转移、非转移肝癌病人血清SNA、PHA-E亲和型糖蛋白质组学研究

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密级：学号：广面科大硕士学位论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究伍惠玲一—指导教师姓名李山教授专业名称临床检验诊断学申请学位类型科学学位二—二年五月 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含未获得(注：如没有其他需要特别声明的,本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：叫年月曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解广西医科大学有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权广西医科大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：、导师签字签字日期：年月日签字日期：年月卞曰 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究指导小组成员名单李山教授西医科大学秦雪教授西医科大学刘银坤教授复旦大学中山医院肝癌研究所孙淳博士复旦大学中山医院肝癌研究所 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究目录中英文缩略词对照表中文摘要弓第一部分转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库的构建及生物信息学分析前言材料与方法参考文献第二部分转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库的构建及生物信息学分析前言材料与方法结果龍参考文献 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究雜在校期间发表论文及参与课题致谢 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究中英文縮略词对照表原发性肝癌肝细胞性肝癌乙月青丙烯酰胺过硫酸按乙酰葡糖胺辣根过氧化物酶千道尔顿,液相色谱,质谱聚丙烯酰胺凝胶电泳红腰果型植物血凝素聚偏二氟乙烯强阳离子交换色谱十二烷基硫酸钠,十二垸基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳盐酸缓冲液,加入吐温的盐酸缓冲液四甲基乙二胺三轻甲基氨基甲烧,三氟乙酸 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究,半乳糖,乙酰半乳糖胺葡糖醛酸乙酰葡糖胺唾液酸接骨木凝集素 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学硏究摘要第一部分转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库的构建及生物信息学分析目的：运用糖蛋白质组学技术方法,初步建立转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库。方法：收集肝癌患者血清,根据分期标准,按照是否有血管侵犯、远处转移、局部浸润,分为肝癌非转移组例(无血管侵袭,无远处转移,无局部浸润),肝癌转移组例(有血管侵袭,或有远处转移,或有局部浸润),各分三组,非转移组每例混合,转移组每例混合。选用接骨木凝集素(通过固相亲和层析富集糖蛋白,进而应用液相色谱串耳关质谱技术,对转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白进行糖蛋白质组学研究,构建转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库并进行生物信息学分析,筛查与肝癌转移相关的差异糖蛋白。结果：非转移组经质谱鉴定共获亲和型糖蛋白个,转移组亲和型糖蛋白获个,差异表达的转移相关糖蛋白个。经生物信息学分析软件和糖基化位点预测发现个蛋白具有糖基化位点个蛋白具有糖基化位点和糖基化位点均有的糖蛋白有种。非转移肝癌病人亲和型糖蛋白生物进程分类中参与代谢通路及参与应激的蛋白分别占和,以定位在细胞外区为最多,分子功能分类中具有结合特性和催化活性的蛋白分别占亲和型糖蛋白的和。转移肝癌病人亲和型糖蛋白生物进程分类中参与代谢通路及与参与应 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究激的蛋白分别占和,以定位在细胞外区为最多,分子功能分类中具有结合特性和催化活性的蛋白分别占亲和型糖蛋白的和。结论：凝集素亲和层析结合质谱鉴定是一种高通量的检测方法,亲和型糖蛋白表达数据库的构建为后续研究奠定了基础。第二部分转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库的构建及生物信息学分析目的：运用糖蛋白质组学技术方法,初步建立转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库。方法：收集肝癌患者血清,根据分期标准,按照是否有血管侵犯、远处转移、局部浸润,分为肝癌非转移组例(无血管侵袭,无远处转移,无局部浸润),肝癌转移组例(有血管侵袭,或有远处转移,或有局部浸润),各分三组,非转移组每例混合,转移组每例混合。选用红腰果型植物血凝素(通过固相亲和层析富集糖蛋白,进而应用技术,对转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白进行糖蛋白质组学研究,构建转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白质表达数据库并进行生物信息学分析,筛查与肝癌转移相关的差异糖蛋白。结果：非转移组经质谱鉴定共获亲和型糖蛋白个,转移组亲和型糖蛋白获个,差异表达的转移相关糖蛋白个。经生物信息学分析软件和糖基化位点预测发现个蛋白具有糖基化位点,个蛋白具有糖基化位点,和糖基化位点均有的糖蛋白有种。非转移肝癌病人结合型糖蛋白生物进程分类中参与代谢通路及参与应激的蛋白分别占和,亲和型糖蛋白以定位在细胞外区为最多,分子功能分类中具有结合特性的蛋白占结合型糖蛋白的 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究。转移肝癌病人亲和型糖蛋白生物进程分类中参与代谢通路及参与应激的蛋白分别占和,亲和型糖蛋白以定位在细胞外区为最多,分子功能分类中具有结合特性的蛋白占亲和型糖蛋白的。结论：凝集素亲和层析结合质谱鉴定是一种高通量的检测方法,亲和型糖蛋白表达数据库的构建为后续研究奠定了基础。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究创新点本研究首次建立非转移、转移肝癌病人、亲和型糖蛋白表达数据库。通过凝集素固相亲和层析、应用液相色谱串联质谱技术,蹄查出非转移、转移肝癌组转移相关差异表达的糖蛋白共个。通过凝集素固相亲和层析、应用技术,筛查出非转移、转移肝癌组转移相关差异表达的糖蛋白共个。潜在应用价值本研究建立了非转移、转移肝癌病人、亲和型糖蛋白表达数据库,并筛查出一系列肝癌转移相关糖蛋白,可能成为肝癌潜在的转移预测新指标和靶向治疗新位点,并且为肝癌转移相关糖蛋白的研究奠定了良好基础。