCGGACTCCAGTCTG嗜吞噬细胞无形热休克蛋白ANA-GroFTCATTACTCAGAGTGCTTCTCAGTG372体(groEL)ANA-GroRCGATCAAACTGCATACCATCAGTC埃立克体属热休克蛋白gro607FGAAGATGCWGTWGGWTGTACKGC730(groEL)gro1294RAGMGCTTCWCCTTCWACRTCYTCgro677FATTACTCAGAGTGCTTCTCARTG364gro1121RTGCATACCRTCAGTYTTTTCAAC3.2.3立克次体分子流行病学检测3.2.3.1PCR扩增立克次体23S-5SrRNAintergenicspacer以204组2928只蜱为模板，RCK/23-5-F、RCK/23-5-R为引物，检测蜱传立克次体23S-5SrRNAintergenicspacer，反应体系见表3-2。表3-2PCR反应体系Tab.3-2ReactionsystemofPCR成分用量(μL)10×Buffers2.5dNTPs2上游引物1下游引物1模版4Tag酶0.3ddH2O14.2总计25PCR反应条件：预变性：94°C5min；变性：94°C30s，退火：52°C30s，延伸：72°C35s，35个循环；后延伸：72°C5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。3.2.3.2PCR扩增立克次体OmpA基因以立克次体阳性样本为模板，Rr190.70p、Rr190.602n为引物，检测斑点热群立克次体OmpA基因，反应体系见表3-3。表3-3PCR反应体系Tab.3-3ReactionsystemofPCR成分用量(μL)10×Buffers2.5dNTPs2上游引物123 续表成分用量(μL)下游引物1模版4Tag酶0.3ddH2O14.2总计25PCR反应条件：预变性：94°C5min；变性：94°C30s，退火：53°C30s，延伸：72°C45s，35个循环；后延伸：72°C5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。3.2.3.3PCR扩增立克次体gltA基因以立克次体阳性样本为模板，CS2d、CSEndr为引物，检测斑点热群立克次体gltA基因，反应体系见表3-4。表3-4PCR反应体系Tab.3-4ReactionsystemofPCR成分用量(μL)10×Buffers2.5dNTPs2上游引物1下游引物1模版4Tag酶0.3ddH2O14.2总计25PCR反应条件：预变性：94°C5min；变性：94°C30s，退火：53°C30s，延伸：72°C1min20s，10个循环；变性：94°C30s，退火：50°C30s，延伸：72°C1min20s，25个循环；后延伸：72°C5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。3.2.3.4PCR产物的纯化回收、克隆见2章2.2.2.43.2.3.5PCR产物克隆及测序见2章2.2.2.53.2.3.6系统进化分析结合GenBank将测定的序列用DNAStar软件进行编辑。用MEGA5.0软件以邻位相连法（Neighborjoiningmethod，NJ）构建系统进化树，以Kimura’s2-parameter模式进行同源性分析并自举检验1000次（Bootstraptest）。3.2.3.7统计分析蜱感染立克次体阳性率利用PooledInfRateversion4.0软件，最大似然估计法(MLR)计算[99]。MLR可计算每组样本的感染率及其置信区间。3.2.4无形体、埃立克体分子流行病学检测3.2.4.1通用引物扩增无形体、埃立克体16SrRNA以204组2928只蜱为模板，EHR16SD、EHR16SR为通用引物，扩增无形体、埃立克体16SrRNA。体系见表3-5。24 表3-5PCR反应体系Tab.3-5ReactionsystemofPCR成分用量(μL)10×Buffers2.5dNTPs2上游引物1下游引物1模版4Tag酶0.3ddH2O14.2总计25PCR反应条件：预变性：94°C5min；变性：94°C30s，退火：55°C30s，延伸：72°C30s，10个循环；变性：94°C30s，退火：51°C30s，延伸：72°C30s，25个循环；后延伸：72°C5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。3.2.4.2特异引物鉴定无形体以无形体、埃立克体阳性样本为模板，AB1f、AB1r，ANA-GroF、ANA-GroR为特异引物，分别扩增牛无形体16SrRNA及嗜吞噬细胞无形体groEL基因，进一步确定无形体种类，体系见表3-6。表3-6PCR反应体系Tab.3-6ReactionsystemofPCR成分用量(μL)10×Buffers5dNTPs4上游引物5下游引物5模版5Tag酶0.5ddH2O34.5总计50PCR反应条件：预变性：94°C5min；变性：94°C30s，退火：53°C30s，延伸：72°C35s，35个循环；后延伸：72°C5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。3.2.4.3PCR扩增埃立克体groEL基因以无形体、埃立克体阳性样本为模板，gro607F、gro1294R为外套引物，gro677F、gro1121R为内套引物，扩增埃立克体groEL基因，进一步鉴定埃立克体种类，外套体系见表3-7，内套体系见表3-8。表3-7PCR反应体系Tab.3-7ReactionsystemofPCR成分用量(μL)10×Buffers2.5dNTPs2上游引物1下游引物2模版225 续表成分用量(μL)Tag酶0.5ddH2O34.5.总计50PCR反应条件：预变性：94°C5min；变性：94°C30s，退火：58°C30s，延伸：72°C45s，10个循环；变性：94°C30s，退火：53°C30s，延伸：72°C45s，25个循环；后延伸：72°C5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。表3-8PCR反应体系Tab.3-8ReactionsystemofPCR成分用量(μL)10×Buffers5dNTPs4上游引物2下游引物2模版2Tag酶0.5ddH2O34.5.总计50PCR反应条件：预变性：94°C5min；变性：94°C30s，退火：56°C30s，延伸：72°C35s，10个循环；变性：94°C30s，退火：50°C30s，延伸：72°C35s，25个循环；后延伸：72°C5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。3.2.4.4PCR产物的纯化回收、克隆见第二章2.2.2.43.2.4.5PCR产物克隆及测序见第二章2.2.2.53.2.4.6系统进化分析见第三章3.2.3.63.2.4.7统计分析见第三章3.2.3.73.3结果3.3.1立克次体检测结果3.3.1.1立克次体23S-5SrRNAintergenicspacer的扩增结果以204组2928只蜱为模板，进行PCR扩增，获得大小约为388bp的目的条带，见图3-1。