猪瘟病毒E2蛋白纳米疫苗的初步研究

《猪瘟病毒E2蛋白纳米疫苗的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号：S852.65+9.6学校代码：10712UDC：636.09研究生学号：2015050642密级：公开2018届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文猪瘟病毒E2蛋白纳米疫苗的初步研究学科专业预防兽医学研究方向分子病原学与免疫学研究生李亚菲指导教师张改平院士完成时间2018年5月中国陕西杨凌 Classificationcode:S852.65+9.6Universitycode:10712UDC:636.09Postgraduatenumber:2015050642Confidentialitylevel:openThesisforMaster’sDegreeNorthwestA&FUniversityin2018DESIGNANDEVALUATIONOFE2STRUCTURALBASEDNANO-VACCINEOFCLASSICALSWINEFEVERVIRUSMajor:PreventiveVeterinaryMedicineResearchfield:MolecularEtiologyandImmunologyNameofPostgraduate:YafeiLiAdviser:Prof.GaipingZhangDateofsubmission:May,2018YanglingShaanxiChina 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的硕士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》,如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的硕士研究生所呈交的硕士学位（毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名：时间：年月日 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国优秀硕士学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。（保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日 猪瘟病毒E2蛋白纳米疫苗的初步研究摘要猪瘟（Classicalswinefever，CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）引起的一种高度接触性、破坏性传染病，又称古典猪瘟或猪霍乱。死亡率高达80%～90%，是严重危害养猪业的重要传染病之一，该病的流行和爆发给养猪业带来了巨大的经济损失。当前CSF防治的主要手段是疫苗接种，其中中国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗在中国乃至世界范围内CSF的防控起到了积极作用。但我国CSF流行情况仍然复杂，为控制该病的流行，预防该病的爆发，研制出一种高效、安全的新型疫苗已经成为必然趋势。纳米技术在疫苗学中的应用，尤其是过去的十年中呈现出指数增长的趋势。纳米材料无论是作为投递系统增强抗原加工，还是作为一种免疫刺激佐剂激活或强化免疫，都得到了广泛的应用。纳米金颗粒（AuNPs）由于其颗粒小、毒性低以及良好的生物相容性，可以作为疫苗载体来呈递抗原从而提高疫苗的免疫效果，是制备纳米疫苗的理想材料。CSFVE2蛋白作为病毒粒子囊膜上的主要保护性结构蛋白，是CSF亚单位疫苗理想的候选抗原。本研究通过将CSFV的主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白与AuNPs偶联，将E2蛋白多重展示于AuNPs表面，制备新型纳米疫苗E2-AuNPs，通过免疫小鼠对其免疫效果进行评价。为研制新型疫苗提出了一种新思路，并奠定了一定的理论与实践基础。总体实施方案主要分为以下几个部分：1.纳米金颗粒（AuNPs）的制备与鉴定采用Turkevich方法制备AuNPs。将1mL1%水合四氯金酸（HAuCl4）（10mg/mL）加入到100mL双蒸水（ddH2O）中，使其在剧烈搅拌下沸腾。将8mL的1%柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）（10mg/mL）加入沸腾的溶液中，反应15min后，溶液颜色变红，反应停止。通过透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）对所得AuNPs的形状，大小和Zeta电位进行表征，结果显示AuNPs粒径约为24.4nm，Zeta电位为-34.3mV。通过紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）扫描表面等离子体共振来监测AuNPs，显示在λmax=523nm处有最大吸收峰。2.CSFVE2蛋白的表达、纯化及鉴定参照NCBI数据库中猪瘟病毒兔化弱毒疫苗E2蛋白的氨基酸序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司将无核定位信号和去除跨膜区的CSFVE2蛋白的编码序列在大肠杆菌（E.coli）表达系统中进行密码子优化，并克隆到pUC57载体中。以pUC57-E2 为模板，构建pET-28a-E2重组表达质粒，并在感受态细胞BL21（DE3）中通过Isopropylβ-D-Thiogalactoside（IPTG）诱导表达。通过SDS-PAGE和Westernblot结果显示，在43kDa处有蛋白条带，与预期结果一致，目的蛋白主要以包涵体形式存在，并能与CSFV阳性血清反应。将E2蛋白通过变性、纯化、复性后，得到可溶性E2蛋白。通过SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白，结果显示，在43kDa处有单一的蛋白条带且能被抗CSFV单克隆抗体识别，表明纯化复性蛋白纯度较高且活性良好。3.纳米金颗粒-E2蛋白颗粒抗原（E2-AuNPs）的制备及物理表征通过将1mLE2蛋白与1mLAuNPs（0.2mg/mL）在4℃条件下混合搅拌1h，离心（17000g，30min）收集上清液用于蛋白浓度测定，沉淀悬浮于10mMTris-HCl中制备纳米金颗粒-E2蛋白颗粒抗原（E2-AuNPs）。通过TEM观察显示，偶联后金颗粒周围形成一圈蛋白晕（Corona）；DLS测定显示，偶联后金颗粒粒径由24.4nm增加至78.8nm，Zeta电位由-34.3mV增加至-26.1mV；UV-Vis显示，偶联后E2-AuNPs最大吸收波长由λmax=523nm迁移至530nm，以上数据均表明纳米金颗粒与E2蛋白成功偶联并且形成稳定的颗粒复合物。4.E2-AuNPs的生物学评价E2蛋白和E2-AuNPs按梯度稀释包被于96孔板上，通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）进行生物学评价，结果显示E2-AuNPs具有与E2几乎相同的抗原活性。采用间接免疫荧光法（Indirectimmunoinfluscentassay，IFA）检测抗原呈递细胞（Antigenpresentingcells，APCs）对E2和E2-AuNPs的摄取情况，结果显示E2-AuNPs组内化到APCs中的E2蛋白数量多于E2蛋白组，且通过细胞毒性试验显示AuNPs对APCs不产生细胞毒性作用。5.猪瘟病毒CSFVE2蛋白纳米疫苗（E2-AuNPs）的免疫学评价取6周龄的雌性BALB/c小鼠，每组5只，随机分成6组。每只小鼠皮下注射100μL疫苗，每组疫苗组成为E2、E2-AuNPs、E2-CpG、E2-AuNPs-CpG、E2-弗氏佐剂、E2-AuNPs-弗氏佐剂。初次免疫3周后加强免疫，免疫后第0d，21d，42d收获血清，通过ELISA方法进行检测；免疫后49d处死小鼠取其脾脏，用小鼠淋巴细胞分离培养基分离淋巴细胞进行T淋巴细胞增殖测定。结果显示，无论在有无佐剂的情况下，AuNPs均可以显著提高E2蛋白特异性抗体水平；E2-AuNPs组诱导的刺激指数（Stimulationindex，SI）显著高于E2蛋白组和AuNPs组。本研究的意义在于成功建立了CSFV重组E2蛋白包涵体复性的体系，成功制备了CSFVE2蛋白新型纳米疫苗，并对其免疫效果进行评价分析。这些研究表明AuNPs作为一种抗原载体能很好的增强免疫应答。因此，抗原蛋白与AuNPs的结合将是一种简单而有效的新型结构疫苗制备策略。关键词：猪瘟病毒；E2蛋白；纳米金颗粒；偶联；抗原载体；纳米疫苗 DESIGNANDEVALUATIONOFE2STRUCTURALBASEDNANO-VACCINEOFCLASSICALSWINEFEVERVIRUSABSTRACTClassicalswinefever(CSF)isahighlycontactedanddestructiveinfectiousdiseasecausedbyclassicalswinefevervirus(CSFV),alsoknownasclassicalswinefeverorswinecholera.Themortalityrateisashighas80%to90%,whichisoneofthemostseriousinfectiousdiseasesintheswineindustry.Theepidemicandoutbreakofthediseasehasbroughthugeeconomiclossestothepigindustry.Atpresent,themainmethodforthepreventionandtreatmentofswinefeverisvaccination,inwhichthedevelopmentoftheHogCholeraLapinizedVirus(HCLV)hasplayedapositiveroleinthepreventionandcontrolofCSFinChinaandevenintheworld.However,theprevalenceofswinefeverinChinaisstillcomplex.Tocontroltheepidemicandpreventtheoutbreakofthisdisease,ithasbecomeaninevitabletrendtodevelopanewvaccinethatisefficientandsafe.Theapplicationofnanotechnologyinvaccinology,especiallyinthepastdecade,hasshownanexponentialgrowthtrend.Nanomaterialshavebeenwidelyusedasadeliverysystemtoenhanceantigenprocessing,orasanimmunostimulatoryadjuvanttoactivateorenhanceimmunity.Becauseofitssmallparticlesize,lowtoxicityandgoodbiocompatibility,AuNPscanbeusedasvaccinevectorstopresentantigenstoimprovetheimmuneeffectofvaccines.Itisanidealmaterialforpreparingnanovaccines.TheCSFVE2proteinisamajorprotectivestructuralproteinontheenvelopeofvirionparticlesandisanidealcandidateantigenfortheswinefeversubunitvaccine.Inthisstudy,theE2envelopeglycoproteinoftheCSFVwascoupledtotheAuNPsandtheE2proteinwasmultiplexedonthesurfaceoftheAuNPstoprepareanovelnanovaccineE2-AuNPs.Theimmunizationefficacywasevaluatedbyimmunizingmice.Anewideawasproposedforthedevelopmentofanewtypeofvaccine,andacertaintheoreticalandpracticalfoundationwaslaid.Theoverallimplementationplanismainlydividedintothefollowingsections:1．PreparationandidentificationofAuNPsAuNPswerepreparedusingtheTurkevichmethod.1mLof1%hydratedtetrachloroauricacid(HAuCl4)(10mg/mL)wasaddedto100mLofdoubledistilledwater(ddH2O)andallowedtoboilundervigorousstirring.8mLof1%sodiumcitrate(Na3C6H5O7·2H2O)(10mg/mL)wasaddedtotheboilingsolution,andafter15minutesof reaction,thecolorofthesolutionbecameredandthereactionwasstopped.Theshape,sizeandZetapotentialoftheobtainedAuNPswerecharacterizedbytransmissionelectronmicroscopy(TEM)anddynamiclightscattering(DLS).TheresultsshowedthattheAuNPshadaparticlesizeabout24.4nmandaZetapotentialabout-34.3mV.AuNPsweremonitoredbyultraviolet-visibleabsorption(UV-Vis)scanningsurfaceplasmonresonanceandshowedamaximumabsorptionpeakatλmax=523nm.2．