关键词：糖蛋白质组学：接骨木凝集素；红腰果型植物血凝素；凝集素亲和层析；质谱；生物信息学；数据库 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究【】 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究引言原发性肝癌(是严重危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一,以上为肝细胞癌(。其恶性程度高,病情进展快,预后差。流行病学调查研究显示：全球肝癌发病率在各种癌症中位列第八,病死率排第四—,每年约有万人因肝癌致死,我国是慢性病毒性肝炎的高发国家,我国肝癌的发病率和病死率均高于世界平均水平,是我国第二位的癌症杀手。肝癌的治疗手段最好的方式是手术治疗,但是即使能够进行早期切除,年内仍有半数患者转移复发；近年来兴起的用于肝癌的局部治疗(如射频等),其转移复发的几率比手术治疗要高,且疗效不如后者；即使进行肝移植,肝癌的转移复发仍然是临床上面临的首要问题,因此针对肝癌转移复发这一难题,人们正积极地从根本上研究肝癌转移复发的机理,寻找可能成为肝癌潜在的转移预测新指标和靶向治疗新位点,进一步提高肝癌的治疗效果。近年来,蛋白质翻译后修饰的变化日益成为癌转移复发研究的热点,如肝癌、乳腺癌、卵巢癌等—气糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,大约以上的蛋白质存在糖基化现象,。糖蛋白的糖链部分影响着蛋白质的折叠、稳定、运输和定位,并参与调节各种生命活动,如信号转导、细胞转化、识别、粘连和运动等。在许多疾病尤其是肿瘤的进程中,糖蛋白的糖链数量和结构都可能发生变化,从而导致糖蛋白及其所在细胞的功能障碍,甚至出现恶性变—。糖链数量与结构的变化与疾病之间的紧密联系,尤其是与恶性肿瘤的关系,开拓了糖组学在医学研究领域的应用。糖组学是在特定生理或病理状态下对糖链位点、组成、结构及功能进行研究,研究内容主要分为：结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学。糖链大致可以分为四类连接的糖链,连接的糖链,连接的糖链,与糖磷脂锚(相连的糖链。凝集素是生物体内的一类能与特 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究异糖链可逆结合、不修饰糖、不具备酶催化活性的糖结合蛋白。对聚糖有特异性识别能力,其优点是高通量、操作简单、结合范围广、可区分糖链同分异构体等。凝集素相关的糖链分析技术包括：凝集素亲和层析技术、凝集素印迹、凝集素芯片技术等。目前,关于肝癌转移方面的临床蛋白质组学研究尚相对缺乏,尤其是糖组学方面的研究,且主要集中在细胞模型。糖基化异常如能体现在血清、尿液等体液中,则能被用来诊断肿瘤或鉴别良、恶性疾病。因此,寻找体液中具有肿瘤特征性的糖蛋白,开拓了一个糖链标志诊断肿瘤的新领域。目前用于临床诊断的标志物很多都是糖蛋白,包括甲胎蛋白、酸性糖蛋白、抗胰蛋白酶、谷氨酸转肽酶、结合珠蛋白、转铁蛋白、高尔基体蛋白。其中糖链异质体测定是迄今临床应用糖链标志诊断肿瘤最为成功的例子。扁豆凝集素结合型甲胎蛋白(相对于甲胎蛋白(其诊断灵敏度由原来的提高到特异性从提高到以上—。年美国确定成为肝癌诊断的标志物,这是目前为止唯一承认的肝癌诊断标志物,但肝癌病人的血清糖蛋白上糖链结构可发生许多变化,比如：核心岩藻糖增多、乙酰氨基乳糖重复顺序出现、平分型增加、天线数增加、偏二天线出现等。仅仅单个指标是对于准确预测肝癌的转移和复发是远远不够的,采用多个指标进行联合检测将是今后肝癌转移预测的研究方向。因此,寻找更多诊断敏感性和特异性高的肝癌标志物是一项任重而道远的任务。本研究选择的是临床最容易获取的标本一血清进行糖组学研究,应用凝集素亲和层析技术富集非转移性肝癌和转移性肝癌患者血清糖蛋白,进而应用液相色谱串耳关质谱技术,对转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白进行糖蛋白质组学研究,构建转移、非转移肝癌病人血清、 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究亲和型糖蛋白表达数据库并进行生物信息学分析,筛查与肝癌转移相关的差异糖蛋白。研究证明,非转移组亲和型糖蛋白经质谱鉴定共获个糖蛋白,转移组亲和型糖蛋白获个,差异表达的转移相关糖蛋白个。非转移组亲和型糖蛋白经质谱鉴定共获个糖蛋白,转移组亲和型糖蛋白获个,差异表达的转移相关糖蛋白个。本研究建立了非转移、转移肝癌病人、亲和型糖蛋白表达数据库,并筛査出一系列转移相关的糖蛋白,可能作为潜在的转移预测新指标和治疗新靶点,并且为肝癌转移相关糖标记的研究奠定了良好基础。参考文献卢雯静,正常人肝组织及肝癌相关亲和型糖蛋白质组学研究,复旦大学汤钊猷,开展肝癌转移复发研究的意义与途径中华普通外科杂志,第页 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究,陈巧佩,转移、非转移肝癌病人血清糖蛋白聚糖组的研究,广西医科大学王存,康晓楠与刘银坤,糖蛋白质组学技术在肿瘤研究中的应用中国临床医学,第页讓靡剑,糖蛋白质组学分析肝癌相关血清糖蛋白岩藻糖基化异常,第二军医大学,, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究【英】著,王恒樑等译蛋白质组学原理北京化学工业出版社,殷正丰,甲胎蛋白异质体作为肝癌标志物的临床应用实用肿瘤杂志,第页, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究,,, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究第一部分转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库的构建及生物信息学分析前言蛋白质糖基化是翻译后修饰最重要的一种方式,其糖链部分影响着蛋白质的折叠、稳定、运输和定位,并参与调节各种生命活动,如信号转导、细胞转化、识别、粘连和运动等。蛋白质糖基化程度及糖链结构的异常变化常是癌症及其他疾病发生、发展和转移的标志。现阶段关于肝癌转移方面的临床蛋白质组学研究证据尚相对缺乏,尤其是糖组学方面的研究,且主要集中在细胞模型,因此选择临床最易获取的标本血清进行肝癌转移的糖蛋白质组学研究,寻找糖链结构特征性改变的糖蛋白,对肝癌转移预测具有十分重要的意义。凝集素是一种能够与特异性糖链结合的蛋白,不同于其他糖纯化、分离、鉴定技术,凝集素能够识别各种不同构型的聚糖,可在不破坏糖链的前提下使糖蛋白得到鉴定。本次工作中,选用接骨木凝集素(通过固相亲和层析富集糖蛋白,进而应用液相色谱串联质谱(技术,对转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白进行蛋白质组学研究,构建转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库并进行生物信息学分析,筛査与肝癌转移相关的差异糖蛋白,为后续工作奠定基础。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究材料与方法一、材标本：所用血清标本来自于广西医科大学第一附属医院肝胆外科住院病人。公司产品。蛋白浓度测试公司产品。蛋白酶抑制剂瑞士公司广品。,用浓调节至,双蒸水定容至用浓调节至,双蒸水定容至于°中储存。平衡缓冲液：配制。碳酸氢铵溶液：(碳酸氢铵粉末,溶解于超纯水中。溶液：碳酸氢铵粉末,溶解于超纯水中。