通过PCR扩增，共检测出122组阳性，阳性率为6.1%。其中吉林省1018只蜱，阳性率为3.8%(2.6%-5.3%)；黑龙江省1910只蜱阳性率为7.7%。26 图3-1立克次体23S-5SrRNA基因间隔区扩增结果1：水；2-19：检测样本；M：marker2000Fig3-1PCRamplificationof23S-5SrRNAintergenicspacerforrickettsiae1:H2O;2-19:testsamples;M:marker20003.3.1.2斑点热群立克次体ompA基因扩增结果以122组立克次体阳性样本为模板，扩增斑点热群立克次体ompA基因，扩增片段大小约为532bp，见图3-2。通过PCR扩增，共检测出117组斑点热群立克次体阳性，阳性率为5.7%。其中吉林省1018只蜱阳性率为3.2%；黑龙江省1910只蜱阳性率为7.5%。图3-2立克次体OmpA基因扩增结果1-17：检测样本；M:marker2000Fig3-2PCRamplificationofOmpAforrickettsiae1-17:testsamples;M:marker20003.3.1.3斑点热群立克次体gltA基因扩增结果以122组立克次体阳性样本为模板，扩增斑点热群立克次体gltA基因，扩增片段大小约为1289bp，见图3-3。通过PCR扩增，共检测出117组斑点热群立克次体阳性，阳性率为5.7%。其中吉林省1018只蜱阳性率为3.2%；黑龙江省1910只蜱阳性率为7.5%。图3-3PCR扩增立克次体gltA基因1-7：检测样本；M：marker2000；Fig3-3PCRamplificationofgltAgeneforrickettsiae1-7:testsamples;M:marker20003.3.1.4OmpA基因进化树分析结果将测得立克次体序列与GenBank中已知立克次体27 ompA基因序列进行同源性比对分析及系统进化树分析，见表3-9和图3-4。分析结果显示吉林省和黑龙江省共有4种立克次体，其中3种为已知立克次体：R.raoultii、CandidatusR.tarasevichiae、R.heilongjiangensis，1种为立克次体新种：CandidatusR.jingxinensis。R.raoultii(KT899076)与蒙古国草原革蜱中检测到的R.raoultii(KU361215)处于同一进化支且同源性最高，为99.9%。C.R.tarasevichiae(KT899079)与我国人体中检测的C.R.tarasevichiae(JX996053)位于同一分支且同源性最高，为100%。R.heilongjiangensis(KT899082)与日本人体中检测的R.heilongjiangensis(AB473995)在同一进化支且同源性最高，为99.9%。当检测的核酸序列与已知物种ompA基因核酸序列同源性小于98.8%，同时与gltA基因核酸序列同源性小于99.9%，即可判定为立克次体新种[27]。C.R.jingxinensis(KT899080)与加蓬共和国检测C.R.davousti(DQ402517)和捷克共和国检测的C.R.vini(KJ626331)亲缘关系最近，同源性分别为95.3%和96.6%，均低于98%，因此判定其为立克次体新种。图3-4基于ompA基因构建立克次体种群进化树Fig.3-4PhylogenetictreewasconstructedbasedonompAgeneforrickettsia28 表3-9基于ompA基因进行立克次体同源性分析结果Tab.3-9HomologyanalysiswasconstructedbasedonompAgeneforrickettsiae12345678910111213141516171819201R.raoultii,KT8990762R.raoultii,KU3612150.003C.R.tarasevichiae,KT8990790.210.214C.R.tarasevichiae,JX9960530.210.210.005R.heilongjiangensis,KT8990820.140.140.240.246R.heilongjiangensis,AB4739950.140.140.240.240.007C.R.jingxinensis,KT8990800.150.150.260.260.060.068C.R.vini,KJ6263310.120.120.230.230.050.050.059C.R.davousti,DQ4025170.130.130.240.240.050.050.050.0310C.R.kingi,HF9350770.190.190.080.080.270.270.270.270.2611C.R.andeanae,KF1793520.110.110.190.190.200.200.210.210.200.1512R.africae,JF7002540.120.120.220.220.090.090.090.060.080.250.1913R.amblyommii,EF1940960.040.040.200.200.160.160.160.140.150.210.090.1414R.felis,AY7270361.011.011.141.140.940.940.890.980.981.031.061.071.0915R.japonica,DQ0193190.160.160.250.250.040.040.090.070.070.270.250.120.200.9716R.massiliae,KR4011460.110.110.240.240.150.150.140.140.140.230.180.130.110.980.1817R.mongolotimonae,HQ7283520.140.140.230.230.100.100.100.060.080.260.210.030.151.110.130.1418R.peacockii,AH0134130.230.230.290.290.180.180.170.150.170.320.270.120.220.980.210.230.1419R.rickettsii,AY3192930.150.150.230.230.100.100.100.080.090.240.220.050.160.930.130.150.050.1520R.sibirica,JF7002550.140.140.230.230.100.100.100.060.080.260.210.030.151.110.130.140.000.140.0521R.slovaca,FJ1573160.120.120.230.230.090.090.080.050.070.260.200.020.141.040.120.140.030.110.040.0329 3.3.1.5GltA基因进化树分析将测得立克次体序列与GenBank中已知立克次体gltA基因进行同源性比对分析(见表3-10)及系统进化树分析(见图3-5)。