Expression,purificationandidentificationofCSFVE2proteinAccordingtotheaminoacidsequenceoftheE2proteinoftheHCLVintheNCBIdatabase,theCSFVE2proteincodingsequencewithoutnuclearlocalizationsignalandwithnotransmembraneregionwascodonoptimizedintheE.coliexpressionsystemandclonedintothepUC57vector.ThepUC57-E2genewasusedasatemplatetoconstructarecombinantprokaryoticexpressionplasmidpET-28a-E2andinducedbyIsopropylβ-D-Thiogalactoside(IPTG)inE.coliBL21(DE3).TheresultofSDS-PAGEandWesternblotshowedthattherewasaproteinbandat43kDa,whichwasconsistentwiththeexpectedresult.Thetargetproteinmainlyexistedintheformofinclusionbodiesandcouldreactwithswinefeverviruspositiveserum.AftertheE2proteinisdenatured,purifiedandrenatured,solubleE2proteinisobtained.TheproteinwasdetectedbySDS-PAGEandWesternblot.Theresultsshowedthattherewasasingleproteinbandat43kDaandcouldberecognizedbytheanti-CSFVmonoclonalantibody,indicatingthatthepurifiedrenaturedproteinwasofhighpurityandactivity.3．Preparationandphysicalcharacterizationofnano-goldparticle-E2proteinparticleantigen(E2-AuNPs)1mLofE2proteinwasmixedwith1mLofAuNPs(0.2mg/mL)andstirredat4°C.for1h.Thesupernatantwascollectedbycentrifugation(17000g,30min)forproteinconcentrationdetermination.Theprecipitatewassuspendedin10mMTris-HCltopreparenano-goldparticle-E2proteinparticleantigen(E2-AuNPs).ThroughTEMobservation,acircleofproteincoronawasformedaroundthegoldparticlesaftercoupling.TheDLSmeasurementshowedthattheparticlesizeofthegoldparticlesaftercouplingincreasedfrom24.4nmto78.8nm,andtheZetapotentialincreasedfrom-34.3mVto-26.1mV.UV-Visshowedthataftercoupling,themaximumabsorptionwavelengthofE2-AuNPsmigratedfromλmax=523nmto530nm.TheabovedataallshowedthatthegoldnanoparticlesweresuccessfullycoupledwithE2proteinandformastableparticlecomplex.4．BiologicalevaluationofE2-AuNPsTheE2proteinandE2-AuNPswerecoatedon96-wellplatesinserialdilutionsandsubjectedtobiologicalevaluationbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)，the resultsshowthatE2-AuNPshavealmostthesameantigenicactivityasE2.Indirectimmunofluorescenceassay(IFA)wasusedtodetecttheuptakeofE2andE2-AuNPsbyantigenpresentingcells(APCs),theresultsshowedthatE2-AuNPsgrouphadmoreE2proteinsinternalizedintoAPCs.AndtheE2proteingroupandthecytotoxicityassayshowedthattheAuNPsdidnotproducecytotoxiceffectsonAPCs.5．ImmunologicalevaluationofswinefevervirusCSFVE2proteinnanovaccine(E2-AuNPs)Six-week-oldfemaleBALB/cmicewererandomlydividedinto8groups.Eachmousewasinjectedsubcutaneouslywith100μLofvaccine.EachvaccineconsistedofE2,E2-AuNPs,E2-CpG,E2-AuNPs-CpG,E2-Freund’sadjuvant,E2-AuNPs-Freund’sadjuvant,AuNPsand10mMTri-HClasanegativecontrol.Threeweeksaftertheinitialimmunization,theanimalswereimmunizedagainandtheserumwasharvestedonthe0th,21st,and42thdaysafterimmunizationanddetectedbyELISA.After49daysofimmunization,miceweresacrificedtotaketheirspleens.LymphocyteswereisolatedfrommouseforT-lymphocyteproliferationassay.TheresultsshowedthatAuNPscouldsignificantlyincreasethespecificantibodylevelofE2proteininthepresenceorabsenceofadjuvant;theE2-AuNPsgrouphadsignificantlyhigherstimulationindex(SI)thanE2proteingroupandAuNPsgroup.ThesignificanceofthisstudyliesinthesuccessfulestablishmentofthesystemofrefoldingofCSFVrecombinantE2proteininclusionbodies,successfulpreparationofanovelnanovaccineofCSFVE2protein,andevaluationofitsimmuneeffects.ThesestudiesindicatethatAuNPsserveasanantigencarriertoenhanceimmuneresponses.Therefore,thecombinationofantigenicproteinsandAuNPswillbeasimpleandeffectivestrategyforthepreparationofnovelstructuralvaccines.KEYWORDS:CSFV;E2protein;AuNPs;coupling;antigencarrier;nanovaccine 目录第一章文献综述....................................................................................................................11.1CSF的研究进展...........................................................................................................11.1.1CSF的起源.........................................................................................................11.1.2CSF在世界各地及中国的流行及分布情况.....................................................11.2CSFV和疫苗的研究进展............................................................................................41.2.1CSFV的病原学..................................................................................................41.2.2CSFV基因组及主要结构蛋白..........................................................................41.2.3CSF疫苗的研究.................................................................................................61.2.4CSF的免疫防控策略.........................................................................................71.2.5问题和展望........................................................................................................71.3纳米颗粒的研究进展..................................................................................................71.3.1纳米颗粒的类型................................................................................................71.3.2纳米颗粒与抗原的相互作用............................................................................81.3.3纳米金颗粒概述................................................................................................91.3.4纳米金颗粒的免疫学特性..............................................................................101.3.5纳米金颗粒在疫苗中的应用..........................................................................11第二章纳米金颗粒（AuNPs）的制备与鉴定..................................................................132.1引言............................................................................................................................132.2材料与方法................................................................................................................132.2.1主要仪器设备..................................................................................................132.2.2主要试剂..........................................................................................................132.2.3纳米金颗粒的制备..........................................................................................142.2.4纳米金颗粒的鉴定..........................................................................................142.3结果与分析................................................................................................................142.3.1纳米金颗粒的鉴定..........................................................................................142.4讨论............................................................................................................................152.5小结............................................................................................................................16第三章CSFVE2蛋白的表达、纯化及鉴定......................................................................173.1引言............................................................................................................................173.2材料和方法................................................................................................................173.2.1主要仪器设备..................................................................................................17 