碘乙酰胺溶液：碳酸氧铵粉末,溶解于超纯水中,碘乙酞胺为公司产品。—甘氨酸电泳缓冲液：,甘氨酸,,双蒸水定容至室温保存,用时稀释倍,为上海国药集团化学试剂公司进口分装试剂。过硫酸铵、四甲基乙二胺为公司产乙腈,公司产品。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究测序级胰蛋白酶,公司产品。计,梅特勒托利多仪器上海有限公司产品。电子天平,北京赛多利斯天平有限公司产品。精密天平,德国公司产品,型。恒温离心机,美国公司产品。垂直电泳槽包括电泳槽和电泳仪)、电泳仪,公司产品。图像分析软件,公司产品。型脱色摇床,江苏海门市麒麟医用仪器厂制造。漩涡混合器,上海精科实业有限公司制造。制冰机,意大利公司产品超纯水系统,美国公司产品。三氟乙酸(,色谱纯),公司产品。型混合器,上海双向西巴斯科技发展有限公司。恒温磁力搅拌器,上海亚荣生化仪器厂。祸旋混合器,丄产品。超低温冰箱,公司。二、方法临床病例的选择标准病例选择按照以下标准：①入院确诊为肝癌。②所有血清均做肝功能、、、等生化免疫指标检测。③所有肝癌患者均经手术和病理学检査,有明确的临床资料(包括肿瘤大小,肿瘤数目,是否有血管侵犯,包膜是否完整,是否有远处转移,有无局部浸润或卫星灶,以及超或结果等)。④采取患者的血清标本,均经患者志愿签署知情同意书。分组信息肝癌转移组标本例、肝癌非转移组标本例,为广西医科大学第 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究一附属医院肝胆外科住院患者,根据是否有血管侵犯、远处转移、局部浸润,分为肝癌非转移组例(无血管侵袭,无远处转移,无局部浸润),肝癌转移组例(有血管侵袭,或有远处转移,或有局部浸润)(见表,非转移组每例混合,转移组每例混合。表人血清样本的临床病理资料非转移组例数转移组例数年龄性别男女分期】肿瘤大小肿瘤个数单个多个凝集素亲和层析取用平衡缓冲液清洗次,次。离心后弃上清(低速转分钟),取平衡缓冲液、血清、蛋白酶抑制剂,分别加入管中。将管置于 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究混合器上于°下旋转过夜。第二天取出后将混合器置于室温下平衡半小时,然后用平衡缓冲液清洗次,次。离心后弃上清,加入乙酸(把所有的珠子吸出转移至干净的管,再加入的蛋白上样缓冲液,于：下煮沸分钟,待用。质谱检测蛋白样品前处理电泳分离将凝集素亲和后的蛋白样品,用的分离胶进行电泳分离。分离胶浓缩胶的配制按照表的配方,配制聚丙烯酰胺分离胶溶液,准备好两块玻璃板,将混匀后的分离胶溶液沿玻璃板的边缘缓慢加入,注意避免气泡产生,轻轻加入超纯水覆盖以压平液面,将其置于室温下分钟聚合。待聚合后,充分弃去超纯水,按照表配方,配制聚丙録酰胺浓缩胶溶液,混匀后加在聚合好的分离胶上,插入孔的梳子,室温下静置分钟聚合。蛋白质电泳上样量为：亲和后的上清液,并加入蛋白作为分子量标准。电泳先在垂直电泳仪以恒压的方式进行,调节电压为,待到达分离胶界面时,电压调至,继续电泳直至溴酚蓝到分离胶底部。表聚丙烯酰胺分离胶配方分离胶( 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究表聚丙唏酰胺浓缩胶配方缩胶(电泳结束后,将分离胶切割后进行考马斯亮蓝染色分钟,超纯水脱色至背景较浅后用扫描仪扫描。割下目的条带,浸泡在少量超纯水中,°保存。胶内酶解清洗和脱色将蛋白条带从凝胶切下,并切成小颗粒约置于离心管内。加入碳酸氢铵溶液乙腈振荡脱色将溶液吸出舍弃,重复次(至蓝色完全退尽为止),再加入乙腈振荡分钟,将溶液吸出舍弃,重复次,直至胶粒变白变硬,即胶内的染料已经被洗干净。二硫键还原和浣基化：加入的碳酸氢铰溶液,于°反应以还原二硫键为半胱氨酸。冷却至室温后将溶液吸出舍弃,加入约同体积的碘乙酰胺碳酸氢铵溶液。室温黑暗处放置,对半胱氨酸进行烧基化。反应结束后将碘乙酰胺溶液吸出舍弃,加入碳酸氢铵溶液振荡清洗。洗液吸出舍弃。加入碳酸氢铵溶液乙腈对胶粒脱水片亥,溶液吸出舍弃,再加入碳酸氢铵溶液振荡清洗。洗液吸出舍弃。脱水干燥：加入乙腈在振荡仪上振荡至凝胶变白变硬。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究然后将乙腈吸出舍弃。酶液泡胀：酶液用碳酸氢铵溶液配制,配制浓度为配好的酶液应立即置于冰上,防止活性减低。每管中加入的酶液以刚刚泡过凝胶粒为宜,然后置于°至凝胶粒完全泡胀。酶解：置于振荡保温。提取：凝胶用三氟乙酸(乙腈超声提取次,每次。合并提取液。浓缩：将装有提取液的管置于旋转浓缩仪中,抽干,于下保存。鉴定分析液相系统：公司,流动相乙腈,甲酸的水溶液；流动相：乙腈,甲酸的水溶液,所有溶液均为级。捕集柱：公司(分析柱：公司,捕集流速,捕集时间,分析流速分析时间,色谱柱温度°模式进样,进样体积。梯度洗脱程序：时间流速流动相八％流动相质谱系统：公司 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究离子源公司),喷雾电压质谱扫描时间；实验模式为数据依赖(及动态排除(扫描范围—级扫描使用分辨率设定为及二级扫描使用在谱图中选取强度最强的个离子的单一同位素作为母离子进行单电荷排除,不作为母离子。秒时间内重复做过两次串级的离子信号,在接下来的秒的时间内将不再会进行串级实验(即进行动态排除)。质谱数据由软件(版本为采集并处理。数据库检索：实验数据使用分析软件检索,数据库为人种属数据库。为了减少假阳性结果,在该数据库中增加一个含有所有蛋白反转序列的诱饵数据库。搜索参数设置如下：胰蛋白醇全酶切方式,最大漏切为。固定修饰为半胱氨酸的脲甲基化,可变修饰为蛋白端乙酰化,肽段的甲硫氨酸氧化。单一同位素模式,肽段质量误差,碎片离子质量误差。为保证实验结果蛋白置信度大于所有肽段的离子得分均选择大于。生物信息学分析利用和软件对质谱鉴定的蛋白质进行糖基化位点、糖基化位点预测,认为具有糖基化位点；再通过其唯一序号在数据库中检索,按的分类原则功能分类后作分类条图；搜索和数据库对鉴定出的蛋白进行功能分类并构建蛋白蛋白相互作用网络图。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究结果转移、非转移肝癌病人血清凝集素亲和层析分析应用亲和层析方法分离和富集转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白质,为建立转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白质数据库奠定基础。图显示人血清总蛋白中绝大多数非糖蛋白被去除,亲和型糖蛋白得到了富集。■―—；图转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白与总蛋白电泳图转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库的构建和生物信息学分析转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库的构建提取电泳凝胶上的所有蛋白质条带,进行质谱分析和数据库进行串联质谱(检索,去冗余后筛选出非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白个(表,转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白个(表。图示某一代表性点的一级图(图、 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究二级质谱图图和检索碎片离子匹配图图,数据经检索后共同匹配到结合蛋白,蛋白得分达。