分析结果显示吉林省和黑龙江省共有4种立克次体，其中3种为已知立克次体：R.raoultii、CandidatusR.tarasevichiae、R.heilongjiangensis，1种为立克次体新种：CandidatusR.jingxinensis。R.raoultii(KT899091)与俄罗斯森林革蜱中检测的R.raoultii(DQ365804)处于同一进化支且同源性最高，为99.9%。C.R.tarasevichiae(KT899088)与俄罗斯全沟硬蜱中检测的C.R.tarasevichiae(JX996053)位于同一分支且同源性最高，为99.9%。R.heilongjiangensis(KT899087)与俄罗斯嗜群血蜱中检测的R.heilongjiangensis(AY285776)在同一进化支且同源性最高，为99.9%。当检测的核酸序列与已知物种ompA基因核酸序列同源性小于98.8%、同时与gltA基因核酸序列同源性小于99.8%，即可判定为立克次体新种[27]。C.R.jingxinensis(KT899088)与加蓬共和国检测C.R.davousti(DQ402516)和捷克共和国检测的C.R.vini(KJ626334)亲缘关系最近，同源性最高分别为99.3%和99.6%，均低于99.8%，因此可以判定其为立克次体新种。图3-5基于gltA基因构建立克次体种群进化树Fig.3-5PhylogenetictreewasconstructedbasedongltAgeneforrickettsia30 表3-10基于gltA基因进行立克次体同源性分析结果Tab.3-10HomologyanalysiswasconstructedbasedongltAgeneforrickettsiae12345678910111213141516171819201C.R.jingxinensis,KT8990882C.R.tarasevichiae,KT8990850.153R.raoultii,KT8990910.010.154R.heilongjiangensis,KT8990870.010.150.015R.raoultii,DQ3658040.010.150.000.016R.heilongjiangensis,AY2857760.010.150.010.000.017C.R.tarasevichia,DQ1689830.150.000.150.150.150.158C.R.kingi,HF9350740.130.010.140.130.140.130.019C.R.vini,KJ6263340.000.150.010.010.010.000.150.1310R.africae,HM0502880.010.160.010.010.010.010.160.140.0111R.sibirica,KM2887110.010.160.010.010.010.010.160.140.010.0112R.slovaca,KJ4102670.010.150.010.010.010.000.150.130.010.010.0013R.mongolotimonae,DQ0970810.010.160.010.010.010.010.160.140.010.010.000.0014R.rickettsii,KF7426020.010.160.010.010.010.010.160.140.010.010.010.010.0115R.feli,JQ6744840.100.170.090.100.090.100.170.160.100.100.100.100.100.1016R.japonica,AY7433270.010.160.010.010.010.010.160.140.010.010.010.010.010.020.1117R.massiliae,HM0502930.020.160.010.010.010.010.160.140.020.020.010.010.010.020.100.0218R.peacockii,HF935070.010.150.000.010.000.010.150.140.010.010.000.000.000.010.100.010.0119C.R.andeanae,GU1690510.010.150.000.010.000.010.150.130.010.010.010.010.010.010.100.010.010.0120R.rickettsii,KF7426020.010.160.010.010.010.010.160.140.010.010.010.010.010.000.100.020.020.010.0121C.R.davousti,DQ4025160.010.160.020.010.020.010.160.140.010.020.020.010.020.020.110.020.020.020.020.0231 3.3.1.6立克次体流行率统计结果立克次体阳性率为6.1%，其中黑龙江省立克次体阳性率(7.7%)高于吉林省(3.8%)。5种蜱中均有立克次体存在。立克次体在森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱和全沟硬蜱阳性率分别为6.1%、7.5%、3.9%、5.5%、6.5%。立克次体科的R.raoutii种在吉林省森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱阳性率分别为4.4%、5.2%、1.6%；黑龙江省仅在森林革蜱和草原革蜱发现该病原体，阳性率分别为10.3%、10.6%。立克次体科的CandidatusR.tarasevichiae在吉林省仅存在全沟硬蜱，阳性率为3.1%；黑龙江省的嗜群血蜱和全沟硬蜱均发现该病原体，阳性率分别为0.2%、8.0%。立克次体科的R.heilongjiangensis仅存在黑龙江省的长角血蜱和嗜群血蜱，阳性率分别为5.4%、5.0%；吉林省未发现R.heilongjiangensis的存在。立克次体新种“CandidatusR.jingxinensis”仅在吉林省长角血蜱中发现2组阳性，阳性率为0.9%，见表3-11。3.3.1.7斑点热群立克次体流行率统计结果在122组立克次体样本，斑点热群立克次体阳性有117组，阳性率为5.7%。黑龙江省斑点热群立克次体阳性率(7.5%)高于吉林省(3.2%)。立克次体在森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱和全沟硬蜱阳性率分别为5.9%、6.0%、3.2%、5.5%、6.4%。立克次体科的R.raoutii在吉林省在森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱阳性率分别为3.1%、3.4%、1.6%。黑龙江省仅在森林革蜱和草原革蜱发现该病原体，阳性率分别为10.3%、10.6%立克次体科的CandidatusR.tarasevichiae在吉林省仅存在全沟硬蜱，阳性率为2.7%；黑龙江省的嗜群血蜱和全沟硬蜱均发现该病原体，阳性率分别为0.2%、8.0%。