3.2.2质粒和菌株......................................................................................................183.2.3主要试剂..........................................................................................................183.2.4重组表达载体的构建与鉴定..........................................................................183.2.5CSFVE2蛋白的诱导表达、可溶性分析及鉴定..........................................203.2.6CSFVE2蛋白变性、纯化、复性及活性鉴定..............................................213.3结果与分析................................................................................................................223.3.1重组表达载体的构建与鉴定..........................................................................223.3.2CSFVE2的诱导表达及分子生物学分析......................................................243.3.3CSFVE2蛋白复性及抗原活性鉴定.....................................................................253.4讨论............................................................................................................................273.5小结............................................................................................................................27第四章纳米金颗粒-E2蛋白颗粒抗原（E2-AuNPs）的制备及物理表征......................284.1引言............................................................................................................................284.2材料和方法................................................................................................................284.2.1主要仪器设备..................................................................................................284.2.2主要试剂及试剂盒..........................................................................................284.2.3E2-AuNPs颗粒抗原的制备.............................................................................294.2.4E2-AuNPs颗粒抗原的物理表征.....................................................................294.3结果与分析................................................................................................................294.3.1E2-AuNPs颗粒抗原的物理表征.....................................................................294.4讨论............................................................................................................................314.5小结............................................................................................................................31第五章E2-AuNPs抗原复合物的生物学评价....................................................................325.1引言............................................................................................................................325.2材料和方法................................................................................................................325.2.1主要仪器设备..................................................................................................325.2.2主要试剂..........................................................................................................325.2.3E2-AuNPs抗原活性检测.................................................................................335.2.4细胞毒性试验..................................................................................................335.2.5细胞吞噬试验..................................................................................................335.3结果与分析................................................................................................................335.3.1E2-AuNPs抗原活性检测.................................................................................335.3.2细胞毒性试验..................................................................................................345.3.3细胞吞噬试验..................................................................................................345.4讨论............................................................................................................................35 5.5小结............................................................................................................................35第六章猪瘟病毒CSFVE2蛋白纳米疫苗的免疫学评价................................................366.1引言............................................................................................................................366.2材料和方法................................................................................................................366.2.1试验动物..........................................................................................................366.2.2主要试剂及试剂盒..........................................................................................366.2.3疫苗配制及分组情况......................................................................................366.2.4小鼠免疫效果评价..........................................................................................376.2.4.1抗体水平检测...............................................................................................376.2.4.2T淋巴细胞增殖试验....................................................................................376.3结果与分析................................................................................................................386.3.1小鼠抗体水平检测..........................................................................................386.3.2T淋巴细胞增殖试验.......................................................................................396.4讨论............................................................................................................................396.5小结............................................................................................................................39全文总结..................................................................................................................................40参考文献..................................................................................................................................41致谢......................................................................................................................................46作者简介..................................................................................................................................47 第一章文献综述1.1CSF的研究进展1.1.1CSF的起源猪瘟（Classicalswinefever,CSF）又称古典猪瘟或猪霍乱（Hogcholera），是一种高度接触性传染和高致死性的疾病，死亡率高达80%～90%，对全世界各个地区养猪业造成的经济损失非常巨大。