表质谱鉴定出的非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白编号蛋白名称蛋白得分等电点 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究糖基化位点,糖基化位点 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究表质谱鉴定出的转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白编号蛋白名称蛋白得分等电点 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究,―,,：…,,…八一,… 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究】,,：：：―：：：。■,。小丄,, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究【：一：―,,■,；：丄諷瞧山以￡,,、图点的质谱鉴定图一级图二级质谱图检索碎片离子匹配图 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究转移、非转移亲和型糖基化蛋白质生物信息学分析将实际鉴定出的非转移肝癌病人亲和型种糖蛋白和转移肝癌病人亲和型种糖蛋白利用和软件进行糖基化位点预测,将总糖基化位点个数的蛋白列表如下表、表。发现有种蛋白仅具有糖基化位点,有种仅具有糖基化位点。和糖基化位点均有的糖蛋白有种。图、、为的糖基化位点预测图。非转移肝癌病人亲和型糖蛋白按照功能三种分类方式绘图图,。生物进程分类中参与代谢通路及参与应激的蛋白分别占和,亲和型糖蛋白以定位在细胞外区为最多,分子功能分类中具有结合特性和催化活性的蛋白分别占亲和型糖蛋白的和。转移肝癌病人亲和型糖蛋白按照功能三种分类方式绘图图,。生物进程分类中参与代谢通路及参与应激的蛋白分别占和,亲和型糖蛋白以定位在细胞外区为最多,分子功能分类中具有结合特性和催化活性的蛋白分别占结合型糖蛋白的和。图可见非转移肝癌病人所鉴定出来的亲和型糖蛋白共形成以、、、抗凝血酶载脂蛋白、簇连蛋白(等为节点的蛋白作用网络,主要参与了四种生物学功能途径：补体系统、血液凝固调节系统、血脂代谢和免疫防御系统。图可见转移肝癌病人所鉴定出来的亲和型糖蛋白共形成以、、抗凝血酶富含组氨酸糖蛋白、凝血酶原(、载脂蛋白、簇连蛋白(等为节点的蛋白作用网络,主要参与了四种生物学功能途径：补体系统、血液凝固调节系统、血脂代谢和免疫防御系统 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究■■■■■■■,■『,■,■遍■■■■■圍圍》■■■■■,,,,,■,■■■■,,■■■■■■■■■■■■曙耀— 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究：―■°￡图软件预测点氨基酸序列的连接糖基化位点潜在的连接糖基化位点；、潜在位点糖基化及其程度判断￡ 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究：「：：图非转移肝癌病人亲和型糖蛋白分类图生物进程细胞定位分子功能 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究—―【±■ 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究图转移肝癌病人亲和型糖蛋白分类图生物进程细胞定位分子功能 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究,：■、！養,識。图非转移肝癌病人亲和型糖蛋白之间作用图 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究―,翁,譽■『—。。？、(——翁翁图转移肝癌病人亲和型糖蛋白之间作用图 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究肝癌非转移组、转移组差异糖蛋白质鉴定结果经质谱筛选鉴定,非转移组、转移组肝癌转移相关差异亲和型糖蛋白质共有个,见表,表。表非转移组表达而转移组中不表达的差异糖蛋白表转移组表达而非转移组中不表达的差异糖蛋白——— 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究—— 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究讨论随着人类肝脏蛋白质组计划的启动,肝脏糖蛋白质组学逐渐成为国内外的研究焦点。糖蛋白质组学旨在建立研究蛋白质糖基化修饰谱的共性平台技术,从宏观上了解糖蛋白糖基化修饰的规律,从中寻找有重要生物功能的糖蛋白；其研究重点为：编码糖蛋白的基因,糖基化的实际位点,聚糖结构,糖基化的作用。然而,由于现有的技术还很难进行糖链结构的测定和化学合成,故蛋白质糖链的结构和功能研究受到极大的限制。迄今为止,国内外尚未出现系统可靠的研究蛋白质糖基化修饰的方法。现有的糖蛋白组学研究技术主要包括亲和层析,高效液相色普、质谱、芯片等。凝集素亲和柱层析是分离糖链特有的手段之一,现在固定化凝集素亲和层析已被广泛用于制备和纯化糖蛋白。本实验选用的是一种唾液酸糖结合物凝集素,能特异识别结合型唾液酸(见图。亲和型糖蛋白在多种疾病的发生发展过程中均产生不同程度的变化,在多数恶性肿瘤中,如：肝癌、胆囊癌等,亲和型糖蛋白表达上调气因此,建立肝癌不同恶性程度下亲和型糖蛋白数据库对我国这样一个肝炎,肝硬化,肝癌的高发国家是具有重要意义的。□图凝集素结合特异性(摘自《》)和单糖信号表示图本研究首先用进行固相凝集素亲和层析来分离纯化亲和型糖 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究蛋白。层析后的蛋白利用质谱鉴定技术,采用的模式进行搜库,使获取的质谱数据更加合理和科学。最后,我们进一步通过生物信息学分析了目标蛋白在细胞中的定位,它们主要存在于细胞外区,具有众多分子功能,主要包括催化活性、调控酶活性、结合活性、分子伴侣活性等,此外,这些糖蛋白还参与重要的生理过程,包括代谢、细胞交流、细胞增殖分化、细胞粘附运动等,如：众多酶类参与代谢过程,由于肝脏是物质代谢及解毒的主要器官,富含众多代谢酶类是非常合理的。唾液酸结构是很多糖蛋白或糖脂的末端组成结构,尤其是高等动物,在体液和细胞表面它们是细胞和分子相互作用的重要调节因子,具有双重作用,既可以掩盖分子识别部位,也可以作为识别的结构域。的研究表明唾液酸结构能够诱发炎症反应,使病原体能够逃避宿主免疫防御系统,其多聚体结构还有调节胚胎发育和神经元生长的功能,。唾液酸和癌症的关系见于很多报道,等在肺癌、肝癌、前列腺癌的研究中发现,癌细胞相对正常细胞表面高表达唾液酸结构,该研究提示唾液酸结构可以作为癌症早诊的指标。通常细胞表面唾液酸结构的增加是和细胞的转移潜能相关的,然而也有研究表明唾液酸化的丢失和癌症相关,,等在星形细胞瘤的研究中发现中枢神经系统异常表达蛋白的唾液酸结构缺失,其具体机制有待进一歩研究。本实验尝试建立相对稳定、标准化的高通量糖蛋白质组学共性技术平台,并以此为基础,初步建立非转移和转移肝癌病人亲和型糖蛋白表达数据库,为研究不同恶性程度下肝癌糖基化修饰谱奠定了基础,推动了后续的肝脏疾病比较糖蛋白质组学研究。