立克次体科的R.heilongjiangensis仅存在黑龙江省的长角血蜱和嗜群血蜱，阳性率分别为4.3%、5.0%；吉林省未发现R.heilongjiangensis的存在。立克次体新种“CandidatusR.jingxinensis”仅在吉林省长角血蜱中发现2组阳性，阳性率为0.9%，见表3-12。32 表3-112015年，中国东北地区立克次体检测结果Tab.3-11PCRsurveyresultsfortickstestedforspottedfevergrouprickettsiae,northeasternChina,2015吉林省黑龙江省蜱种蜱样品数阳性率(%,95%CI)阳性数/蜱阳性率(%,R,r(%,C.R.j(%,C.R.t(%,阳性数/蜱阳性率(%,R,r(%,R,h(%,C.R.t(%,样本数95%CI)95%CI)95%CI)95%CI)样本数95%CI)95%CI)95%CI)95%CI)6/1754.44.4003/2910.310.3$00森林革蜱2046.1(3.1-11.4)(1.9-9.4)(1.9-9.3)8/2065.25.2005/4710.610.6$00草原革蜱2537.5(4.3-12.6)(2.5-10.0)(2.5-10.0)长角血蜱3903.96/2442.91.60.906/1465.405.40(2.2-6.6)(1.3-6.0)(0.6-3.6)(0.2-3.2)(2.3-11.6)(2.3-11.6)嗜群血蜱4125.50000016/4125.505.00.2(3.3-8.8)(3.3-8.8)(2.9-8.1)(0.1-1.2)全沟硬蜱16696.510/3933.1003.162/12768.0008.0(5.2-8.4)(1.6-5.6)(1.6-5.6)(6.2-10.2)(6.2-10.2)总计29286.130/10183.82.00.21.192/19107.70.41.24.4(5.1-7.3)(2.6-5.3)(1.2-3.0)(0.1-0.7)(0.5-1.9)(6.2-9.4)(0.2-0.8)(0.8-1.8)(3.4-5.5)注：立克次体阳性率利用PooledInfRateversion4.0软件的最大似然估计法计算。R.r.,Rickettsiaraoutii;C.R.j,CandidatusRickettsiajingxinensis;C.R.t.,CandidatusRickettsiatarasevichiae;R.h.,Rickettsiaheilongjiangensis.%,95%CI:置信区间33 表3-122015年，中国东北地区斑点热群立克次体检测结果Tab.3-12PCRsurveyresultsfortickstestedforrickettsiae,northeasternChina,2015吉林省黑龙江省蜱种蜱样品数阳性率(%,阳性数/蜱样阳性率(%,R,r(%,C.R.j(%,C.R.t(%,阳性数/蜱阳性率(%,R,r(%,R,h(%,C.R.t(%,95%CI)本数95%CI)95%CI)95%CI)95%CI)样本数95%CI)95%CI)95%CI)95%CI)5.93.13.1$森林革蜱2045/175003/2910.310.300(2.8-11.1)(1.2-6.9)(1.2-6.9)6.03.43.4$草原革蜱2536/206005/4710.610.600(3.2-10.7)(1.4-7.3)(1.4-7.3)3.22.91.60.94.34.3长角血蜱3906/24405/14600(1.8-5.5)(1.3-6.0)(0.6-3.6)(0.2-3.2)(1.6-9.7)(1.6-9.7)5.55.55.00.2嗜群血蜱4120000016/4120(3.3-8.8)(3.3-8.8)(2.9-8.1)(0.1-1.2)6.42.72.78.08.0全沟硬蜱16699/3930062/127600(5.1-8.1)(1.4-5.1)(1.4-5.1)(6.2-10.2)(6.2-10.2)5.73.21.60.20.87.50.41.14.4总计292826/101891/1910(4.8-6.8)(2.2-4.6)(1.0-2.6)(0.1-0.7)(0.4-1.6)(6.1-9.2)(0.2-0.8)(0.7-1.7)(3.4-5.5)注：立克次体阳性率利用PooledInfRateversion4.0软件的最大似然估计法计算。R.r.,Rickettsiaraoutii;C.R.j,CandidatusRickettsiajingxinensis;C.R.t.,CandidatusRickettsiatarasevichiae;R.h.,Rickettsiaheilongjiangensis.%,95%CI:置信区间34 3.3.2无形体、埃立克体检测结果3.3.2.1埃立克体、无形体16SrRNA扩增结果以204组2928只蜱为模板，扩增无形体、埃立克体16SrRNA，扩增片段大小为340bp，见图3-6。通过PCR扩增，共检测出125组阳性，阳性率为6.4%。其中吉林省1018只蜱阳性率为4.5%；黑龙江省1910只蜱阳性率为7.5%。图3-6无形体、埃立克体16SrRNA扩增结果1：水；2-17：检测样本；M：marker2000Fig.3-6PCRamplificationof16SrRNAforanaplasma、ehrlichia1:H2O;2-17:testsamples;M:marker20003.3.2.2特异引物鉴定无形体结果以125组阳性为模板，AB1f、AB1r为特异引物扩增牛无形体16SrRNA，扩增片段大小为551bp，见图3-7。通过PCR扩增，共检测出2组牛无形体阳性样本，阳性率为0.1%。牛无形体仅在黑龙江省的嗜群血蜱和长角血蜱各发现一株，阳性率分别为0.2%和0.7%。特异引物扩增结果与通用引物扩增结果一致。图3-7牛无形体16SrRNA扩增结果1：水；2-7：检测样本;M：marker2000Fig.3-7PCRamplificationof16SrRNAforanaplasmabovis1:H2O;2-17:testsamples;M:marker2000以125组阳性为模板，ANA-GroF、ANA-GroR为特异引物扩增嗜吞噬细胞无形体groEL基因，扩增片段大小为372bp，见图3-8。通过PCR扩增，共检测出123组阳性样本。其中吉林省1018只蜱阳性率为4.5%；黑龙江省1910只蜱阳性率为7.4%。特异引物扩增结果与通用引物扩增结果一致。35 图3-8嗜吞噬细胞无形体groEL基因扩增结果1-7：检测样本；M：marker2000Fig.3-8PCRamplificationofgroELgeneforanaplasmaphagocytophilum1-7:testsamples;M:marker20003.3.2.3无形体16SrRNA同源性分析及系统进化树分析结果将测得无形体序列与GenBank中已知无形体16SrRNA进行同源性比对分析(见表3-13)及系统进化树分析(见图3-9)。