因此CSF在我国制定的《家畜家禽防疫条例实施细则》中被列为一类传染病，也被世界动物卫生组织（OIE）规定为A类16种法定传染病之一(Moennig2000)。CSF首先在1810年发现于美国的田纳西州(Hanson1957)，也有报道称CSF最早于1833年在美国的俄亥俄州发现(Edwardsetal.2000)。因此在国际上关于CSF的起源还没有统一的认识，我国对于CSF的确切起源也有着不同的说法。我国对CSF的最早认识一般认为是在1925年从东南大学农科系开始研究CSF免疫血清开始的(Elbersetal.2001)。1.1.2CSF在世界各地及中国的流行及分布情况CSF可发生于一年四季，季节性不明显，一般以春、秋两季较为严重。CSF只能感染猪，并通过病猪和带毒猪传播CSFV。CSFV存在于病猪或带毒猪的分泌物、血液、肉、内脏及它们所接触的废料或废水，随后通过各种不同的途径传播。一般常见的传播方式是与病猪的直接接触，经过呼吸道、消化道、眼结膜及受伤皮肤感染。根据全球CSF的流行情况、猪肉的国际贸易量以及各个地区猪的饲养情况，CSF在世界范围内的分布大致可分为欧洲、东南亚、中南美和加勒比海地区。世界各地对该病的防控都很重视，因为CSF对养猪业发展及人类健康都有着直接或间接的影响，因此人们都试图通过各种方法以期对该病原进行净化，达到彻底消灭CSF的目的。目前一些国家已经取得成功，例如加拿大（1963年）、美国（1978年）等国家通过政府的调控和各个养殖场的严格遵守已经宣布彻底消灭了CSF，但是在中国CSF仍然是威胁养猪业发展的最重要的传染病。目前，在中国CSF仍然没有被完全控制住，我国CSF的流行方式已经从频繁发生的大流行转变为许多地区周期性零星流行，多局限于“CSF不稳定地区”的散发性流行(Chang-Chun2003,Lvetal.2001)。栾培贤等人(2013)汇总了我国CSF在2001-2010年期间每月新发生的次数（表1-1）和发病次数地理分布（图1-2）。因此我国CSF的流行1 区域可以分为以北京市、内蒙古自治区、吉林省、辽宁省和四川省这5个地区为代表的CSF无疫病地区，以安徽、云南、贵州、福建、广东和广西为代表的CSF重灾区和其他地区为代表的CSF疫情稳定区。表1-12001年1月到2010年12月全国CSF疫情信息Table1-1CSFepidemicsbetweenJan2001toDec2010inChina省、市、自治区CSF发病次数CSF发病年次CSF发病月次Provinces,No.ofnewNo.ofNo.ofMunicipalitiesandOutbreaksofYearswithMonthsautonomousregionsCSFCSFwithCSF北京Beijing000天津Tianjin10310河北Hebei222山西Shanxi645内蒙古Neimenggu000辽宁Liaoning000吉林Jilin000黑龙江Heilongjiang1031063上海Shanghai111江苏Jiangsu737浙江Zhejiang62633安徽Anhui1941087福建Fujian673981江西Jiangxi123839山东Shandong222河南Henan1321054湖北Hubei144855湖南Hunan146870广东Guangdong998989广西Guangxi143610113海南Hainan212重庆Chongqing111四川Sichuan000贵州Guizhou100510100云南Yunnan54010982 西藏Xizang111陕西Shanxi122873甘肃Gansu119757青海Qinghai44734宁夏Ningxia128767新疆Xinjiang51637总计Total60521631181图1-12001年1月到2010年12月全国CSF发病地理分布图Figure1-1GeographicaldistributionofCSFepidemicsbetweenJan2001toDec2010inChina3 1.2CSFV和疫苗的研究进展1.2.1CSFV的病原学CSF的病原是CSFV，与同属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的牛病毒性黏膜腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus,BVDV）和羊边界病毒（Borderdiseasevirus,BDV）在血清学上有交叉反应(TerpstraandWensvoort1997)，是一种世界分布广泛的危害动物健康的病原体，主要感染猪和野猪(Kadenetal.2000)。CSFV经常使用PK-15、SK6和CPK细胞系进行病毒增殖(Moennig1992)，但这些细胞经过CSFV感染后均不发生细胞病变效应(吴海祥etal.2003)。CSFV不同毒株之间存在着显著的抗原差异性，CSFV为单一血清型，尽管可以分离出不少变异株，但是都属于同一个血清型。完整的CSFV粒子呈球形，直径约为40-60nm，外被一层主要由脂质组成的囊膜，囊膜内是40nm、呈二十面体对称的核衣壳，囊膜表面有6～8nm形状不规则的囊膜糖蛋白凸起（见图1-3）(代兴国2006,殷震and刘景华1997)。CSFV对环境的抵抗力不强，存活的时间跟病毒所处的介质环境有关。血液中的CSFV在56℃60min的条件下可以被灭活，在60℃10min的条件下即可完全丧失致病力，而脱纤血中的CSFV在68℃30min也不能使其灭活。CSFV在pH值为5-10的条件下比较稳定，过酸或过碱能使病毒失活，2%的氢氧化钠是最合适的消毒剂(Freitasetal.1998)。图1-2CSFV及其基因组结构图（MartinBeer,Vaccine,2007）Figure1-2CSFVStructureandGenomeSchematic（MartinBeer,Vaccine,2007）1.2.2CSFV基因组及主要结构蛋白CSFV属黄病毒科（Flaviviriclac）瘟病毒属（Pestivirus）中的一个成员(蔡宝祥2001),是具有囊膜的约12.3kb的单股正链线状RNA病毒。整个基因组分为3部分，分别为非4 常保守的5’无帽子结构的非编码区、3’没有多聚腺苷酸尾（PolyA）的非编码区、编码结构蛋白和非结构蛋白的开放阅读区(Meyersetal.1989,Moormannetal.1990)。该开放阅读框编码的多聚蛋白在特异性蛋白酶的作用下裂解成12种病毒特异性蛋白质，其中4种为病毒的结构蛋白，8种为非结构蛋白，各种蛋白的具体分布情况如图1-2所示(Mayeretal.2003,Meyersetal.1996,Moormannetal.1996,Risattietal.2005,Rugglietal.1996,Widjojoatmodjoetal.1999)。在四种结构蛋白中，C是CSFV的衣壳蛋白，Erns（E0）、E1、E2是CSFV的囊膜糖蛋白，具有免疫原性。其中E2蛋白是研制猪瘟亚单位疫苗的首选蛋白(Reuskenetal.2003)。E2蛋白是由373个氨基酸残基组成（Arg690-Gly1062），有6个潜在的N-糖基化位点，1个O糖基化位点(vanRijnetal.1994)，每个位点上都可以与一个约2～3kDa的低聚糖相连。E2蛋白分子量约为51～55kDa(Rumenapfetal.1993)，而去糖基化的蛋白骨架分子量约为41.5kDa。E2蛋白的糖基化作用与CSFV的毒力(Risattietal.2007)和免疫原性(Gavrilovetal.2011)有关，E2蛋白缺乏糖基化后会失去其感染力并且不能诱导CSFV中和抗体的产生和对CSFV的保护。同样，如果在破坏E2蛋白与E1蛋白形成异源二聚体的情况下，CSFV的致病力将大大下降，因而异源二聚体对于稳定CSFV也发挥着重要的作用(梁晶晶2010)。利用单克隆抗体技术对E2蛋白抗原区进行定位，如图1-4可以看出E2蛋白存在4个相互独立的抗原区：A、B、C、D(Dhenninetal.1976,Wensvoortetal.1989)。A、B、C和D抗原区分别位于766～865、690～799、690～799和775～788位氨基酸残基之间，所有的抗原区均位于E2蛋白分子N端690～866位氨基酸残基区域里。在空间结构上，A区和D区通过Cys792和Cys856、Cys818和Cys828形成的两对二硫键连接，B区和C区通过Cys693和Cys737形成的二硫键连接形成两个相对独立的结构单位。5 图1-3CSFVE2蛋白空间结构（Yu-LiangHuang,VirusResearch,2014）Figure1-3StructureofCSFVE2protein（Yu-LiangHuang,VirusResearch,2014）1.2.3CSF疫苗的研究疫苗是人类医药史上最突出的成就之一。疫苗接种可以防止或减轻传染病的危害，改善人类和动物的生活质量而产生巨大的全球影响。疫苗在历史上主要经过了3次变革，分别是19世纪末开始的第一次变革，用病原微生物本身而制备的灭活疫苗和减毒活疫苗；20世纪80年代开始的第二次变革，用病原微生物的成分制备而成的亚单位疫苗、多肽疫苗及其他基因工程疫苗；20世纪90年代开始的第三次变革，用病原微生物的核酸制备的核酸疫苗。猪瘟疫苗也随着变革经历了猪瘟结晶紫疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及现在正在研制的具有良好免疫效果的基因重组亚单位疫苗。基因重组亚单位疫苗的基本流程是载体构建、蛋白表达与纯化、筛选免疫原活性良好的的蛋白所制成的疫苗。蛋白质的异源表达体系已经非常成熟，例如我们常用的原核和真核表达系统。作为CSFV最主要的抗原蛋白，大量研究表明E2蛋白可以诱导机体产生抗体，中和CSFV，阻止CSFV对细胞的入侵，从而使机体抵抗CSFV的攻击。因此E2蛋白是研究CSFV基因工程疫苗的首要候选蛋白。很多学者发现，通过大肠杆菌表达系统得到的CSFVE2蛋白往往以包涵体形式存在，经过复性之后才能得到可溶性E2蛋白(王海震etal.2005,周景明etal.2015)。余兴龙(2003)早在2003年报道CSFVE2蛋白基因突变可以增加其在大肠杆菌中的表达水平，重组蛋白具有良好的免疫原性，可用于抗原检测CSFV抗体，并且用该重组蛋白免疫家兔后可抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。张文杰(2007)、胡叶刚(2012)、李文良(2013)等利用昆虫细胞表达出高活性的重组E2蛋6 白，并且能够分泌表达。张华伟(2014)利用昆虫细胞系统表达的可溶性E2蛋白免疫兔子，使兔子可抵抗CSFV的攻击，获得良好的保护性。徐学清(2004)、王启宇等(2012)利用酵母表达系统表达获得可溶性的E2蛋白。1.2.4CSF的免疫防控策略近年来，我国烈性CSF的流行虽然得到了有效的控制，但是如今CSF的流行特点也发生了新的变化，对养殖场来说CSF的预防仍然要作为头等大事来做。在平时预防中，养殖场应当建立自己的流行病学监测体系；按照国家规定对猪的集市、买卖、运输、屠宰和进口，进行严格的检疫；自繁自养，引种检疫，加强种猪管理，淘汰阳性种猪特别是种公猪；做好清洁卫生工作，改善饲养管理；加强预防接种，选择正规厂家购买疫苗，认真阅读产品说明书，严格按照说明书保存、使用、接种并制定科学的免疫程序；建议养殖场控制抗生素的使用，适量改换一些微生态制剂和含中草药成分的药物以避免这种情况的发生。在发病时要对全群猪只进行检查，隔离病猪及可疑病猪，并用抗血清进行早期治疗；对病猪场及附近尚未发病的猪，立即进行紧急接种CSF疫苗；注意日常消毒；病死猪的尸体应进行合理化的处理。这些都以期有效降低CSF的发生几率，提高养殖户的经济效益(姚文生etal.2011)。1.2.5问题和展望如今人们的生活质量在不断提高，人们对高品质猪肉的需求也在逐年提升，因此今后的工作重点仍然是如何净化病原，彻底消灭CSF。CSF是猪的重要传染病，控制和消灭CSF具有重要意义。根据其在中国的流行状况，相关研究人员提出了几点防控措施，分别是要加强免疫和病原监测、实行种猪群净化措施、发展规模化养殖和开展野猪CSFV感染情况调查。作为一名兽医学科研人员，不仅要加强CSF致病机理研究，也要放眼于CSF的应用性研究，在临床诊断和疫苗研制做出贡献。1.3纳米颗粒的研究进展1.3.1纳米颗粒的类型纳米颗粒是指介于1-1000nm的尺寸范围内有机或者无机颗粒，具有特殊的表面性质和生物活性。可分为多聚纳米颗粒，无机纳米颗粒，脂质体，免疫刺激复合物，类病毒颗粒等。1.3.1.1多聚性纳米颗粒聚丙交酯乙交酯（PLG）、聚乳酸乙醇酸（PLGA）、聚谷氨酸（g-PGA）、聚乙二醇（PEG）及聚苯乙烯等多聚体都可被用来制备纳米颗粒，大小为2～1000nm不等。支链淀粉、藻酸盐、菊粉和脱乙酰壳多糖等以多糖为基础的天然多聚物可用于制备纳米7 颗粒佐剂。它们具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒性及易于修饰成既定形状和大小等特点，可以递呈给特定的免疫细胞并缓慢释放抗原。因此，这类多聚性纳米颗粒被广泛研究，适合用于免疫原性较弱的抗原，起到保护抗原和其他生物活性介质的作用，使其在机体内保持天然构象(Chouetal.2010)。1.3.1.2无机纳米颗粒无机纳米颗粒的典型代表有金纳米颗粒、碳纳米颗粒和磷酸钙纳米颗粒等。这些纳米颗粒都具有硬性结构、能够可控性合成并且具有非生物降解的特性。金纳米颗粒是指大小为2～150nm，可被加工成球状、棒状、管状等不同形状的无机纳米颗粒，表面可经过碳水化合物修饰，作为一些抗原物质的载体。碳纳米颗粒是指可被制备成直径约为0.8～2nm，长度为100～1000nm的纳米管和筛孔大小约为500nm的筛状球体，一些活性抗原可结合于碳纳米管上递送给机体免疫系统。