但本研究亦有许多地方需要改进,首先利用凝集素亲和层析技术特异性分离亲和型蛋白,虽然其相对于其他应用凝集素分析糖链结构的方法如：凝集素亲和印迹、凝集素原位组化等具有无可比拟的优点：能够获得足够量的某一类糖链结构的糖蛋白,以利于后续的研究分析,但其也不可避免的存在些非特异性结合,即使通 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究过改变洗脱条件可以获得较好的分辨率,但依然不能完全排除非特异性结合某些蛋白,尽管其在提取组份中只是微量存在,对本数据库的建立不会产生大的影响,但从严谨的角度看应完全排除非亲和型糖蛋白的影响。本研究中利用生物信息学对鉴定的糖蛋白进行糖基化位点预测分析,从某种程度上可视为一种验证手段。预测分析发现,种蛋白不含任何糖基化位点,故本数据库未将其纳入。但糖基化位点的预测分析只是简单的验证,精确验证需要质谱技术鉴定糖基化位点以及聚糖结构这将更利于肝脏疾病比较糖蛋白质组学的研究。参考文献 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究第二部分转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库的构建及生物信息学分析前言糖组学是对聚糖组成及其功能进行研究的一门新学科,主要研究糖和糖、糖和蛋白、糖和核酸的相互关系,。质谱技术、亲和层析技术、凝集素芯片技术等都已应用于蛋白质糖基化修饰的研究。其中质谱分析可以给出高度详细的聚糖结构信息。目前肝癌的糖蛋白质组学的研究对象大多数是比较正常肝组织与肝癌组织或者细胞系之间的糖蛋白上糖链结构的变化,本研究收集临床上最容易获取的标本血清,研究对象是比较非转移和转移肝癌病人糖蛋白上糖链结构的变化,对于探讨肝癌转移复发的机制具有极为重要的前瞻意义。本次工作中,选用红腰果型植物血凝素(通过固相亲和层析富集糖蛋白,进而应用液相色谱串联质谱技术,对转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白进行蛋白质组学研究,构建转移、非转移性肝癌病人血清亲和型糖蛋白表达数据库并进行生物信息学分析,篩查与肝癌转移相关的差异糖蛋白。材料与方法一、材料标本：所用血清标本来自于广西医科大学第一附属医院肝胆外科住院病人,临床病例选择标准、分组和临床病理资料同第一部分。公司产品。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究蛋白浓度测试公司产品。蛋白酶抑制剂瑞士公司口；,用浓调节至,双蒸水定容至用浓调节至,双蒸水定容至于°中储存。平衡缓冲液：配制。碳酸氢铵溶液：碳酸氢铵粉末,溶解于超纯水中。溶液：碳酸氢铵粉末,溶解于超纯水中。碘乙酰胺溶液：碳酸氧铵粉末,溶解于超纯水中,碘乙酞胺为公司产品。甘氨酸电泳缓冲液：,甘氨酸,双蒸水定容至室温保存,用时稀释倍,为上海国药集团化学试剂公司进口分装试剂。过硫酸铵、四甲基乙二胺为公司产乙腈,公司产品。测序级胰蛋白酶,公司产品。计,梅特勒托利多仪器上海有限公司产品。电子天平,北京赛多利斯天平有限公司产品。精密天平,德国公司产品,型。恒温离心机,美国公司产品。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究垂直电泳槽(包括电泳槽和电泳仪)、电泳仪,公司产品。图像分析软件,公司产品。型脱色摇床,江苏海门市麒麟医用仪器厂制造。漩涡混合器,上海精科实业有限公司制造。制冰机,意大利公司产品超纯水系统,美国公司产品。三氟乙酸(,色谱纯),公司产品。型混合器,上海双向西巴斯科技发展有限公司。恒温磁力搅拌器,上海亚荣生化仪器厂。祸旋混合器,丄产品。超低温冰箱,公司。二、方法凝集素亲和层析取用平衡缓冲液清洗次,次。离心后弃上清(低速转分钟),取平衡缓冲液、血清、蛋白酶抑制齐,分别加入管中。于°下将管置于混合器上旋转过夜。第二天取出后将混合器置于室温下平衡半小时,然后用平衡缓冲液清洗次,次。离心后弃上清,加入乙酸(把所有的珠子吸出转移至干净的管,再加入的蛋白上样缓冲液,于下煮沸分钟,待用。质谱检测蛋白样品前处理电泳分离将凝集素亲和后的蛋白样品,进行电泳分离。蛋白质电泳上样量为：亲和后的上清液,并加入蛋白作为分子量标准。电泳先在垂直电泳仪以恒压的方式进行,调节电压为,待到达分离胶 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究界面时,电压调至,继续电泳直至溴酚蓝到分离胶底部。电泳结束后,将分离胶进行考马斯亮蓝染色分钟,用扫描仪扫描。用超纯水脱色,至背景较浅。割下目的条带,浸泡在少量纯水中,°保存。胶内酶解清洗和脱色：将蛋白条带从凝胶切下,并切成小颗粒(约置于离心管内。加入碳酸氢铵溶液乙腈振荡脱色将溶液吸出舍弃,重复次(至蓝色完全退尽为止),再加入乙腈振荡分钟,将溶液吸出舍弃,重复次,直至胶粒变白变硬,即胶内的染料己经被洗干净。二硫键还原和烧基化：加入的碳酸氢铵溶液,为了还原二硫键为半胱氨酸,将该溶液置于°反应。取出后平衡冷却至室温,将上清溶液吸出舍弃,再加入约相同体积的碘乙酰胺碳酸氢铵溶液。于室温下避光放置,对半胱氨酸进行浣基化反应。反应结束后将碘乙酰胺溶液吸出舍弃,加入碳酸氧铵溶液在振荡仪上振荡。振荡液吸出舍弃。加入碳酸氢铵溶液乙腈对胶粒脱水约分钟,溶液吸出舍弃,再加入碳酸氢铵溶液进行振荡清洗洗液吸出舍弃。脱水干燥：加入乙腈在振荡仪上振荡至凝胶变白变硬。然后将乙腈吸出舍弃。酶液泡胀：酶液用碳酸氢铵溶液配制,配制浓度为。配好的酶液应立即置于冰上,防止活性减低。每管中加入的酶液以刚刚泡过凝胶粒为宜,然后置于°至凝胶粒完全泡胀。酶解：置于°振荡保温。提取：凝胶用三氟乙酸(乙腈超声提取次,每 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究次。合并提取液。浓缩：将装有提取液的管置于旋转浓缩仪中,抽干,于匸下保存。鉴定分析液木目系统：公司,流动相乙腈,甲酸的水溶液；流动相：乙腈,甲酸的水溶液,所有溶液均为级。捕集柱：公司(分析柱：公司,捕集流速,捕集时间,分析流速分析时间,色谱柱温度°模式进样,进样体积。梯度洗脱程序：时间流速流动相八％流动相质谱系统：公司离子源公司),喷雾电压质谱扫描时间；实验模式为数据依赖(及动态排除(扫描范围—级扫描使用分辨率设定为及二级扫描使用在谱图中选取强度最强的个离子的单一同位素作为母离子进行单电荷排除,不作为母离子。秒时间内重复做过两次串级的离子信号,在接下来的秒的时间内将不 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究再会进行串级实验(即进行动态排除)。质谱数据由软件(版本为采集并处理。数据库检索：实验数据使用分析软件检索,数据库为人种属数据库。为了减少假阳性结果,在该数据库中增加一个含有所有蛋白反转序列的诱饵数据库。搜索参数设置如下：胰蛋白酶全酶切方式,最大漏切为。固定修饰为半胱氨酸的脲甲基化可变修饰为蛋白端乙酰化,肽段的甲硫氨酸氧化。单一同位素模式,肽段质量误差,碎片离子质量误差。为保证实验结果蛋白置信度大于所有肽段的离子得分均选择大于。生物信息学分析利用和软件对质谱鉴定的蛋白质进行糖基化位点、糖基化位点预测,认为具有糖基化位点；再通过其唯一序号在数据库中检索,按的分类原则功能分类后利用软件作分类条图；搜索和数据库对鉴定出的蛋白进行功能分类并构建蛋白蛋白相互作用网络图。结果转移、非转移肝癌病人血清凝集素亲和层析分析应用亲和层析方法分离和浓缩转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白质,为建立转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖基化蛋白质数据库奠定基础。