分析结果显示吉林省和黑龙江省共发现两种已知无形体：A.bovis、A.phagocytophium。A.bovis分为两个进化群，其中本研究检测的A.bovis(KU921422)与日本狗(LC012812)、俄罗斯嗜群血蜱(JX092092)、马来西亚食蟹猴中检测的A.bovis(KM114612)处于同一进化分支，且同源性最高，为100%，与浙江羊(KP062958)、重庆牛(FJ169957)和意大利羊中检测的A.bovis(KC335228)处于不同分支，同源性为99.7%。A.phagocytophium分两个进化支，本研究检测的A.phagocytophium(KX810088)与湖北牛(KF569911)、日本鹿(AB196721)和浙江牛体中检测的A.phagocytophilum(KP062963)处于同一分支且同源性最高，为100%。而与俄罗斯全沟硬蜱(HM366589)、韩国人(KP306518)、丹麦鹿(AY776165)、美国人体中检测的A.phagocytophilum(U02521)处于不同分支，且同源性较低，为99.1%。图3-9基于16SrRNA基因构建无形体种群进化树Fig.3-9Phylogenetictreewasconstructedbasedon16SrRNAgeneforanaplasma36 表3-13基于16SrRNA基因进行无形体同源性分析结果Tab.3-13Homologyanalysiswasconstructedbasedon16SrRNAgeneforanaplasma12345678910111213141516171819201A.bovis,KU9214222A.phagocytophilum,KX8100880.023A.bovis,LC0128120.000.024A.bovis,JX0920920.000.020.005A.bovis,KM1146120.000.020.000.006A.bovis,KP0629580.000.020.000.000.007A.bovis,FJ1699570.000.020.000.000.000.008A.bovis,KC3352280.000.020.000.000.000.000.009A.centrale,KU6867840.030.020.030.030.030.030.030.0310A.marginale,KU6867940.030.020.030.030.030.030.030.030.0011A.ovis,AY2621240.030.020.030.030.030.030.030.030.000.0012A.phagocytophilum,KF5699110.020.000.020.020.020.020.020.020.020.020.0213A.phagocytophilum,HM3665890.020.010.020.020.020.010.010.010.020.020.020.0114A.phagocytophilum,DQ4588080.020.010.020.020.020.010.010.010.020.020.020.010.0015A.phagocytophilum,AB1967210.020.000.020.020.020.020.020.020.030.030.030.000.010.0116A.phagocytophilum,KP0629630.020.000.020.020.020.020.020.020.020.020.020.000.010.010.0017A.phagocytophilum,KP3065180.020.010.020.020.020.010.010.010.020.020.020.010.000.000.010.0118A.phagocytophilum,AY7761650.020.010.020.020.020.010.010.010.020.020.020.010.000.000.010.010.0019Anaplasmasp.sh65-5,KM1869340.000.020.000.000.000.000.000.000.030.030.030.020.020.020.020.020.020.0220A.phagocytophilum,U025210.020.010.020.020.020.010.010.010.020.020.020.010.000.000.010.010.000.000.0221A.phagocytophilum,DQ3423240.020.010.020.020.020.010.010.010.020.020.020.010.000.000.010.010.000.000.020.0037 3.3.2.4无形体流行率统计结果无形体阳性率为6.4%。黑龙江省无形体感染率(7.7%)高于吉林省(4.5%)。5种蜱中均有无形体的存在。立克次体在森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱和全沟硬蜱阳性率分别为2.3%、1.7%、3.5%、7.2%、9.4%。全沟硬蜱中无形体感染率(9.4%)最高，嗜群血蜱(7.2%)、长角血蜱(3.5%)、森林革蜱(2.3%)次之，草原革蜱(1.7%)最低。无形体属的A.phagocytophilum在吉林省森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、全沟硬蜱阳性率分别为2.2%、0.5%、3.7%、12.6%；在黑龙江省森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱、全沟硬蜱阳性率分别为6.1%、7.1%、3.2%、7.2%、8.2%；无形体属A.bovis仅在黑龙江省的长角血蜱和嗜群血蜱各发现一株，阳性率分别为0.7%、0.2%，见表3-14。38 表3-142015年，中国东北地区无形体检测结果Tab.3-14PCRsurveyresultsfortickstestedforanaplasma,northeasternChina,2015吉林省黑龙江省阳性率(%,蜱种蜱样品数阳性数/蜱阳性率(%,95%A.P(%,95%阳性数/蜱样阳性率(%,95%A.P(%,95%,A.B(%,95%95%CI)样本数CI)CI)本数CI)CI)CI)森林革蜱2042.3(0.8-5.7)2/1752.2(0.8-5.3)2.2(0.8-5.3)2/296.1(1.7-24.4)6.1(1.7-24.4)0草原革蜱2531.7(0.6-4.0)1/2060.5(0.1-2.3)0.5(0.1-2.3)3/477.1(2.2-20.0)7.1(2.2-20.0)0长角血蜱3903.5(1.9-6.0)7/2443.7(1.8-7.3)3.7(1.8-7.3)4/1463.2(1.1-7.9)2.3(0.6-6.1)0.7(0.1-3.3)嗜群血蜱4127.2(4.5-11.3)00019/4127.2(4.5-11.3)6.5(4.1-10.3)0.2(0.1-1.2)全沟硬蜱16699.4(7.4-11.3)24/39312.6(8.3-20.1)12.6(8.3-20.1)63/12768.2(6.4-10.6)8.2(6.4-10.6)0总计29286.4(5.4-7.6)34/10184.5(3.2-6.2)4.5(3.2-6.2)91/19107.5(6.1-9.2)7.4(6.0-9.2)0.1(0.0-0.3)注：无形体阳性率利用PooledInfRateversion4.0软件的最大似然估计法计算。