同样具有生物相容性的另一种无机纳米颗粒是磷酸钙纳米颗粒，粒径为50～100nm，是一种能激发粘膜免疫的佐剂。1.3.1.3脂质体脂质体（Liposomes）是由生物可降解并且无毒性的卵磷脂和神经酰胺等制得的脂质体，制备的脂质体是空心的，大小约为100～400nm。可以将抗原包裹其中将抗原蛋白递送并掺入病毒外膜糖蛋白。Inflexal®和Epaxal®已经建立了许多脂质体系统，已经在人体上得到应用。1.3.1.4免疫刺激复合物（ISCOM）免疫刺激复合物是荷载肽或蛋白质抗原的脂类载体复合物，大小约为40nm，类笼形颗粒，可以促进细胞对流感病毒、单纯疱疹病毒、HIV以及新城疫病病毒等抗原的摄取，当脂类和细胞膜溶合后，抗原即被带入细胞内发挥作用。1.3.1.5类病毒样颗粒类病毒样颗粒（Viruslikeparticles,VLPs）与天然的病毒颗粒在形态结构上类似，由于其不含病毒核酸，因此不能自主复制，不具有感染性。但是它是由一个或多个结构蛋白自组装而成，因而具有较强的免疫原性和生物学活性，又被称为伪病毒。其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。因而也是理想的纳米疫苗系统，能将具有免疫原性的蛋白重复序列展示于外部，能够诱导有效的免疫应答。1.3.1.6乳剂乳剂是将溶质与有机溶剂、乳化剂按一定比例溶解调制成均相的液体制剂，大小可为50～600nm不等。这种纳米颗粒有两种存在形式，分别是水包油或油包水。乳剂可将抗原携带至它们的核内或者与抗原简单地混合，具有乳化分散性、分散液的稳定性、贮存稳定性等功能。1.3.2纳米颗粒与抗原的相互作用纳米颗粒不仅可以作为投递系统增强抗原加工，还可以作为一种免疫刺激佐剂激活8 或强化免疫。作为投递系统，纳米颗粒能够协助抗原将其投递到免疫系统的细胞中，由于纳米颗粒具有与细胞组分大小相似的特性，可以通过细胞内吞机制，特别是胞饮作用进入活细胞，可以用于有效地递送免疫活性组分至靶位点，继而将保护性抗原在靶位点部位加以释放。作为免疫刺激佐剂即免疫增强剂，纳米颗粒激活某些免疫途径，而这些途径进而增强抗原加工并改善免疫原性。对于纳米颗粒无论是作为投递系统还是作为免疫增强剂发挥作用，抗原和纳米颗粒之间的联合作用是必然的。如图5所示，抗原与纳米颗粒之间可通过共轭（Conjugation），封装（Encapsulation），吸附（Adsorption）和混合（Mix）。吸附和混合属于简单的物理方法，共轭和封装属于较复杂的化学方法。抗原通过简单的混合吸附到纳米颗粒上通常是通过电荷或疏水性相互作用而实现的，因此，抗原和纳米颗粒之间的相互作用相对较弱，这就使抗原和纳米颗粒在体内容易快速分离。封装和共轭均属于较复杂的化学结合，能够使纳米颗粒和抗原之间相互作用增强，在共轭中，抗原可通过共价键或化学试剂交联于纳米颗粒表面(Slutteretal.2010)，只有细胞将抗原与纳米颗粒一起吸收后才能在细胞内释放；在封装过程中，抗原在合成过程中与纳米颗粒前体混合，当前体颗粒进入纳米颗粒时导致抗原包封(Heetal.2000)，只有当纳米颗粒在体内或细胞内时才能分解释放抗原。图1-4纳米颗粒与抗原的相互作用（LiangZhao,vaccine,2013）Figure1-4Interactionbetweennanoparticlesandantigens（LiangZhao,vaccine,2013）1.3.3纳米金颗粒概述纳米金颗粒属于无机纳米颗粒。在过去的二十余年里，纳米金颗粒应用于生物医学等各个领域(CortiandHolliday2004,Haruta2004,董守安and唐春2005)，因而受到不少国家政府和学术界的重视。纳米金颗粒粒径较小，毒性低，有着良好的稳定性，免疫原性低，制备方法简单，可以根据不同需求制备成各种形状，比如球形、棒状、三角形、立方体等(Niikuraetal.2013)。纳米金颗粒大小范围为2～150nm(Gregoryetal.2013)，具有良好的生物相容性，因此可被广泛应用于生物医学的发展。纳米金颗粒表面可以用碳水化合物进行表面改性(Marradietal.2013)，能有效地传递免疫原性物质(Connoretal.9 2010,Gribovaetal.2012,KhlebtsovandDykman2011,Parveenetal.2012)，因此特别适合研究和加强疫苗接种(Peeketal.2008)。1.3.4纳米金颗粒的免疫学特性纳米生物技术领域的逐渐强大和制造合成技术的不断发展，表面功能化以及在生物医学应用中取得的重大进展，纳米金颗粒的免疫学特性引起了我们强烈的兴趣。这些在生物医学中的应用包括生物成像、基因诊断、分析传感、光热治疗肿瘤及各种靶向递送生物分子和化学药物。纳米金颗粒在递送系统中的应用主要是将需要递送的货物与金结合，通过有效的内吞机制将货物运送到靶细胞中。以下就从纳米金颗粒与免疫细胞的相互作用和纳米金颗粒的载体、佐剂效应进行介绍。1.3.4.1纳米金颗粒与免疫细胞的相互作用免疫系统中的动物免疫组织与细胞构成了纳米颗粒摄入机体的第一道屏障。因此，纳米金颗粒与吞噬细胞的相互作用、在细胞内的摄取、与免疫细胞的反应成为我们研究重点。Shukla(2005)、Lim(2008)和Zhang(2011)等人分别用3nm和60nmAuNPs作为研究对象，观察它们在RAW264.7巨噬细胞中的摄取情况。可以看出3nm和60nm大小的AuNPs都可以通过胞饮作用进入巨噬细胞，并分布于溶酶体和核周腔。从实验结果中也可以看出AuNPs具有生物相容性，无细胞毒性和非免疫原性。随后Guevel(2015)比较了12nm和2nm不同尺寸的AuNPs在诱导细胞介导的免疫应答时免疫细胞的变化情况。得出的结论是：12nm的AuNPs能刺激自然杀伤细胞（NK细胞）的产生，而2nm的AuNPs只能被细胞有效摄取，并不能引起树突状细胞（DCs）的成熟或淋巴细胞的增殖。Choietal(2007)和Dreadenetal(2012)的研究表明AuNPs的大小和不同结构并不影响巨噬细胞对AuNPs的摄取。这些都表明，AuNPs的大小不影响其被吞噬细胞摄取，但是对促炎性细胞因子的产生有一定的影响。AuNPs与可溶性蛋白质或其他生物分子之间的相互作用可形成蛋白质“晕”（Corona）(LynchandDawson2008)，蛋白质晕在调整AuNPs表面物理化学性质，如电荷，水合粒径和胶体稳定性等方面发挥着重要作用。事实上，它是AuNPs与蛋白质接触形成的第一层纳米生物界面，称为AuNPs-蛋白质晕。AuNPs-蛋白质晕能够决定AuNPs和活细胞之间的首次相互作用，可强烈影响细胞摄取。静脉注射后，这些蛋白质晕很大程度上决定了AuNPs在体内器官，组织和细胞的生物分布，细胞摄取和清除的效率，免疫学特性等(Braunetal.2016,Sasidharanetal.2016)。1.3.4.2纳米金颗粒的载体和佐剂效应有些研究表明，将完整的抗原与胶体金一起引入可促进抗体的产生(Terpstraetal.1990)，此外，一些半抗原在吸附到胶体金颗粒时可能也会引起抗体产生。抗体的产生是由具有活性结构即免疫原性的物质诱导的，这些物质包括蛋白质，多糖和一些合成的10 聚合物。然而，许多生物活性物质，如维生素，激素，抗生素，麻醉剂等具有相对较小的分子量，通常不会引起显著的免疫应答。通常需要将这些物质分子量小的半抗原物质与能够提高免疫应答的最佳载体（递送系统）结合来克服这一限制，这样才能获得特异性抗血清。经过多年研究，由于AuNPs具有较高的表面体积比，生物相容性和易于合成，因此完全可以作为载体来递送抗原物质。1986年，日本研究人员首次报道了以胶体金颗粒为载体成功产生抗谷氨酸的抗体(Shiosakaetal.1986)。随后，研究人员又相继用口蹄疫病毒(Chenetal.2009)、流感病毒(Kimetal.2001)、呼吸道合胞病毒(Niikuraetal.2013)、生物素(Moffettetal.1994)、重组肽(Dykmanetal.1996)等抗原物质直接与胶体金颗粒缀合，与完全弗氏佐剂或明矾混合，并用于动物免疫，结果均能获得高滴度的抗血清。用纳米金颗粒结合抗原免疫动物产生的特异性抗体水平高于经典佐剂产生的水平，而达到这种反应所需的抗原量比用标准佐剂免疫时低一个数量级。究其原因可能是由于抗原在纳米金颗粒表面富集，使更多的有效抗原递呈给免疫系统，从而使机体的免疫应答更加活跃从而提高相应的抗体水平。胶体金与抗原结合后（使用或不使用弗氏完全佐剂）进行动物免疫，可以产生针对各种抗原的特异性、高滴度的抗体，没有其他抗体的产生。与一些常规佐剂相比，AuNPs可以刺激实验动物抗体的合成，并且所需抗原的量减少，能够刺激淋巴细胞的吞噬活性并诱导炎性介质的释放，这些都表明AuNPs具有佐剂辅助性质。抗原一旦被AuNPs吸附或封装，即可作为佐剂优化接种后的免疫应答。已经发表的许多论文中讨论了AuNPs可用于靶向药物递送，都说明AuNPs的辅助性质可为设计下一代疫苗创造了有利条件。1.3.5纳米金颗粒在疫苗中的应用纳米技术在疫苗学中的应用，过去的十年中呈指数增长(Zhaoetal.2014)，不论是作为投递系统增强抗原加工，还是作为一种免疫刺激佐剂以期激活或强化免疫，该技术已在新型疫苗领域广泛应用。纳米免疫学是一种新的有前途，快速发展的新领域，尽管存在许多障碍，但我们在理解纳米粒子与免疫系统成分的相互作用中取得了重大进展。由于AuNPs有较高的表面体积比、良好的生物相容性和容易合成等优点；AuNPs能够激活促炎细胞因子的产生，表明AuNPs具有免疫刺激性；又可作为佐剂以提高疫苗的效力，刺激抗原呈递细胞并提供抗原的控制释放，因此它们被广泛用于改善不同抗原分子的递送和效力。通过各种物理或化学方法将抗原分子共价或非共价地连接到AuNPs上，然后将其控制释放到靶位点处，将其开发为有效的AuNPs-抗原疫苗。控制和激发对微生物的有效免疫应答的关键参数包括抗原密度和病原体表面上的分布。B和T细胞刺激和激活以及随后由浆细胞分泌抗原特异性抗体依赖于B细胞表面免疫球蛋白（B细胞受体，BCR）与病原体呈现的识别模式之间的有效交联。由AuNPs呈现的高密度和结构顺序的抗原阵列提供了与宿主细胞BCR之间可以同时结合的多个分子的情景。这种多价的分子与细胞的识别有利于有效地刺激相互作用网络，而不是由11 单一可溶性重组抗原提供的单价结合的较弱作用。实际上，由AuNPs-抗原提供的多价相互作用高亲合力构成了诱导强烈免疫反应的关键步骤。由于这些免疫优势和物理化学特性，AuNPs在新型疫苗的研究中备受关注。许多文献已经报导了使用AuNPs作为递送载体或佐剂开发方便简洁的疫苗。12 第二章纳米金颗粒（AuNPs）的制备与鉴定2.1引言AuNPs粒径为2～150nm，颗粒小，毒性低，免疫原性低，制备方法简单，规格（颗粒大小及形状）容易控制，具有良好的生物相容性并且能有效传递免疫原性物质，因此特别适合研究和加强疫苗接种。AuNPs的制备已经有很长时间的历史了，大家尝试利用各种方法已经能够成功制备出各种形状和大小的AuNPs。例如王慧娟等人就制备出各种形状的AuNPs，分别是球状、棒状、星状(王慧娟etal.2011)。Kimling等(2006)用硼氢化钠作为还原剂，通过控制硼氢化钠和四氯金酸的比例获得1～10nm的AuNPs。Turkevitch利用柠檬酸在水相中作为还原剂还原氯金酸，合成直径约为20nm的AuNPs。FrensG(1973)用柠檬酸三钠作为还原剂，通过控制四氯金酸和柠檬酸三钠的比例获得10～70nm的AuNPs。BrownLO(1999)用羟氨作为还原剂，制备70nm以上的AuNPs。本研究采用经典的Turkevitch还原法，旨在制备20～30nm的纳米金颗粒，并对其物理特性进行表征。2.2材料与方法2.2.1主要仪器设备表2-1主要仪器设备Table2-1Thelistofmainequipment仪器名称生产公司3K-18高速冷冻离心机Sigma公司层析实验冷柜北京博医康实验仪器有限公司JEM-1400透射电子显微镜日本HITACHI公司Evolution260Bio紫外线分光光度计美国Thermo公司动态光散射仪英国Malvern公司2.2.2主要试剂四水合四氯金酸（HAuCl4·4H2O）和柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）均购自Sigma公司；实验中全部使用双蒸水（ddH2O）。13 2.2.3纳米金颗粒的制备本实验所用的AuNPs是按照Turkevich用Na3C6H5O7·2H2O还原HAuCl4•3H2O的方法合成的。简单地说，将1mL1%HAuCl4（10mg/mL）加入到100mLddH2O中，加热至沸腾后将8mL的1%Na3C6H5O7·2H2O（10mg/mL）加入其中，当溶液颜色发生变化成透明酒红色后，室温静置5min，最后加入水将体积定容至100mL。随后，将红色溶液却至室温，0.22µm滤膜过滤，4℃保存备用。2.2.4纳米金颗粒的鉴定将所制备的AuNPs取出1mL送往河南中医药大学中医学院病理实验中心进行透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscope,TEM）观察，对其形状及大小进行直接观察。在本实验室用动态光散射（Dynamiclightscattering,DLS）仪器对所得AuNPs的粒径和Zeta电位进行表征。通过紫外-可见吸收光谱（Ultravioletvisiblespectroscopy,UV-Vis）扫描表面等离子体共振来监测AuNPs，在全波长400～700nm范围内进行扫描，测定AuNPs的最大吸收波长。2.3结果与分析2.3.1纳米金颗粒的鉴定将制备好的AuNPs用透射电子显微镜（TEM）扫描，电镜扫描结果如图2-1。由图表明，所制备的AuNPs形状规则，呈球状，粒径大小为25±1nm。图2-1AuNPs电镜观察结果Figure2-1DeterminationofAuNPsbyTEM将AuNPs用动态光散射（DLS）仪器进行粒径和Zeta电位检测，如图2-2所示，14 所制备的AuNPs粒径约为24.4nm，Zeta电位为-34.3mV。图2-2AuNPs粒径和Zeta电位检测结果Figure2-2DeterminationofAuNPsbyDLS将AuNPs用紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）在全波长400～700nm范围内进行扫描，如图2-3所示，AuNPs最大吸收峰（λmax）=523nm，最大吸光值（Amax）=2.130。图2-3AuNPs全波长检测结果Figure2-3DeterminationofAuNPsbyUV-Vis2.4讨论AuNPs制备的方法多种多样。通过改变发应物浓度、温度及孵育时间等条件可以制备出不同形状和大小的AuNPs(Chenetal.2005)。