图显示人血清总蛋白中绝大多数非糖蛋白被去除,亲和型糖蛋白得到了富集。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究曜嶋。擎：血清总蛋白亲和斷液亲和层碰图转移、非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白与总蛋白电泳图转移、非转移肝癌病人血清凝集素亲和型糖蛋白表达数据库建立和生物信息学分析一提取电泳凝胶上的所有蛋白质条带,进行质谱分析和数据库进行串联质谱(检索,去冗余后筛选非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白个(表,转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白个(表。图示某一代表性点的一级图(图、二级质谱图(图和检索碎片离子匹配图(图：,数据经检索后共同匹配到微球蛋白,蛋白得分达。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究表质谱鉴定出的非转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白蛋白等电蛋白名称卜编号得分点 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究糖基化位点,糖基化位点 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究表质谱鉴定出的转移肝癌病人血清亲和型糖蛋白编―蛋白等电蛋白名称号得分点 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究：―,,―细,：,,￡：■■乂■,■工叽,塒：卿,聯一溯■、丄 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究；图点的质谱鉴定图一级图二级质谱图检索碎片离子匹配图转移、非转移亲和型糖基化蛋白质生物信息学分析将实际鉴定出的非转移肝癌病人亲和型种糖蛋白和转移肝癌病人亲和型种糖蛋白利用和软件进行糖基化位点预测,将总糖基化位点个数的蛋白列表如下表、表。发现有种蛋白仅具有糖基化位点,有种仅具有糖基化位点。和糖基化位点均有的糖蛋白有种。图、、为微球蛋白的糖基化位点预测图。非转移肝癌病人亲和型糖蛋白按照功能三种分类方式绘图图,。生物进程分类中参与代谢通路及与参与刺激应答相关的蛋白分别占和结合型总糖蛋白以定位在细胞外为最多,分子功能分类中具有结合特性的蛋白占结合型总糖蛋白的。转移肝癌病人亲和型糖蛋白按照功能三种分类方式绘图(图。生物进程分类中参 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究与代谢通路及与参与刺激应答相关的蛋白分别占和,结合型总糖蛋白以定位在细胞外为最多,分子功能分类中具有结合特性的蛋白占结合型总糖蛋白的。非转移、转移肝癌病人亲和型糖蛋白之间作用图见图,图。图可见非转移肝癌病人所鉴定出来的亲和型糖蛋白共形成以、血衆蛋白酶抑制因子、等为节点的蛋白作用网络,主要参与了三种生物学功能途径：补体系统、血液凝固调节系统、血脂代谢。图可见转移肝癌病人所鉴定出来的亲和型糖蛋白共形成以、胰蛋白酶抑制剂免疫球蛋白链区(、等为节点的蛋白作用网络,主要参与了三种生物学功能途径：补体系统、血液凝固调节系统、免疫防御系统。丽匪丽丽 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究：—―？：￡图软件预测点微球蛋白)氨基酸序列的连接糖基化位点微球蛋白潜在的连接糖基化位点；、潜在位点糖基化及其程度判断圍 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究、□■：屬瞿￡□图非转移肝癌病人亲和型糖蛋白分类图生物进程细胞定位分子功能 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究口：厂— 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究國■图转移肝癌病人亲和型糖蛋白分类图生物进程细胞定位分子功能 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究图非转移肝癌病人亲和型糖蛋白之间作用图 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究。尸。「―图转移肝癌病人亲和型糖蛋白之间作用图肝癌非转移组、转移组相关差异蛋白质谱鉴定结果经质谱筛选鉴定,肝癌非转移组、转移组相关差异亲和型糖蛋白共有个,见表,表。 硕士研究生论文转移、转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋质组学研究表非转移组表达而转移组中不表达的差异糖蛋白——— 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究表转移组表达而非转移组中不表达的差异糖蛋白——亲和型糖蛋白表达谱的比较非转移肝癌病人亲和型糖蛋白经鉴定共获个,转移肝癌病人亲和型糖蛋白共获个。非转移肝癌病人亲和型糖蛋白经鉴定共获个,转移肝癌病人亲和型糖蛋白共获个。比较非转移肝癌病人、亲和型糖蛋白表达谱,发现有个糖蛋白是两种凝集素均鉴定出来的,仅在非转移肝癌病人亲和组被鉴定出来的蛋白有个,仅在非转移肝癌病人亲和组被鉴定出来的蛋白有个。比较转移肝癌病人、亲和型糖蛋白表达谱,发现有个糖蛋 顷土研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究白是两种凝集素均鉴定出来的,仅在转移肝癌病人亲和组被鉴定出来的蛋白有个,仅在转移肝癌病人亲和组被鉴定出来的蛋白有个。说明,部分血清糖蛋白中存在、都能够识别的糖链结构,而相当一部分糖蛋白是不能够被同时鉴定出来的,因此分别建立、亲和型糖蛋白表达数据库是十分必要的。讨论继基因组学、蛋白质组学之后,糖组学作为一门新兴的学科正日益兴起。糖组学研究主要包括三个部分：结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学。其中结构糖组学的发展主要依赖于质谱技术,其缺陷在于较难区分糖异质体,而且只能逐个逐个进行分析,不能以高通量的方式提供糖的结构信息。结构糖组学还可理解为基于凝集素的聚糖谱,即通过凝集素亲和层析技术提取糖蛋白质的核心聚糖谱信息。凝集素是生物体内天然的能够特异结合糖链的糖结合蛋白,目前研究较多的凝集素主要是麦胚凝集素、刀豆凝集素(、扁豆凝集素(等。其相对于质谱技术最大的优势就是能够区分糖的异质体。生物信息学分析在糖蛋白质鉴定后分析中具有十分重要的作用。通过生物信息学分析,各种软件、数据库能够为糖蛋白质提供了众多的信息,如糖蛋白质的表达、细胞定位、生理过程、蛋白之间相互作用、蛋白加工和转移后的修饰等。目前在肝癌病程中发生的糖修饰改变有：天线数增加,如人肝癌和转铁蛋白乙酰氨基乳糖重复顺序出现或增加如人肝癌核心岩藻糖(增多如人肝癌等。然而现有的研究一般只是局限于一种或几种聚糖结构,没有人从整体的角度去研究癌变过程中聚糖表达谱的变化,更没有人建立癌症转移相关的聚糖表达。陈巧佩等用凝集素芯片结合凝集素印迹方法比较转移、非转移肝癌组间的血清蛋白聚糖凝 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究集素亲和谱,结果显示转移性肝癌血清糖蛋白对凝集素、、的亲和作用增强。