A.P:Anaplasmaphagocytophilum;A.B:Anaplasmabovis;%,95%CI:置信区间。39 3.3.2.5埃立克体groEL基因扩增结果以125组阳性为模板，扩增埃立克体groEL基因，扩增片段大小为364bp，见图3-10。通过PCR扩增，共检测出47组阳性，阳性率为1.8%。其中吉林省1018只蜱阳性率为1.5%；黑龙江省1910只蜱阳性率为2.0%。仅在嗜群血蜱、长角血蜱、全沟硬蜱中检测到埃立克体阳性。图3-10埃立克体groEL基因扩增结果M：marker2000；1-6：检测样本Fig.3-10PCRamplificationofgroELgeneforehrlichiaM:marker2000;1-6:testsamples3.3.2.6埃立克体groEL基因同源性分析及系统进化树分析结果将测得埃立克体序列与GenBank中已知埃立克体gltA基因进行同源性比对分析(见表3-15)及系统进化树分析(见图3-11)。分析结果显示吉林省和黑龙江省共检测到三种埃立克体：E.muris，CandidatusN.mikurensis及一种变异体：Ehrlichiasp.hc-hlj209。本研究检测E.muris(KU921423)与波兰蓖子硬蜱(KF312362)、日本啮齿动物(AB204863)、俄罗斯田鼠中检测的E.muris(GU358690)处于同一分支且同源性均为99.9%。CandidatusN.mikurensis分为两个分支，本研究检测的CandidatusN.mikurensis(KU921420)与俄罗斯全沟硬蜱(FJ966359)、日本啮齿动物(AB204864)、我国人体中检测的CandidatusN.mikurensis(JQ359062)处于同一分支且同源性均为100%。而与德国犬(EU432375)、荷兰人(LC167302)及意大利蓖子硬蜱中检测的CandidatusN.mikurensis(KJ663733)处于不同分支，且同源性较低。Ehrlichiasp.hc-hlj209(KU921424)与俄罗斯日本血蜱中检测的埃立克体变异体Ehrlichiasp.Kh-Hj27(FJ966349)处于同一分支且同源性最高，为99.8%。同时与俄罗斯嗜群血蜱检测的Ehrlichiasp.Am-Hc79及美国人体中检测的E.ewingi属于同一大分支。40 表3-15基于groEL基因进行埃立克体同源性分析结果Tab.3-15HomologyanalysiswasconstructedbasedongroELgeneforehrlichia1234567891011121314151617181920212223241hc-hlj209,KU9214242C.N.mikurensis,KU9214200.263E.muris,KU9214230.090.244Ehrlichiasp.P-Mtn,HQ6589040.110.240.145C.E.khabarensis,KR0631390.110.220.110.156C.E.ovata,DQ6725530.090.280.040.140.117C.E.regneryi,KJ8149610.110.290.080.130.140.098Ehrlichiasp.Am-Hc79,JX0920910.030.290.090.120.130.100.119Ehrlichiasp.Kh-Hj27,FJ9663490.000.260.090.110.110.090.110.0310C.E.shimanensis,AB0744620.090.220.100.120.110.080.100.090.0911E.canis,JN3914080.120.280.100.140.140.100.040.130.120.1012C.N.mikurensis,FJ9663590.260.000.240.240.220.280.290.290.260.220.2813C.N.mikurensis,EU4323750.260.010.240.240.230.280.280.290.260.230.290.0114C.N.mikurensis,KF8039970.260.010.240.240.230.280.280.290.260.230.290.010.0015C.N.mikurensis,LC1673020.260.010.240.240.230.280.280.290.260.230.290.010.000.0016C.N.mikurensis,KJ6637330.260.010.240.240.230.280.280.290.260.230.290.010.000.000.0017C.N.mikurensis,AB2048640.260.000.240.240.220.280.290.290.260.220.280.000.010.010.010.0118C.N.lotoris,EF6337450.240.080.240.240.210.270.240.250.240.230.250.080.090.090.090.090.0819C.N.mikurensis,JQ3590620.260.000.240.240.220.280.290.290.260.220.280.000.010.010.010.010.000.0820E.ewingii,AF1952730.040.260.090.100.120.100.100.050.040.090.120.260.260.260.260.260.260.230.2621E.chaffeensis,CP0074800.080.250.080.120.100.080.090.090.080.090.090.250.250.250.250.250.250.210.250.0922E.ruminantium,AB6257940.160.290.190.130.190.190.180.150.160.170.200.290.290.290.290.290.290.260.290.150.1623E.muris,KF3123620.090.240.000.140.110.040.080.090.090.100.100.240.240.240.240.240.240.240.240.090.080.1924E.muris,AB2048630.090.240.000.140.110.040.080.090.090.100.100.240.240.240.240.240.240.240.240.090.080.190.0025E.muris,GU3586900.090.240.000.140.110.040.080.090.090.100.100.240.240.240.240.240.240.240.240.090.080.190.000.0041 图3-10基于groEL基因构建埃立克体种群进化树Fig.3-10PhylogenetictreewasconstructedbasedongroELgeneforehrlichia3.3.2.7埃立克体流行率统计结果125组阳性中，共有47组埃立克体阳性，阳性率为1.8%。