本试验通过最经典的Turkevich发明的柠檬酸钠还原法制备直径大约为25nm的AuNPs，该方法工艺简单、成本低廉(Katoetal.2007)。AuNPs由于其巨大的利用潜能被越来越多的科研学者所重视，它能有效传递免疫原性物质。AuNPs被用于疫苗递送，因为它们可加工成不同的形状（球状、棒状、管状等），可以用碳水化合物作表面修饰。通过抗原与表面相结合，金纳米杆（棒）已经用来作为呼吸道合胞病毒抗原的载体。其他类型的纳米金颗粒已经用来作为衍生于其他病毒如流感病毒和手足口病病毒的抗原的载体，或者作为人免疫缺陷病毒的DNA疫苗佐剂。15 2.5小结本试验利用经典的柠檬酸钠还原法成功制备出25nm左右的AuNPs，用于后续试验的进行。16 第三章CSFVE2蛋白的表达、纯化及鉴定3.1引言CSFV是单股正链RNA病毒，主要编码8个非结构蛋白和4个结构蛋白。选取CSFV的主要保护性抗原E2蛋白作为研究对象。本试验参照NCBI数据库中猪瘟病毒兔化弱毒疫苗（HCLV疫苗株）E2蛋白的氨基酸序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司将无核定位信号和去除跨膜区的CSFVE2蛋白的编码序列在大肠杆菌（E.coli）表达系统中进行密码子优化，并克隆到pUC57载体中。以pUC57-E2基因为模板，克隆至pET-28a原核表达载体中，得到重组质粒pET-28a-E2，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot结果显示，在43kDa处有一条与预期结果一致的蛋白条带，主要以包涵体形式存在，并能与CSFV阳性血清反应。将E2蛋白通过变性、纯化、复性后，得到可溶性E2蛋白。经过SDS-PAGE和Westernblot鉴定，在43kDa处出现的单一蛋白可以能被抗CSFV单克隆抗体识别，表明可以获得具有免疫原性的E2蛋白，为后续试验做好准备。3.2材料和方法3.2.1主要仪器设备表3-1主要仪器设备Table3-1Thelistofmainequipment仪器名称生产公司-20℃冰箱青岛海尔股份有限公司DW-HL540超低温冷冻储存箱中科美菱低温科技股份有限公司XUEKE制冰机IMS-100常熟市雪科电器有限公司SW-CJ-2F洁净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司ME204E电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司台式pH计瑞士Mettler-Toledo公司IS-RDV1立式单门双层恒温振荡器美国精骐有限公司ZHWY-100D恒温培养振荡器上海智城分析仪器制造有限公司调速型迷你离心机生工生物工程（上海）股份有限公司Nanodrop-1000超微量分光光度计美国Nanodrop公司PowerCyclerGradientSL梯度PCR仪德国Analytikjena公司17 PowerPac电泳仪美国BIO-RAD公司Mini-PROTEAN®Tetra电泳槽美国BIO-RAD公司半干转膜仪美国BIO-RAD公司VILBERFusionFX5凝胶成像仪法国VILBER公司超声波细胞破碎仪美国SONICS公司5840R高速台式离心机德国EPPENDORF公司微波炉美的集团IKAC-MAGMS4磁力搅拌器德国IKA公司POLARstarOmega全自动多功能酶标仪德国BMG公司培养箱日本三洋公司3.2.2质粒和菌株含CSFVE2基因的质粒pUC57-E2由上海生工生物工程股份有限公司合成，原核表达载体pET-28a由河南省动物免疫学重点实验室保存，大肠杆菌（E.coli）JM109购自TAKARA公司，BL21（DE3）购自TIANGEN公司。3.2.3主要试剂rTaqDNA聚合酶、DNAMarker（DL2000）均购自TAKARA公司，限制性内切酶BamHI和HindIII购自NEB公司，LigationhighVer.2连接酶购自TOYOBO公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪IgG抗体购自Sigma公司，SuperGelRed购自USEverbright公司，琼脂糖购自Invitrogen公司，免染胶购自北京爱普拜生物技术有限公司，IPTG、卡那霉素（Kana）、尿素、TRIS、浓HCL、1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）、1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）、APS、TEMED均购自索莱宝公司，CSFVE2阳性猪血清和CSFVE2单抗9①C7均由本实验室制备并保存，其他试剂均为进口或国产分析纯，引物由上海生工合成。小提质粒、胶回收试剂盒采购于Omega公司，ECL显色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均采购自北京索莱宝生物科技公司。3.2.4重组表达载体的构建与鉴定3.2.4.1目的蛋白基因序列的合成从NCBI数据库中查出所需要的CSFVHCLV基因序列（GenBank：AF531433），选取结构蛋白E2的编码序列（687-1031aa），将其345aa的序列送至上海生工生物工程股份有限公司，大肠杆菌表达系统基因优化编码基因并合成。目的基因两端分别引入BamHI和HindIII酶切位点。18 3.2.4.2引物设计以pUC57-E2基因为模板设计引物，具体序列如下表所示：表3-2PCR引物序列Table3-2ThesequencesofPCRprimer引物名称引物序列（5’-3’）上游引物CGGGATCCGCACAGGGTCGTCTGGCGT下游引物CCCAAGCTTGAATTCCGCAAAATAATCGGAGTG上下游引物的酶切位点分别为BamHI和HindIII，目的片段长度为1035bp。3.2.4.3酶切pUC57-E2质粒和pET-28a载体在37℃恒温水浴锅中用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行过夜双酶切，酶切体系（50µL）如下：表3-3酶切体系Table3-3Thesystemofenzymedigestion试剂体积pUC57-E2/pET-28a（1µg）4µL/12µLBamHI1µLHindⅢ1µL10×CutSmartbuffer5µLddH2O39µL/31µL酶切后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行酶切产物胶回收。3.2.4.4连接酶切后的E2基因片段和pET-28a载体片段经过胶回收、浓度测定，按照一定比例用LigationhighVer.2连接酶在16℃条件下连接1h。连接体系（15µL）如下表所示：表3-4连接体系Table3-4Thesystemofligation试剂体积E2基因片段3.5µLpET28a4µLLigationhighVer.2连接酶7.5µL3.2.4.5转化45µL的已经融化的JM109感受态细胞和5µL连接产物缓慢混匀，依此冰浴30min、42℃热击75s、冰浴5min后，加入500µL没有抗性的LB液体培养基，37℃振荡培养60min；3000rpm离心2min，弃部分上清；留下约50µL的菌液均匀涂在37℃提前预热的含卡那霉素（100g/L）的LB固体平板上。在培养箱中正置培养1h后，将平19 板倒过来培养过夜。需要注意整个转化过程动作要缓慢轻柔。3.2.4.6阳性重组质粒的筛选与鉴定挑取LB固体平板上的单克隆，接种到卡那霉素（100g/L）的5mLLB液体培养基中振荡过夜扩大培养。取1µL菌液作为PCR模板进行鉴定（反应体系如下所示），并进行琼脂糖凝胶电泳初步鉴定和测序最终鉴定，剩余菌液按照Mini质粒提取试剂盒操作说明提取质粒。将测序正确的质粒继续转入BL21（DE3）感受态细胞中（参照3.2.4.5转化步骤），挑取单克隆至含卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，取出少量菌液（1µL）作为PCR模板进行鉴定（反应体系也如下所示）。以1µL菌液为模板，扩增CSFVE2基因，PCR反应体系如表3-5所示：表3-5PCR反应体系Table3-5ThereactionsystemofPCR试剂体积模板1µL上游引物1µL下游引物1µLrTaq10µLddH2O8µLPCR反应条件如表3-8所示：表3-6PCR反应条件Table3-6TheconditionsofPCRreaction反应温度反应时间循环数94℃10min94℃30s65℃30s2572℃75s72℃7min16℃终止反应扩增结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定正确的阳性菌液用50%甘油保护冻存备用（-80℃）。3.2.5CSFVE2蛋白的诱导表达、可溶性分析及鉴定3.2.5.1诱导表达将冻存的阳性重组菌按照1:100的比例，即50µL冻存菌液加入到含卡那霉素（100g/L）的5mLLB液体培养基中37℃过夜培养进行第一次复苏。随即取出50µL第一次20 复苏的菌液按照1:100比例进行第二次活化2-3h，用1mMIPTG在25℃条件下诱导表达8h，直接收集菌液。3.2.5.2表达产物的可溶性分析分别取1mL诱导前和诱导后的菌液，离心（8000rpm，4℃，10min），弃上清，沉淀用10mMTris-HCl（pH8.0）重悬。超声破碎20min（5s破碎/5s休息，4℃），离心（12000rpm，4℃，10min），分别取上清和沉淀，沉淀用等体积（1mL）的10mMTris-HCl（pH8.0）重悬。将需要分析的上清和沉淀分别取40μL与10μL上样缓冲液充分混合，沸水煮样10min，瞬离作为上样样品；将提前制备好的蛋白胶安装好放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，加样孔中加入20μL待检样品；分别以80V电压（20min）、120V电压（大约为40min）进行电泳，直至完成；取出蛋白胶染色/脱色/观察结果并拍照。3.2.5.3表达产物Westernblot鉴定将可溶性分析出来的蛋白所在位置的上清或沉淀重复3.2.5.2中操作；电泳结束后，按滤纸-甲醇活化过的硝酸纤维素膜（Nitrocellulosefiltermembrane，NC膜）-凝胶-滤纸的顺序放入转膜仪，进行转膜（15V，50min）；转膜结束后，取NC膜4°C封闭过夜；经过PBST多次洗涤后，分别用CSFV阳性猪血清（1267血清，1:200）37°C一抗孵育1h，HRP标记的羊抗猪IgG（1:1000）37°C二抗孵育1h；最后将ECL显色液铺满整个NC膜进行显色观察结果并拍照。3.2.6CSFVE2蛋白变性、纯化、复性及活性鉴定3.2.6.1包涵体的变性及纯化（1）包涵体的制备：根据3.2.5.1中E2蛋白诱导条件准备500mL含目的蛋白的菌液，离心后用100mL10mMTris-HCl（pH8.0）重悬菌体。超声波冰浴裂解菌体（超声5s，间隙5s，工作次数10次循环），4℃，8000rpm离心20min，弃上清，沉淀即为包涵体，再用100mL100mMTris-HCl（pH8.0）重悬，-80℃冻存备用。（2）包涵体的变性：取出10mL包涵体8000rpm离心20min，弃上清，沉淀用等体积10mL的Lysisbuffer重悬,置于室温摇床上孵育1h,使其充分溶解变性。4℃，8000rpm离心20min去除不溶物，取上清用于下步纯化。（3）包涵体的纯化：Lysisbuffer裂解包涵体的上清，用镍填料纯化；①装柱：取5mL镍填料加入柱子中，使其靠重力自然沉降30min；②冲洗：用超纯水冲洗3个柱体积；③平衡：Lysisbuffer平衡3个柱体积；④上样：10mL变性产物上清，循环上样3次；⑤洗涤：Bindingbuffer冲洗3个柱体积；⑥洗脱：10mLElutionbuffer分管洗脱目的蛋白；21 ⑦再平衡：超纯水平衡3个柱体积，20%乙醇冲洗2个柱体积并充满填料，4℃保存。3.2.6.2包涵体复性取变性纯化后的E2蛋白装入截留量为7000kDa的透析袋中，放入含有1000mL6M尿素复性缓冲液的烧杯中，在4℃层析柜中用磁力搅拌透析。采用透析复性的方法，将透析袋依次置于含6M-4M-2M-1M-0M尿素的复性缓冲液中，每6h换低滴度的缓冲液，直至缓冲液中无尿素时终止。最后收集蛋白溶液，测定蛋白浓度，4℃保存备用。3.2.6.3复性蛋白SDS-PAGE鉴定复性后蛋白进行12%SDS-PAGE电泳，过程同上；3.2.6.4复性蛋白Westernblot鉴定将需要鉴定的复性蛋白电泳后转膜，过程同上；3.2.6.5复性蛋白活性检测将0.2mg/mL复性的CSFVE2重组蛋白按照不同浓度包被96孔微量滴定板，同时设立空白对照，4℃孵育过夜，常规ELISA方法进行检测。2.5%脱脂奶粉封闭，加入1:200稀释的CSFV单克隆抗体，37℃孵育1h；PBST洗涤5次后，加入1000倍稀释的羊抗鼠HRP-IgG，在37℃温箱中反应45min；PBST洗涤多次后，经过显色、终止显色、OD450值测定等步骤分析复性后E2蛋白的活性。3.3结果与分析3.3.1重组表达载体的构建与鉴定3.3.1.1pUC57-E2质粒和pET-28a载体酶切结果质粒pUC57-E2和载体pET-28a的酶切产物分别经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见第1、2个泳道出现1035bp左右的目的条带和2710bp左右的pUC57载体条带，第3个泳道是5369bp的pET-28a载体条带（图3-1），与预期大小一致。22 123M2000bp1000bp图3-1pUC57-E2质粒和pET-28a载体酶切结果M:DNA标准DL2000;1-2:pUC57-E2酶切产物;3:pET-28a酶切产物;Figure3-1EnzymedigestionofplasmidpUC57-E2andvectorpET-28aLaneM:DNAMarkerDL2000;Lane1-2:EnzymedigestionproductsofpUC57-E2;Lane3:EnzymedigestionproductsofpET28a3.3.1.2重组质粒的构建与鉴定结果将质粒pUC57-E2及载体pET-28a双酶切产物回收后进行连接，得到pET28a-E2重组质粒。经过转化、涂板和菌液PCR鉴定显示，以菌液为模板扩增得到1035bp左右的条带（图3-2），同时将阳性克隆菌液进行测序，序列与原基因序列100%相符。