在血清水平,等,对例患者、例肝硬化患者和名健康人的血清进行了蛋白质组分析,鉴定出种特异蛋白,包括种补体因子、结合蛋白和结合蛋白。等用蛋白质组技术对例的慢性肝病患者和例患者的血清蛋白进行了分析,发现有种血清蛋白在慢性肝病和肝癌患者中的表达有明显差异。在细胞水平,王念等,通过凝集素芯片比较正常肝细胞、非转移肝癌细胞、高转移肝癌细胞的细胞表面糖谱,寻找与肿瘤侵袭和转移相关的特征性糖链谱图,发现不同细胞系对凝集素的亲和作用存在明显差异。等分析了人肝癌细胞株的蛋白质表达图谱,并对个点进行了质谱分析,除了一些管家蛋白外,还检测到了可能与癌变有关的蛋白,如蛋白、膜联蛋白、抗增殖蛋白和硫氧还蛋白过氧化物酶。在组织水平,等用蛋白质组技术对例患者进行了分析,发现与正常肝组织相比肝癌组织中有个蛋白点表达上调,蛋白点表达下调,并用质谱对这个点进行了鉴定,认为这些变化的蛋白点可作为早期诊断的标志物和药物治疗的靶标。由此可见,糖蛋白质组学在探讨肝癌病程中蛋白变化方面是一个强有力的研究手段。红腰果型植物血凝素(分子量为,等电点为,含有个相同的亚基,具有很强的红细胞凝集能力,能特异性的识别平分型乙酰葡糖胺(、偏二天线糖链结构(见图。具有刺激外周血淋巴细胞合成和有丝分裂,促进免疫反应,使细胞凝聚,月中瘤细胞失活,以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究■〇图凝集素结合特异性(摘自(和单糖信号表示图。我们通过分析鉴定出了一系列亲和型的糖蛋白,按照蛋白的生物进程来分类,主要是以参与生理调节、应激、代谢反应的糖蛋白为主,按照细胞定位来分类,亲和型糖蛋白主要集中在细胞外区,细胞膜有少部分,细胞质和细胞核中相对较少。比较、亲和型糖蛋白表达谱,发现部分血清糖蛋白中存在、都能够识别的糖链结构,而相当一部分糖蛋白是不能够被同时鉴定出来的,因此分别建立、亲和型糖蛋白表达数据库是十分必要的。本研究有许多地方需要改进,(不能够完全排除非特异性反应。其次我们利用生物信息学的手段预测分析质谱鉴定的糖蛋白糖基化位点,只是简举的验证,精确验证需要依靠糖蛋白组学技术进行糖链结构、糖基化位点的鉴定,。相信随着高效率、高通量、高准确度和高精密度的糖蛋白质分析技术的不断发展,人们对糖蛋白在肿瘤转移复发中所起的重要作用将有更为深刻的认识。我们的研究结果为肝癌转移相关糖蛋白的研究奠定了良好基础。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究参考文献,陈巧佩,转移、非转移肝癌病人血清糖蛋白聚糖组的研究广西医科大学杨曦,王应雄与何俊琳,蛋白质组学及其在肝肿瘤研究中的应用中华现代妇产科学杂志,第页王念,基于凝集素芯片的不同转移潜能肝癌细胞膜蛋白糖谱比较生物化学与生物物理进展,第页王存,康晓楠与刘银坤,糖蛋白质组学技术在肿瘤研究中的应用中国临床医学,第页 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究卢雯静,正常人肝组织及肝癌相关亲和型糖蛋白质组学研究,复旦大学, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究综述肿瘤硏究中糖蛋白质组学技术的应用进展摘要：糖蛋白质组学作为蛋白质组学的一个重要分支,是目前蛋白质组学领域中的热点。本文就糖蛋白质的分类、糖组学的研究内容、技术进展和在肿瘤研究中的应用作一综述。关键词：肿瘤,糖蛋白质组学糖基化是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一。糖蛋白的糖链部分影响着蛋白质的折叠、稳定、运输和定位,并参与调节各种生命活动,如信号转导、细胞转化、识别、粘连和运动等。在许多疾病尤其是肿瘤的进程中,糖蛋白的糖链数量和结构都可能发生变化,从而导致糖蛋白及其所在细胞的功能障碍,甚至出现恶性变。糖蛋白质组学是对糖链组成及其功能研究的一门新学科,是基因组学的后续和延伸,具体研究内容包括糖与糖之间、糖与蛋白之间、糖与核酸之间的联系和相互作用,其主要研究对象为聚糖。本文就糖蛋白质的分类、糖组学的研究内容、技术进展和在肿瘤研究中的应用作一综述。糖蛋白质的分类糖蛋白是由一个或多个寡糖链通过不同连接方式与蛋白质部分的多肽骨架共价相连而成。糖链大致可以分为四类连接的糖链,连接的糖链,连接的糖链,与糖憐脂锚(相连的糖链,(连接的糖链均具有共同的五糖核心,根据其组成不同分为高甘露糖型、复杂型和杂合型。连接糖蛋白主要为血衆蛋白和分泌蛋白等,又称为血浆型糖蛋白。连接的糖链可延伸为多种不同核心结构的类型。糖链无固定结构 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究及核心,在黏液,免疫球蛋白等中广泛存在。(连接的糖链以键与肽链上的色氨酸残基相连。(糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白,蛋白质末端与细胞膜上相连,是细胞膜内磷脂与蛋白质之间的桥梁。糖蛋白质组学的研究内容糖蛋白质组学是在特定生理或病理状态下对糖链位点、组成、结构及功能进行研究,其关注的焦点是糖蛋白。研究内容主要分为：结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学。当前糖蛋白质组学研究策略主要集中于表达糖蛋白质组学和比较差异糖蛋白质组学：前者主要研究规模化糖蛋白质鉴定如表达谱或蛋白质修饰谱的建立；后者则以重要生命过程或人类重大疾病为对象,比较不同生理病理体系下糖蛋白质表达的差异,发现关键的调控分子或疾病相关蛋白标志物。糖蛋白质组学研究技术糖蛋白质组学研究的相关技术方法是以蛋白质组学技术为基础,并结合糖基和糖类的某些特点和特性对糖蛋白进行研究,如凝集素亲和层析、凝集素芯片技术,、前沿亲和层析技术、复合蛋白质组学技术等。凝集素是一种从植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白,因其能凝集红血球而命名,其能与特异糖链可逆结合、不修饰糖、不具备酶催化活性,对聚糖有特异性识别能力,其优点是高通量、操作简单、结合范围广、可区分糖链同分异构体等。凝集素对聚糖结构有交叉亲和性,比抗体具有更广的糖链结构结合范围。凝集素亲和技术现阶段对于糖蛋白或糖肽富集最常用的方法之一。凝集素亲和技术即利用某一凝集素特异结合糖基的特性,采取了糖基捕获法获得特异性的糖蛋白质,再联合蛋白质组技术对糖蛋白进行检测分析。由不同类型凝集素亲合柱组成的多凝集素亲合层析,法是其中较好的糖蛋白分离纯化方法,凝集素高 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究效液相层析上样量少、灵敏度高、重现性好、更加快速和自动化是目前首选的微量糖链分析技术。等利用、和木菠萝凝集素混合为多凝集素亲和柱的方法,此种凝集素混合后能结合大部分糖蛋白并发现去除血清中个高丰度蛋白后,血清中剩余的蛋白有为糖基化修饰蛋白。凝集素芯片凝集素芯片能对聚糖结构进行快速、高通量、高灵敏度的分析,由于蛋白质糖基化修饰的糖链复杂多样,所以构建大规模的糖基数据库成为芯片发展的难点之一。凝集素芯片分四类①已知聚糖结合特异性的凝集素分子固定于支撑物表面,再把荧光或生物素标记糖蛋白与芯片杂交,经芯片扫描仪扫描得到数据,并与凝集素的结合特异性进行比较分析,从而获得聚糖结构信息。常用的荧光染料不影响糖链与凝集素的亲和,如吲哚类菁染料。此外,也可用非标记样本杂交芯片,再用标记的抗体探针来探测凝集素结合的蛋白。②荧光标记凝集素探针固定在水凝胶芯片上,再用双分子荧光猝灭和恢复方法检测样本,而样本则无需标记。