黑龙江省埃立克体感染率(2.0%)高于吉林省(1.5%)。埃立克体在长角血蜱、嗜群血蜱和全沟硬蜱中阳性率分别为0.8%、0.7%、3.1%。埃立克体属的E.muris在吉林省仅在全沟硬蜱中发现，阳性率为4.3%；而在黑龙江省嗜群血蜱和全沟硬蜱均有发现，阳性率分别为0.2%、1.9%；埃立克体属的CandidatusN.mikurensis仅存在全沟硬蜱，吉林省和黑龙江省阳性率分别为0.3%、0.5%。埃立克体属的Ehrlichiasp.hc-hlj209仅存在于黑龙江省长角血蜱和嗜群血蜱，阳性率分别为2.2%、0.2%，表3-16。42 表3-16中国东北部分地区埃立克体检测结果Tab.3-16PCRsurveyresultsfortickstestedforehrlichia,northeasternChina,2015吉林省黑龙江省蜱种蜱样品数阳性率(%,阳性数/蜱阳性率(%,E.M(%,95%C.N.M(%,阳性数/蜱阳性率(%,E.M(%,95%C.N.M(%,hc-hlj209(%,95%CI)样本数95%CI)CI)95%CI)样本数95%CI)CI)95%CI)95%CI)森林革蜱20400/1750000/290000草原革蜱25300/2060000/470000长角血蜱3900.8(0.2-2.1)0/2440003/1462.2(0.6-6.1)002.2(0.6-6.1)嗜群血蜱4120.5(0.1-1.6)00002/4120.5(0.1-1.6)0.2(0.1-1.2)00.2(0.1-1.2)全沟硬蜱16693.1(2.2-4.1)14/3934.9(2.8-8.1)4.3(2.4-7.2)0.3(0.1-1.2)28/12762.6(1.8-3.1)1.9(1.3-2.9)0.5(0.1-1.7)0总计29281.8(1.3-2.4)14/10181.5(0.9-2.5)1.4(0.8-2.3)0.1(0.0-0.5)33/19102.0(1.4-2.7)1.3(0.9-1.9)0.3(0.1-0.7)0.2(0.1-0.5)注：埃立克体阳性率利用PooledInfRateversion4.0软件的最大似然估计法计算。E.M:Ehrlichiamuris;C.N.M:CandidatusNeoehrlichiamikurensis;hc-hlj209:Ehrlichiasp.hc-hlj209.%,95%CI:置信区间。43 3.4讨论近年来，随着蜱传疾病发病率的逐年上升，蜱及蜱传疾病受到越来越多重视。本研究检测吉林省和黑龙江省9个市蜱携带病原体情况，为我国东北地区蜱传疾病提供理论基础。立克次体分为斑点热群、斑疹伤寒群和遗传群三个群。我国东北地区已发现的立克次体主要有5种(R.heilongjiangensis，R.sibrica，R.massilliae，R.raoultii和CandidatusR.tarasevichiae)。本研究发现3种已知斑点热群立克次体(R.raoultii,CandidatusR.tarasevichiae,R.heilongjiangensis)和1种立克次体新种(CandidatusR.jingxinensis)。R.raoultii首次在俄罗斯发现，此后在美国，亚洲，欧洲均有此病原体的报道[36,104]。在我国，R.raoultii首次发现于吉林省[39]。在中国-俄罗斯边界，R.raoultii主要存在于草原革蜱(82%)中，在全沟硬蜱(0.8%)也有发现[105]。但本研究仅在吉林省的草原革蜱(5.2%)、森林革蜱(4.4%)、长角血蜱(1.6%)及黑龙江省草原革蜱(10.6%)和草原革蜱(10.3%)中发现此病原体，在全沟硬蜱中未发现。草原革蜱可能是其传播媒介。CandidatusR.tarasevichiae最初发现于俄罗斯，之后在日本、中国也有此病原体的报道[106,107]。黑龙江省的全沟硬蜱和患者体内均发现此病原体的存在[107]。本研究在吉林省和黑龙江省均检测到该病原体，吉林省仅存在于全沟硬蜱(3.1%)，黑龙江省在嗜群血蜱(0.2%)中发现一例，其余全存在全沟硬蜱(8.0%)。全沟硬蜱是其主要传播媒介。R.heilongjiangensis可引起畸形传染病。1983年首次从黑龙江省被蜱叮咬患者血液内检测并分离到R.heilongjiangensis[34]，此后在俄罗斯，日本，泰国均有该病原体的报道[100-102]。黑龙江省3个城市检测到R.heilongjiangensis阳性率为4.7%，本研究检测阳性率为1.2%。R.heilongjiangensis最初在森林革蜱及血蜱中发现，但本研究仅在长角血蜱(5.4%)和嗜群血蜱(5.0%)中发现该病原[103]。因此推断长角血蜱和嗜群血蜱可能是其主要传播媒介。在吉林省野生动物及人均发现过该病原体的存在，但本研究在吉林省未发现此病原体。除此之外，我们在吉林省延吉市长角血蜱检测到1种立克次体新种(CandidatusR.jingxinensis)，其阳性率为0.9%。从ompA和gltA发现该物种与CandidatusR.vini和CandidatusR.davousti亲缘关系较近。尽管CandidatusR.jingxinensis尚未在人和动物体内发现，但不排除其感染人和动物的可能。我国东北存在的可引起人或动物疾病的无形体有4种(A.bovis,A.phagocytophilum,A.marginale和A.ovis)。本实验仅发现2种无形体(A.bovis,A.phagocytophilum，)A.bovis是一种白细胞内寄生的革兰氏阴性菌。可寄生在牛、羊、狗、猫、鹿等动物体内[110]。病畜及病原携带者是传染源。主要传播媒介是蜱、蚊、牛虻等，吸血昆虫也可传播此病原体。近期研究表明，我国羊体内A.bovis阳性率约为10-16%[111]。本研究仅在黑龙江省长角血蜱(0.7%)和嗜群血蜱(0.2%)中检测到A.bovis。A.phagocytophilum是一种严重影响人类健康的病原体。在牛、羊、兔、啮齿动物中均有此病原体的报道[108]。1990年从美国被蜱叮咬患者体内首次发现此病原体，现已广泛分布44 于中国、韩国、日本、俄罗斯、美国、英国、法国、意大利、西班牙、葡萄牙等国家[43]。2011年，在湖北省长角血蜱(14.6%)和草原革蜱(30.8%)中发现A.phagocytophilum[109]。本研究在吉林省、黑龙江省所有蜱种均检测到此病原体，其中全沟硬蜱中阳性率最高，为9.4%，因此推测全沟硬蜱可能是东北A.phagocytophilum的主要传播媒介。