结直肠癌转移差异分泌蛋白质组学研究

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1、浙江大学医学院博士学位论文结直肠癌转移差异分泌蛋白质组学研究姓名：薛花申请学位级别：博士专业：病理与病理生理学指导教师：来茂德20090401浙江大学博士学位论文中文摘要结直肠癌转移差异分泌蛋白质组学研究浙江大学医学院2006级博士研究生导师病理学与病理生理学薛花来茂德教授中文摘要结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤。2008年，美国结直肠癌的发病率和死亡率在男、女性中均列恶性肿瘤的第三位。数十年来，随着我国人民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率也呈逐年上升的趋势。虽然现代癌症研究和医疗技术不断发展，结直肠癌患者的预后并没有

2、明显改善。转移是影响结直肠癌患者治疗效果和导致死亡的主要原因。因此，研究转移发生过程中的关键分子，早期预测结直肠癌的转移潜能，是提高结直肠癌患者生存率的关键。目前医疗界公认，检测肿瘤标志物是实现肿瘤转移预测的最佳手段。二十余年以来，在分子生物学和免疫学检测技术不断发展的带动下，已有不少重要的肿．．瘤标志物如癌胚抗原、甲胎蛋白、前列腺特异性抗原等被开发应用。虽然这些肿瘤标志物已经广泛应用于临床诊断和病情监测。但遗憾的是，它们的敏感性和特异性却往往不尽人意。寻找更加敏感和特异的肿瘤标志物势在必行。在后基因组时代，逐渐发展成熟的蛋白质组学技术使得大规

3、模的肿瘤标志物筛选成为可能。但是，传统的组织蛋白质组学策略在应用于肿瘤标志物筛选方面存在缺陷。因为，理想的肿瘤标志物理应能够从血液或尿液中被无创性的方法检测出来，而通过组织蛋白质组学策略筛选得到的肿瘤相关分子却不一定能满足这II浙江大学博士学位论文中文摘要一基本要求。与之相对，近年来兴起的血蛋白质组学策略更加诱人，因为其可以通过对血中蛋白表达谱的比较而直接获取肿瘤相关的血清标志物。不过，该策略却有其难以逾越的技术障碍。这是因为，血液的成份非常复杂，其中大量高丰度蛋白的存在会对其它重要蛋白产生致命的掩盖效应，从而大大降低血蛋白质组学筛选的效能。所

4、以，现在越来越多的研究者开始关注一个全新的领域一肿瘤分泌蛋白质组学。分泌蛋白质组这一概念最早是由Tjalsma等于2000年在对枯草杆菌分泌蛋白的研究中提出的。从广义上说，分泌蛋白质组是指细胞、组织或器官释放到胞外的全部蛋白质，既包括由经典的蛋白分泌途径所分泌的蛋白质，也包括非经典分泌性蛋白质，还包括通过胞外体(exosome)分泌的蛋白质。肿瘤的形成是一个长期的多因素参与的复杂过程，在该过程中，肿瘤细胞能够分泌多种蛋白质；这些蛋白质不仅能够以自分泌、旁分泌的形式调控肿瘤的发生和发展，还可以进入血液、尿液等体液中，易于被临床无创性的方法检测出来

5、。所以，肿瘤分泌蛋白质组学研究为肿瘤标志物的开发开辟了一条崭新、充满希望的道路。由于起步较晚，有关肿瘤分泌蛋白质组学的研究目前还为数不多，但取得的成果已经足以证明其是筛选肿瘤标志物的有效方法。迄今为止，与结直肠癌转移相关的分泌蛋白质组学研究尚未有报导。在本研究中，我们利用非标记定量鸟枪法蛋白质组学技术，分析比较了具有相同遗传背景、不同转移潜能的人结直肠癌细胞株SW480和SW620的分泌蛋白质组，并对感兴趣的差异分泌蛋白进行了较为全面的验证，以期发现对结直肠癌转移有预测价值的血清标志物。首先，我们以来自同一亲本的人结直肠癌原发灶细胞株SW480

6、和淋巴结转移灶细胞株SW620作为体外研究的模型系统，通过条件的反复优化，从这两株细胞的无血清培养上清中成功的收集了高质量的分泌蛋白样本。随后，用特异性的胰酶消化蛋白质，酶解后的肽段经变性、脱盐等处理后经高效液相色谱分离，最后用Finnigall刑LTQⅢ线性离子阱串联质谱进行分析。质谱所采集到的原始数据用SEQUEST程序搜索国际蛋白指数(InternationalProteinIndex，IPI)人蛋白非冗余库(Version3．26)以鉴定蛋白质。利用液相色谱．串联质谱技术，我们从SW480和III浙江大学博士学位论文中文摘要SW620细

7、胞的分泌蛋白样本中总共鉴定出了910个非冗余蛋白质。由于这些蛋白质的识别均是基于两个及以上独特肽段的，所以更加严格和可靠；据我们所知，这也是迄今为止鉴定蛋白质数目最多的结直肠癌相关研究。为保证后续非标记定量的质量，我们对液相色谱．串联质谱分析结果的重复性和可靠性进行了评估。结果发现：l、共计6次液相色谱．串联质谱分析的二维图谱具有极高的相似度。2、SW480和SW620各3次重复的液相色谱．串联质谱分析中鉴定到的蛋白质数量稳定。3、SW480和SW620的3次实验所识别蛋白的重复性分别为77％和74％。4、在设定的参数下，肽段错误发现率为3．8

8、2％。证明液相色谱．串联质谱分析的稳定性和重复性好，肽段鉴定的可信度较高。在此基础上，利用DeCyderTMMS差异分析软件(Version1．0)，