③反相凝集素点印迹芯片,该法先将样品糖蛋白结合于固相支持物表面,再通过凝集素检测支固相持物表面的糖蛋白来定义糖蛋白、细菌、哺乳动物细胞的糖结构。在该方法的基础上,还出现了一种三明治式的检测方法,先将聚糖抗体固定于支持物上,再将糖蛋白与之结合,最后用凝集素检测。④无需荧光标记即可使用的芯片：组的芯片无需荧光标记,直接用倒置光学显微镜观察细胞和凝集素的结合。前沿亲和层析技术前沿亲和色谱利用亲合层析技术定量分析两生物分子间的结合程度,获得生物亲和常数值。具有简单、经济、准确、可操作性强等优点。联合的检测方法可分为两类①间接检测：放射性同位素(检测,技术中 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究聚糖需用放射性示踪物质标记,如。荧光检测,使用技术分析氨基吡啶标记的聚糖,有助于提高色谱的分离效率和检测灵敏度。②直接检测：表面等离子共振(检测,无需标记物质、实时监测结合情况并得出动力学数据。复合蛋白质组学技术复合蛋白质组学技术是一种将糖蛋白和总蛋白染色相结合的技术,在双向电泳凝胶上直接显示糖蛋白及其糖基化情况,大大简化糖蛋白的分析。在用双向电泳技术(分析人乳腺癌标本中,使用植物血凝素(键合技术,比较了乳腺癌与正常对照及乳腺良性疾病的糖蛋白质组的差异,发现了多个可能有意义的糖蛋白。等°】通过对凝胶中糖蛋白和总蛋白的同时荧光染色技术,比较了阿尔茨海默病(患者与正常对照的的差异,发现了有较多糖蛋白存在不同的表达。糖蛋白质组学在肿瘤研究中的应用肝癌王念等通过凝集素芯片比较正常肝细胞、非转移肝癌细胞、高转移肝癌细胞的细胞表面糖谱,寻找与肿瘤侵袭和转移相关的特征性糖链谱图,发现不同细胞系对凝集素的亲和作用存在明显差异。等分析了人肝癌细胞株的蛋白质表达图谱,并对个点进行了质谱分析,除了一些管家蛋白外,还检测到了可能与癌变有关的蛋白,如蛋白、膜联蛋白、抗增殖蛋白和硫氧还蛋白过氧化物酶。肺癌等用凝集素、富集肺癌和正常组织中的糖蛋白,通过质谱鉴定出种差异蛋白,发现肺腺癌组织中糖蛋白的不同糖基化亚型是肺癌诊断、治疗和监测的潜在标志物。等用凝集素联 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究合的蛋白芯片富集例肺癌患者血清中的糖蛋白,经表面增强激光解析电离飞行时间质谱(分析发现在肺癌患者血清中载脂蛋白上乙酰神经氨酸残基丢失。该研究表明凝集素联合蛋白芯片技术能高通量富集并特异性吸附肿瘤相关异常糖蛋白。乳腺癌等对乳腺癌患者血清和正常个体血清样本进行检测,首先运用多种凝集素亲和层析富集糖蛋白,分离后进行质谱鉴定,随后通过蛋白芯片对质谱结果进行验证,发现糖蛋白、补体、转铁蛋白和抗胰蛋白酶等多种糖蛋白为乳腺癌潜在标志物。其他肿瘤等应用凝集素亲和层析联合分析卵巢癌组织和正常卵巢组织,发现某些糖蛋白发生肿瘤特异性糖基化改变。等首先采用凝集素、和富集正常人和胰腺癌患者血清中的唾液酸糖蛋白,随后通过质谱技术鉴定唾液酸化的糖蛋白及其糖基化位点,发现个唾液酸化的糖蛋白,其中蛋白酶抑制因子在胰腺癌患者血清中明显下调,「抗胰蛋白酶糖基化下调。存在的问题和展望糖蛋白质组学在实际应用中有很多问题有待解决,比如糖链结构分析在早期诊断中的研究不多；在方法学上有待改进等。但随着糖蛋白质组学的深入发展,质谱、高效液相层析、光谱学等技术为糖蛋白糖基化修饰与肿瘤关系的研究开拓出一片新天地,深入研究糖蛋白或糖链结构及作用机制对肿瘤的预防、诊断、治疗有重要的指导意义。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究参考文献,,【英】著,王恒樑等译蛋白质组学原理北京化学工业出版社,, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究,,,,,, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究,,, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究, 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究在校期间发表论文及参与课题一、在校期间发表的论文伍惠玲,秦雪,宁自觉,等急性白血病患者染色体核型分析,中国实验诊断学,,伍惠玲,陈智平,邓燕,等血清诊断胰腺癌的文献质量评价,重庆医学,罗世兴,秦雪,赵劲民,伍惠玲等,广西沿海汉族成年男性骨钙素临床参考值的建立和相关因素分析《中国实验诊断学》蔡豪斌,伍惠玲,陈志坚等,不同稀释液及稀释比例对高值稀释测定的影响,应用预防医学,：陈智平,伍惠玲,陈志坚等,透射和散射比浊法测定血清免疫球蛋白的比对分析,应用预防医学,：张原琪,李山,伍惠玲等,临床检验结果互认的影响因素,国际医药卫生导报,,二、在校期间参与的科研课题及申请的基金国家重点基础研究发展计划(计划)肝病发生发展中的蛋白质翻译后修饰及调控的定量蛋白质组学研究(。广西自然科学基金项目凝集素芯片对人肝炎、肝硬化、肝癌血清聚糖组的动态研究(。广西卫生厅课题《临床检验仪器及方法学比对分析》,课题基金号：。广西卫生厅课题《不同检测项目在疾病诊断的循证医学研究》,课题号：桂卫。年研究生创新课题荧光原位杂交技术(检测骨髓增生异常综合征分子细胞遗传学改变的应用研究(。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究三、在校期间参加的国内学术会议年全国临床免疫检验研讨会暨第六届全国临床免疫学术会议年检验科主任临床实验室管理和检验新进展学习班,南宁年临床检验方法学比对和形态学检验培训班,玉林年城乡对口支援临床检验技术标准培训班,南宁年国际检验医学学术研讨会,重庆年检验科主任临床实验室管理和检验新进展学习班,柳州 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究致谢经过三年研究生阶段的学习和研究,籍论文完成之际,我特向指导和帮助我的老师、同学、朋友及关心支持我的家人表示诚挚的谢意。首先要感谢我的导师李山教授,是她给予了我一个锻炼充实自己的好机会—前往复旦大学学习,这将是我人生中的一段永不忘怀的经历。李山教授丰富的实践经验、渊博的专业知识、务实忘我的工作作风、宽以待人的处世态度使我受益非浅,更让我备受感动的是在遇到生活难题时,他总是为学生考虑,给予我们的是慈父般的关怀和照顾。感谢上海复旦大学肝癌研究所副所长刘银坤教授、孙淳博士,他们悉心指导本课题的设计、实施、资料处理和论文撰写。教授们丰富的实践经验、务实忘我的工作作风、宽以待人的处世态度使我受益非浅。感谢复旦大学中山医院肝癌研究所的康晓楠老师、郭坤老师、孙璐老师、李岩老师、王存博士、杨国欢博士、张舒博士、孙海燕硕士、江凯硕士,感谢他们对我课题给予的支持和帮助。感谢医科大一附院检验系秦雪教授、莫武宁教授、林发全教授,教授们严谨的治学态度、渊博的专业知识、开阔的科学视野、敏捷清晰的研究思路都给我留下了不可磨灭的印象,他们将是我今后学习和工作上的榜样。感谢何亚妮、李海炜、刘岩、吕慧、黄珊、林丽文等同窗们在生活上和学习上对我真诚的鼓励和无私的帮助。感谢检验科全体老师在我读硕士期间对我学习、工作的支持。感谢我的家人,这么多年来,正是你们的支持和鼓励,才使我顺利地完成学业。正是你们的关心和默默的奉献,给我创造了优越的条件,使我在学习的道路上乐观向上、勇往直前。感谢在百忙之中抽时间审阅本论文的专家教授,感谢答辩委员会的各位老师和专家们对我论文提出的宝贵意见。 硕士研究生论文转移、非转移肝癌病人血清、亲和型糖蛋白质组学研究在此,谨向导师们表示崇高的敬意和衷心的感谢！祝恩师们身体健康,家庭幸福,桃李满天下！祝师兄师弟师姐师妹们前程似锦,事业有成！谨以此文献给所有关心爱护我的人。