我国常见的埃立克体有4种(E.canis,E.chaffeensis,E.muris、CandidatusN.mikurensis)。本研究发现2种已知埃立克体(E.muris、CandidatusN.mikurensis)及1种埃立克体变异种(Ehrlichiasp.hc-hlj209)。E.muris是细胞内寄生菌，可引起人畜共患疾病，其症状与人单核细胞埃立克体病相似。1999年，首次在俄罗斯全沟硬蜱中发现E.muris[112]。2011年俄罗斯全沟硬蜱中E.muris阳性率约2.0-14.1%[113]。2016年，我国首次从人体内发现该病原体的存在[114]。本研究首次在吉林省和黑龙江省全沟硬蜱检测到E.muris，阳性率为4.3-1.9%，由此推断全沟硬蜱可能是E.muris的传播媒介。CandidatusN.mikurensis通过蜱传播可引起新埃立克体病。临床表现为发热、肌肉疼痛[115]。2010年，我国首次在黑龙江省发现人感染CandidatusN.mikurensis的病例[116]。现今，CandidatusN.mikurensis广泛分布于我国多个省市[117]。2012年在吉林省啮齿动物体内检测到CandidatusN.mikurensis阳性率为13.8%，黑龙江省为4.9%[118]。本研究仅在全沟硬蜱中发现该病原体，阳性率为0.3-0.5%，因此全沟硬蜱可能是其传播媒介。本研究在黑龙江省嗜群血蜱(0.2%)和长角血蜱(2.2%)中发现了1个埃立克体变异株(Ehrlichiasp.hc-hlj209)。其与俄罗斯Ehrlichiasp.Kh-Hj27同源性较高，应属一个种，与E.ewingii同属一分支，因此其可能引起人畜共患疾病。本研究从分子生物学水平检测了吉林省和黑龙江省蜱传立克次体、无形体和埃立克体情况，但未对3种病原体进行分离，随后我们将对检测到的9个病原进行分离研究，为我国东北地区蜱传疾病的流行提供理论支持。3.5小结1、本研究在吉林省检测到3种立克次体(R.raoultii，C.R.tarasevichiae，C.R.jingxinensis)、1种无形体(A.phagocytophilum)、2种埃立克体(E.muris、C.N.mikurensis)。在黑龙江省发现3种立克次体(R.raoultii，C.R.tarasevichiae，R.heilongjiangensis)、2种无形体(A.phagocytophilum，A.bovis)、3种埃立克体(E.muris,Ehrlichiasp.hc-hlj209、C.N.mikurensis)。2、在吉林省长角血蜱中发现1个立克次体新种（CandidatusRickettsiajingxinensis）、在黑龙江省嗜群血蜱和长角血蜱中发现1个埃立克体变异株(Ehrlichiasp.hc-hlj209)3、立克次体在草原革蜱中阳性率最高，为7.5%，无形体、埃立克体在全沟硬蜱中阳性率最高，分别为9.4%、3.1%。全沟硬蜱携带病原种类多，感染率高。4、无形体阳性率(6.4%)高于立克次体(6.1%)高于埃立克体(1.8%)。黑龙江省蜱携带45 病原体的阳性率均高于吉林省。46 结论1、吉林省有3属4种蜱：森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱和全沟硬蜱；黑龙江省有3属5种蜱：森林革蜱、草原革蜱、长角血蜱、嗜群血蜱和全沟硬蜱。全沟硬蜱是吉林省、黑龙江省共有优势蜱种。嗜群血蜱是黑龙江省第二优势蜱种，吉林省未发现嗜群血蜱。2、本研究共检测4种立克次体、2种无形体、3种埃立克体。无形体阳性率(6.4%)高于立克次体(6.1%)高于埃立克体(1.8%)。黑龙江省蜱携带病原体的阳性率均高于吉林省。立克次体在草原革蜱中阳性率最高，为7.5%，无形体、埃立克体在全沟硬蜱中阳性率最高，分别为9.4%、3.1%。3、在吉林省长角血蜱中发现1个立克次体新种（CandidatusRickettsiajingxinensis），在黑龙江省嗜群血蜱和长角血蜱中发现1个埃立克体变异株(Ehrlichiasp.hc-hlj209)47 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作者简介姓名刘欢欢性别女民族汉黑龙江省籍贯政治面貌党员入学时间2014.9双城市申请学位类别理学硕士论文答辩日期2017.5.28授予学位年月2017.6就业信息就业单就业单位就业单位性质联系方式（个人/办公）位地址学习（工作）经历2010年9月—2014年6月吉林农业大学生命科学学院生物工程专业2014年9月—2017年6月吉林农业大学生命科学学院微生物学专业攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署名发表情况题目刊物名称（级别）署名单位次序(刊出时间/录Characterizationof吉林农业发表学术论文rickettsiaeinticksinSCI第一2016.09大学northeasternChinaThefirstmolecularevidenceofseverefeverwith吉林农业thrombocytopeniaSCI第一2016.10大学syndromevirusinticksinJilin,NortheasternChina57 Moleculardetectionandcharacterizationofzoonoticand吉林农业SCI第三2016.11veterinarypathogens大学inticksfromnortheasternChinaPrevalenceandburdenofToxoplasmagondiiinfectionin军事兽医SCI第三2017.4HIV-infectedpeople:研究所asystematicreviewandmeta-analysisTargeteddisruptionofCK1αin军事兽医ToxoplasmagondiiSCI第五2016.8研究所increasesacutevirulenceinmice获署名名称成果级别署名单位发表情况奖次序项目及专利58 致谢转眼，三年的硕士时光即将结束，在这三年里，我收获颇丰，不仅实验技能有所提高，个人的视野，知识储备也收获较大。感谢父母对我的疼爱和为我的付出，是你们用汗水供我读书，深造。感谢我生命中遇到的所有人，是你们教会我成长。首先我要感谢我的三个导师吉林农业大学教授魏峰教授、军事兽医研究所刘全研究员和王述超助理研究员。在这三年里，魏老师时刻关心我们，时常询问我们的学习情况和生活情况。刘老师在实验中给我很多帮助，每次出现他都会给出他的意见，这让我少走了好多弯路，大大提高了我的实验进度。王老师在实验中给了我许多指导，帮助我顺利完成实验。其次，我要感谢王泽东师兄、王巍师姐、李筱鑫师姐、孙雪霏师姐、张晓卓师姐在实验上给我的指导。感谢我的同窗马宏宇、李忠宇、王英贺、祁雪的帮助与鼓励。感谢李爽师妹、张力师妹的帮助。感谢内蒙古林业总医院为提供的优良团队和实验环境，感谢内蒙古林业总医院王波主任、吕小龙医生、王胜男医生的帮助。感谢所有帮助我、关爱我的人，愿你们平安、幸福。59