继而将测序正确的克隆质粒转化进入BL21（DE3）感受态细胞，挑取5个单菌落扩大培养，重复上述菌液PCR过程。凝胶结果显示，扩增得到E2蛋白的目的基因（图3-3），重组表达质粒pET28a-E2构建成功。M1234562000bp1000bp图3-2JM109-pET28a-E2菌液PCR鉴定M:DNA标准DL2000;1:阴性对照;2-6:JM109-pET28a-E2单菌落;Figure3-2IdentificationofJM109-pET28a-E2byPCRLaneM:DNAMarkerDL2000;Lane1:Negativecontrol;Lane2-6:thesinglecolonyofJM109-pET28a-E2strains23 M1234562000bp1000bp图3-3BL21（DE3）-pET28a-E2菌液PCR鉴定M:DNA标准DL2000;1-5:JM109-pET28a-E2单菌落;6:阴性对照;Figure3-3IdentificationofrecombinantplamidsBL21（DE3）-pET28a-E2byPCRLaneM:DNAMarkerDL2000;Lane1-5:thesinglecolonyofBL21（DE3）-pET28a-E2strains;Lane6:Negativecontrol3.3.2CSFVE2的诱导表达及分子生物学分析3.3.2.1表达产物SDS-PAGE鉴定及可溶性分析将鉴定为阳性的菌落扩大培养后，在25℃，1mMIPTG的条件下诱导8h，经过SDS-PAGE跑胶、染色、脱色后可观察到在约为43kDa处出现一条单一的条带，与预期蛋白大小一致。经过上清和沉淀的可溶性分析，结果显示90%的E2蛋白主要以包涵体的形式存在（图3-4）。通过对E2蛋白表达过程中温度、时间和IPTG浓度条件的摸索，发现仍然以包涵体形式存在，优化E2蛋白的可溶性表达条件并没有达到理想的效果（图略）。M1234555kDa43kDa图3-4重组E2蛋白的SDS-PAGE鉴定M:蛋白质分子量标准;1:pET28a空载;2:IPTG未诱导;3:IPTG诱导;4:超声后上清;5:超声后沉淀;Figure3-4TheresultofE2proteinbySDS-PAGELaneM:Proteinmolecularweightmarkers;Lane1:pET28avectorcontrol;Lane2:IPTGnon-induced;Lane3:InducedbyIPTG;Lane4:Supernatantaftersonication;Lane5:Precipitateaftersonication3.3.2.2表达产物Westernblot鉴定以CSFV阳性猪血清对表达产物进行Westernblot鉴定，如图3-5可以看出，表达24 产物与CSFV阳性猪血清（1267血清）能很好的反应，并且条带大小显示是预期的目的蛋白（图3-5）。M1255kDa43kDa图3-5重组E2蛋白的WB鉴定M:蛋白质分子量标准;1:IPTG诱导超声后沉淀;2:pET28a空载;Figure3-5TheresultofE2proteinbyWBLaneM:Proteinmolecularweightmarkers;Lane1:TheprecipitateofrecombinantE2subunitaftersonicationinducedbyIPTG;Lane2:pET28avectorcontrol3.3.3CSFVE2蛋白复性及抗原活性鉴定3.3.3.1重组蛋白纯化及复性结果对包涵体溶解变性后使用镍柱纯化，随后将纯化变性的重组E2蛋白按照尿素梯度递减法进行透析复性，直到无尿素时终止，进行SDS-PAGE电泳鉴定，并用蛋白测定试剂盒测定复性蛋白浓度。结果显示在约43kDa处出现单一条带，表明CSFVE2包涵体蛋白经变性、纯化、复性后效果良好（图3-6），复性后蛋白浓度为0.2mg/mL。25 M1234555kDa43kDa图3-6纯化重组E2蛋白的SDS-PAGE鉴定M:蛋白质分子量标准;1:IPTG诱导超声后沉淀;2:8M尿素溶解包涵体;3:上样流出液;4:纯化的变性E2蛋白;5:用尿素梯度透析法复性后蛋白Figure3-6TheresultofthepurifiedE2proteinbySDS-PAGELaneM:Proteinmolecularweightmarkers;Lane1:TheprecipitateofrecombinantE2subunitaftersonicationinducedbyIPTG;Lane2:inclusionbodydegenerationwith8Murea;Lane3:sampleeffluent;Lane4:purifieddenaturedE2protein;Lane5:refoldingproteinwithureagradient以CSFVE2单抗9①C7对复性产物进行Westernblot鉴定，图3-7可以看出在34kDa处有单一条带能够与特异性9①C7抗体所识别，与目的蛋白大小一致。M1255kDa43kDa图3-7复性E2蛋白的WB鉴定M:蛋白质分子量标准;1:pET28a空载;2:复性后E2蛋白;Figure3-7TheresultoftherefoldingE2proteinbyWBLaneM:Proteinmolecularweightmarkers;Lane1:pET28avectorcontrol;Lane2:purifiedrefoldingE2protein.3.3.3.2复性蛋白活性检测经过常规ELISA方法将E2蛋白抗原梯度包被、封闭、一抗二抗孵育、显色、终止26 读数后，如图3-8所示，当E2蛋白浓度为4µg/mL时，OD450数值在1.0以上，说明复性后的E2反应性良好。随着E2蛋白包被浓度的增加，与CSFV单克隆抗体的反应强度也逐渐增加。图3-8复性E2蛋白的活性检测Figure3-8TheactivityresultofE2proteinbyELISA3.4讨论E2蛋白作为研究CSFV结构疫苗的重要靶标，很多研究人员通过不同的表达系统表达CSFVE2蛋白用于该病毒亚单位疫苗的研究，其中最常用的是大肠杆菌表达外源基因。虽然大肠杆菌表达具有很多优点而被人们广泛应用，但是其表达出来的外源蛋白大都以包涵体形式存在，要想获得具有良好生物活性的蛋白，必须通过复性过程使结构不正确的包涵体蛋白进行重折叠。整个流程的技术难点是如何才能使包涵体蛋白在变性条件下重折叠成与天然蛋白一样的结构，并且具有天然活性。本研究通过大肠杆菌表达系统表达出E2蛋白包涵体，通过尝试透析复性、稀释复性等各种方法制备具有生物活性的E2蛋白。经过SDS-PAGE、Westernblot和ELISA检测，我们能够得到可溶性、具有生物活性的E2蛋白。但是制备的蛋白浓度较低，除了浓缩提高蛋白浓度之外，如何获得可溶性E2蛋白还有待进一步研究。3.5小结本试验通过大肠杆菌原核表达系统成功构建pET28a-E2蛋白重组表达载体并诱导表达CSFVE2蛋白，主要以包涵体形式存在。经过尿素梯度透析复性方法制备出浓度为0.2mg/mL，具有良好生物活性的E2蛋白。27 第四章纳米金颗粒-E2蛋白颗粒抗原（E2-AuNPs）的制备及物理表征4.1引言纳米金颗粒（AuNPs）不仅可以作为投递系统增强抗原加工，还可以作为一种免疫刺激佐剂激活或强化免疫。AuNPs由于其本身特性能够稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性没有明显改变。因此，AuNPs常常被用于疫苗递送。AuNPs与可溶性蛋白质之间的相互作用可形成蛋白质“晕”（Corona），蛋白质晕是AuNPs与蛋白质接触形成的第一层纳米生物界面，称为AuNPs-蛋白质晕。AuNPs-蛋白质晕可强烈影响细胞摄取。静脉注射后，这些AuNPs-很大程度上决定了蛋白质晕在体内器官，组织和细胞的生物分布，细胞摄取和清除的效率并可显著提高机体针对该蛋白的特异性抗体的产生。本试验通过简单的方法将粒径为25nm的AuNPs与具有生物活性的CSFVE2蛋白相混合，制备纳米金颗粒-E2蛋白颗粒抗原（E2-AuNPs）复合物，为进一步探究AuNPs在猪瘟亚单位疫苗中的载体效应做准备。4.2材料和方法4.2.1主要仪器设备表4-1主要仪器设备Table4-1Thelistofmainequipment仪器名称生产公司3K-18高速冷冻离心机Sigma公司层析实验冷柜北京博医康实验仪器有限公司JEM-1400透射电子显微镜日本HITACHI公司Evolution260Bio紫外线分光光度计美国Thermo公司动态光散射仪英国Malvern公司4.2.2主要试剂及试剂盒10%NaCl:天平称取10gNaCl粉末完全溶解于含100mL去离子水的广口瓶中，4℃保存备用。28 BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索来宝。4.2.3E2-AuNPs颗粒抗原的制备取1mL粒径为25nm的AuNPs与1mL复性成功的CSFVE2蛋白（0.2mg/mL）在4℃条件下来回颠倒混合搅拌1h，17,000g4℃离心30min除去多余未与AuNPs结合的蛋白，收集上清用蛋白浓度试剂盒间接测定结合在AuNPs上的E2蛋白浓度，沉淀用50μL10mMTris-HCl（pH8.0）重悬。即可成功制备E2-AuNPs颗粒抗原，并于4℃保存备用。4.2.4E2-AuNPs颗粒抗原的物理表征将所制备的E2-AuNPs复合物用10%NaCl进行稳定性测定并取出1mL送往河南中医药大学中医学院病理实验中心进行透射电子显微镜（TEM）观察，对其形状和大小进行直观观察。用动态光散射（DLS）仪器对所得E2-AuNPs的粒径和Zeta电位进行表征。通过紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）扫描表面等离子体共振来检测E2-AuNPs，在全波长400～700nm范围内进行扫描，测定E2-AuNPs的最大吸收波长并与AuNPs进行对比。4.3结果与分析4.3.1E2-AuNPs颗粒抗原的物理表征通过加入10%NaCl可知，AuNPs周围已完全被E2蛋白包裹保护，不可被盐离子所破坏，如图4-1所示，其特征峰未发生改变。因此1mLAuNPs与1mLE2蛋白混合即可成功制备具有良好稳定性的E2-AuNPs颗粒复合物。图4-1E2-AuNPs的稳定性测定Figure4-1Theconjugatestabilitywasassessedby10%NaCl将制备好的E2-AuNPs用透射电子显微镜（TEM）观察，电镜观察结果如图4-2，偶联E2蛋白后的AuNPs周围围绕一圈蛋白晕，形状规则，呈球状。29 图4-2E2-AuNPs电镜观察结果Figure4-2DeterminationofE2-AuNPsbyTEM将E2-AuNPs用动态光散射（DLS）仪器进行粒径和Zeta电位检测，如图4-3所示，偶联E2蛋白后的AuNPs粒径由24.4nm增加至78.8nm，Zeta电位由-34.3mV增加至-26.1mV。图4-3E2-AuNPs粒径和Zeta电位检测结果Figure4-3DeterminationofE2-AuNPsbyDLS将E2-AuNPs用紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）在全波长400～700nm范围内进行扫描，如图4-4所示，偶联E2蛋白后的AuNPs最大吸收波长由λmax=523nm迁移至530nm。30 图4-4E2-AuNPsUV-Vis检测结果Figure4-4DeterminationofE2-AuNPsbyUV-Vis用TEM、DLS和UV-Vis进行表征，以上数据均表明AuNPs与E2蛋白成功偶联并且形成稳定的颗粒复合物。4.4讨论蛋白与AuNPs可以通过一系列的作用力结合在一起，只要包括电荷作用、亲疏水作用力和抗原蛋白与AuNPs形成稳定的巯基作用等，蛋白与AuNPs偶联之后需要进一步鉴定是否连接成功以便进入后续试验的研究。AuNPs与E2蛋白偶联时需要按照多大的比例是我们前期需要摸索的。因为在AuNPs量一定时，E2蛋白量不足不能使AuNPs处于饱和条件，这样形成的复合物易被高盐（10%NaCl）破坏，结构不稳定；当E2蛋白量过多时，造成可溶性蛋白不必要的浪费。因此，选择合适比例的E2蛋白和AuNPs对于制备稳定的蛋白-AuNPs抗原复合物都是必要的。本试验通过前期条件摸索，当1mLAuNPs与1mLE2蛋白（0.2mg/mL）混合偶联时，能使AuNPs处于饱和或过饱和，足以抵挡10%NaCl对其破坏，并可成功制备E2-AuNPs颗粒抗原复合物，对其进行物理表征用于后续试验的研究。4.5小结本试验通过简单的混合成功制备出E2-AuNPs颗粒抗原复合物，并对其进行物理表征，表明E2蛋白与AuNPs偶联成功，可以形成比较稳定的抗原复合物。31 第五章E2-AuNPs抗原复合物的生物学评价5.1引言有研究表明病毒样颗粒易被巨噬细胞吞噬递呈给免疫系统，进而激发免疫效应(Roldãoetal.2010)。本研究猜想，以具有良好生物相容性且低毒性的AuNPs作为介质，使CSFVE2蛋白多重展示于AuNPs表面，形成类似于病毒样颗粒形状的抗原复合物。这种复合物能否影响连接在其上蛋白的活性，能否激发免疫效应呢？因此本试验将制备好的E2-AuNPs颗粒抗原复合物在体外进行一系列的生物学评价。首先通过ELISA测定E2-AuNPs颗粒抗原复合物的E2蛋白活性，并与游离E2蛋白活性进行对比。其次由于机体进行免疫应答的第一步是APCs对抗原物质的摄取，因此我们选择RAW264.7巨噬细胞和DC2.4树突状细胞作为模型来评估在体外对E2蛋白的摄取情况。我们也对E2-AuNPs颗粒抗原复合物的毒性进行评估，判断其是否适合作为抗原载体用于动物试验，为后续需要进行的动物免疫试验奠定基础。5.2材料和方法5.2.1主要仪器设备表5-1主要仪器设备Table5-1Thelistofmainequipment仪器名称生产公司CO2细胞培养箱Thermo公司SW-CJ-2F洁净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司光学显微镜德国Leica公司荧光倒置显微镜德国Leica公司5.2.2主要试剂异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗鼠二抗购自Jackson公司，DC2.4树突细胞和RAW264.7巨噬细胞购自ATCC细胞库，青霉素和链霉素购自Hyclone公司，胎牛血清（FBS）购自GIBCO、DMEM培养基、胰酶、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）均购自北京索莱宝公司，CSFV阳性猪血清（1267血清）由本实验室保存。32 5.2.3E2-AuNPs抗原活性检测通过ELISA测定E2-AuNPs的生物学活性，使E2-AuNPs颗粒复合物中结合在AuNPs上E2蛋白的浓度与CSFVE2重组复性蛋白浓度保持一致并对其抗原活性进行对比。详细操作过程如下：E2-AuNPs复合物用碳酸盐缓冲液（CBS，pH9.6）连续稀释2倍，包被在96孔微量滴定板上，同时设置空白对照，在4℃下孵育过夜。2.5％脱脂奶粉封闭后，将CSFV阳性猪血清按1:200的比例加入孔中，然后在37℃孵育1h。用PBST洗涤5次后，加入1：1000倍稀释的羊抗猪HRP-IgG在37℃温箱中孵育45min。PBST洗涤5次后，TMB/H2O2显色试剂显色后测OD450值，分析E2-AuNPs复合物的抗原活性。5.2.4细胞毒性试验使用细胞计数Kit-8试剂盒评估E2-AuNPs的细胞毒性。将RAW264.7巨噬细胞和DC2.4树突细胞分别以5×103个细胞/孔（100μL）接种在96孔细胞培养板中，在37℃，5%CO2的培养箱中培养2h使细胞贴壁。细胞贴壁后，加入100μL不同浓度的E2-AuNPs与细胞共同孵育24h。然后，弃去培养基，每孔加入100μL含有10％CCK-8试剂的新鲜培养基。培养板在温箱中继续孵育4h。最后使用酶标仪在450nm处的读取吸光值。5.2.5细胞吞噬试验通过间接免疫荧光试验（IFA）检测抗原递呈细胞（APCs）RAW264.7和DC2.4细胞对E2蛋白和E2-AuNPs的摄取情况。将RAW264.7巨噬细胞和DC2.4树突细胞以25个细胞/孔（500μL）的密度接种24孔培养板，在37℃，含5%CO×102的培养箱中培养过夜。用DMEM培养基将E2蛋白和含有相同E2蛋白量的E2-AuNPs稀释2倍，每孔加入100μL至细胞培养板中共同孵育1h。弃掉培养基，经过PBST洗涤3次后，用提前放入4℃冰箱预冷的甲醇将细胞在室温条件下固定10min。PBST洗涤3次，用2.5%脱脂奶粉4℃过夜封闭，将细胞与抗CSFV单克隆抗体9①C7在37℃条件下共同孵育1h。PBST洗涤3次，用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗鼠二抗在37℃条件下孵育45min。PBST洗涤3次，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）按1:1000稀释进行37℃染核15min，最后用荧光显微镜进行观察。5.3结果与分析5.3.1E2-AuNPs抗原活性检测用与E2蛋白浓度一样的E2-AuNPs颗粒复合物作为抗原依次梯度稀释包被酶标板，检测E2-AuNPs颗粒复合物的生物学活性，并与E2蛋白的生物活性进行对比。如图5-133 所示，与E2蛋白显示结果一致，当E2-AuNPs中E2蛋白浓度为4μg/mL时，阳性值在1.0以上，阴性值全部都在0.06以下，随着包被原浓度的增加，OD450值呈上升的趋势。因此，E2-AuNPs颗粒复合物与E2蛋白具有几乎相同的抗原活性。图5-1E2-AuNPs的ELISA检测结果Figure5-1ELISAresultofE2-AuNPs5.3.2细胞毒性试验通过CCK-8试剂盒检测AuNPs对RAW264.7巨噬细胞和DC2.4树突状细胞的细胞毒作用，如图5-2所示：即使AuNPs浓度高达50μg/mL，对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒作用并不明显。在DC2.4树突状细胞中，只有当AuNPs浓度高达50μg/mL时，才对细胞有显著的（P<0.01）细胞毒性作用。该体外数据表明24.4nm直径的AuNPs是安全载体。图5-2E2-AuNPs的细胞毒性检测结果Figure5-2CytotoxicityresultofE2-AuNPstoAPCs5.3.3细胞吞噬试验我们使用RAW264.7巨噬细胞和DC2.4树突状细胞评估E2蛋白体外摄取情况。如图5-3IFA检测结果显示，无论在RAW264.7巨噬细胞还是DC2.4树突状细胞中，E2-AuNPs组与E2蛋白组相比具有更高的荧光强度。表明当E2蛋白被吸附在AuNPs34 上时，更多的E2蛋白可被抗原递呈细胞内化，则24.4nm直径的AuNPs增加了内化到抗原递呈细胞中E2蛋白的量。从图中也可以看出E2蛋白主要分布在细胞质，而不是细胞核中。图5-3E2-AuNPs的细胞吞噬检测结果Figure5-3UptakeresultofE2-AuNPsbyAPCs5.4讨论AuNPs具有生物相容性，无细胞毒性和无免疫原性，因此它们是疫苗递送的良好载体。AuNPs由于其本身特性，可以通过简单的混合迅速吸附蛋白质，并且吸附到AuNPs上的蛋白质生物活性与游离蛋白的生物活性几乎一致，不会因为蛋白与AuNPs的结合而受到影响。AuNPs可以在抗原到达免疫细胞发挥免疫应答的过程中发挥加强提呈细胞摄取的作用(Smithetal.2013)，也可以作为免疫佐剂发挥增强免疫应答的作用(Bolhassanietal.2011)。因此本试验通过体外试验对其细胞毒性、细胞吞噬试验及偶联蛋白之后的蛋白活性进行验证。5.5小结本试验通过ELISA、细胞毒性试验及IFA对E2-AuNPs的生物学进行评价，发现E2-AuNPs与E2蛋白具有相同的抗原活性，内化到抗原递呈细胞中的抗原量多于E2蛋白组，且AuNPs不会对抗原递呈细胞产生细胞毒作用。35 第六章猪瘟病毒CSFVE2蛋白纳米疫苗的免疫学评价6.1引言AuNPs可将需要递送的抗原与其结合，通过有效的内吞机制将抗原运送到靶细胞中。AuNPs已被用作口蹄疫病毒(Chenetal.2010)和EBV等(Cheungetal.2009)抗原递送载体，通过将抗原蛋白缀合到AuNPs表面从而诱导比单独的可溶抗原产生更高的抗体水平。本研究以期获得CSFVE2蛋白的新型纳米颗粒疫苗，前期的体外试验表明E2-AuNPs与E2蛋白具有相同的抗原活性，内化到抗原递呈细胞中的抗原量多于游离E2蛋白组，且AuNPs不会对抗原递呈细胞产生细胞毒作用。因此本试验将通过动物试验来评估CSFVE2蛋白纳米疫苗的免疫效果。6.2材料和方法6.2.1试验动物6周龄的BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心。6.2.2主要试剂及试剂盒弗式完全佐剂/弗式不完全佐剂（FA）均购自Sigma公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠IgG抗体购自Jackson公司，RPMI-1640培养基、细胞计数Kit-8试剂盒、各种动物脾脏淋巴细胞分离液试剂盒均购自北京索莱宝生物科技公司，5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’序列的胞嘧啶磷酸-鸟嘌呤-寡聚脱氧核苷酸（CpG）1826由Takara公司合成。6.2.3疫苗配制及分组情况E2蛋白与E2-AuNPs疫苗制备情况详细见第二章和第三章。将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分配6组，每组5只。为了探索AuNPs是否能够增强不同类型佐剂中的抗体水平，我们使用了两种动物实验中最常用的不同类型的佐剂，分别是可溶性Th1型佐剂CpG和油状弗氏佐剂。具体免疫分组情况如表6-1所示：36 表6-1小鼠免疫分组Table6-1GroupingofBALB/cmice分组疫苗成分免疫体积1E2100μL2E2-AuNPs100μL3E2-CpG100μL4E2-AuNPs-CpG100μL5E2-弗式佐剂100μL6E2-AuNPs-弗式佐剂100μL每组相应的疫苗混合物100μL中含有60μgE2，25μgCpG或50μgAuNPs，将其乳化制备成免疫原，分别对BALB/c小鼠进行背部皮下多点注射免疫。初次免疫3周后，用相同的疫苗成分进行第二次加强免疫。分别在免疫后0d，21d，42d通过尾静脉收集血清，49d分离小鼠脾脏淋巴细胞进行免疫效果评价。6.2.4小鼠免疫效果评价6.2.4.1抗体水平检测通过ELISA测定抗体滴度来分析抗原特异性抗体的存在。将E2蛋白用pH为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10μg/mL包被在96孔微量滴定板上（50μL/孔），4℃孵育过夜。用2.5％脱脂奶粉封闭后，将1000倍稀释的血清样品（100μL/孔）加入孔中，然后在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤5次后，每孔加入100μL1：1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h。用PBST洗涤5次后，将提前按1:1体积比配制好的底物显色A液和底物显色B液的混合液加入孔中（50μL/孔）室温条件下暗室中孵育10min显色，最后加入2MH2SO4终止反应。使用ELISA酶标仪在450nm处读取OD值，根据OD值分析小鼠体内抗体水平。每组中的5个数据取其平均值，并通过t检验统计分析。6.2.4.2T淋巴细胞增殖试验使用CCK-8试剂盒进行淋巴细胞增殖测定。在小鼠第一次免疫49d时，根据各种动物脾脏淋巴细胞分离液试剂盒（Solarbio，Beijing，China）的操作说明，从各组中选取3只小鼠的脾脏进行淋巴细胞分离。将分离的脾细胞悬液离心后以5×105个细胞/mL重悬浮于含有10％FBS的RPMI-1640完全培养基中。将脾细胞以100μL/孔接种到96孔细胞培养板中，并用100μL含E2蛋白（20μg/mL）的完全培养基和100μL完全培养基进行刺激。在37℃细胞培养箱中孵育48h后，弃去培养基，每孔加入100μL含有10％CCK-8试剂的新鲜培养基。培养板在37℃培养箱内再孵育4h。随后，使用酶标仪测定在450nm处的吸光值。用下面公式计算刺激指数（SI）：SI=（E2蛋白刺激孔37 的OD450nm值的平均值）/（完全培养基处理的孔OD450nm值的平均值）。6.3结果与分析6.3.1小鼠抗体水平检测通过使用E2蛋白作为包被抗原进行ELISA测定免疫小鼠血清中的E2蛋白特异性抗体水平，结果如图6-1。ELISA结果显示随着免疫天数的增加，小鼠血清中的E2蛋白特异性抗体水平呈上升趋势，在0d免疫小鼠的血清中几乎检测不到E2蛋白特异性抗体。在21d免疫小鼠的血清中，使用弗式佐剂的E2蛋白组和E2-AuNPs组均检测到E2蛋白特异性抗体，并且E2-AuNPs组产生的针对E2蛋白特异性抗体水平比E2蛋白组高，且差异显著（P<0.05）；而在不使用佐剂和使用CpG佐剂的情况下，抗体水平均没有明显变化。在42d免疫小鼠的血清中，使用弗式佐剂的E2蛋白组和E2-AuNPs组的E2蛋白特异性抗体水平进一步提高，且E2-AuNPs组产生的针对E2蛋白特异性抗体水平比E2蛋白组高，且相比差异显著（P<0.05）；在不使用佐剂时，E2-AuNPs组也比E2蛋白组产生的抗体水平高，且差异显著（P<0.05）；在使用CpG佐剂的情况下，E2-AuNPs组比E2蛋白组抗体水平高，且差异极显著（P<0.01）。总之从图中可看出，无论在有无佐剂的情况下，E2-AuNPs组中E2蛋白特异性抗体水平较高；两种佐剂相比，弗式佐剂对于提高E2蛋白特异性抗体水平较有效。这些数据表明，AuNPs可增强机体产生良好的免疫应答反应。图6-1小鼠的抗体水平检测Figure6-1DetectionofantibodylevelbyELISA38 6.3.2T淋巴细胞增殖试验为了评估E2-AuNPs对小鼠T细胞增殖的影响，在免疫后49d测量了E2蛋白特异性淋巴细胞增殖反应，如图6-2。E2-AuNPs组比E2蛋白组或AuNPs组诱导着更高的刺激指数（SI），说明AuNPs可有效的协助E2蛋白刺激小鼠机体产生淋巴细胞增殖反应。图6-2在免疫后49d检测淋巴细胞增殖反应Figure6-2Detectionoflymphocyteproliferationresponsesat49daysafterimmunization6.4讨论AuNPs的颗粒性质能够增强和促进抗原递呈细胞对抗原的吸附，通过将E2蛋白转运到抗原递呈细胞中而起到载体作用，从而增强抗原加工途径，获得更强的E2蛋白特异性免疫应答。AuNPs-抗原复合物比游离可溶性抗原能引起更高的抗体水平，因此，AuNPs可作为有效的投递载体，促使可溶性抗原快速运送至动物靶器官，产生良好的免疫应答反应。可溶性抗原和载体固定化抗原的组合对于设计基于抗原载体系统的疫苗至关重要，并且是一种简单而有效的免疫方法。6.5小结本试验数据分析表明：无论在有无佐剂的情况下，AuNPs可以显著提高E2蛋白特异性抗体水平，并且能有效的协助E2蛋白刺激小鼠机体产生淋巴细胞增殖反应。39 全文总结1.将CSFVE2蛋白基因片段与原核表达载体pET28a连接，构建重组表达载体pET28a-E2，并实现了CSFVE2蛋白的包涵体表达、纯化和复性，获得具有生物活性的E2蛋白。2.采用Turkevich方法成功制备粒径为24.4nm的AuNPs，通过简单的混合与E2蛋白成功制备E2-AuNPs抗原复合物，并对AuNPs与E2-AuNPs进行物理表征。表明E2蛋白可与AuNPs形成稳定的抗原复合物。3.对制备成功的E2-AuNPs抗原复合物通过ELISA、细胞毒性试验、间接免疫荧光试验及淋巴细胞增殖试验进行生物学评价和动物免疫效果评价。结果表明，AuNPs可作为一种良好的抗原递呈载体提高可溶性蛋白的免疫应答。该研究为AuNPs多重展示抗原用于疫苗开发提出了一种新思路，并奠定了一定的理论与实践基础。40 参考文献蔡宝祥.2001.家畜传染病学.中国农业出版社:陈溥言.2011.兽医传染病学第五版.农业出版社:代兴国.2006.重组E2蛋白在猪瘟的检测及免疫方面的应用研究.中国农业科学院董守安,唐春.2005.DNA识别、生物传感器和基因芯片中的纳米金和银粒子.贵金属,26(1):53-61胡刚叶,苌生科,庄金山,白朝勇,张许科.2012.表达CSFVE2蛋白重组AcNPV载体的构建.中国兽药杂志,46(11):1-5李文良,毛立,张纹纹,杨蕾蕾,王小敏,江杰元.2013.猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定.江苏农业学报,29(2):341-345梁晶晶.2010.猪瘟病毒E2蛋白的原核表达与纯化及多克隆抗体制备.[硕士学位论文].广西:广西大学栾培贤,肖建华,赵靓,王洪斌.2013.猪瘟国内外流行情况概述.东北农业大学学报,44(9):155-160涂长春.2003.猪瘟国际流行态势、我国现状及防制对策.中国农业科学,36(8):955-960王海震,李学仁,冯秀丽,陈溥言.2005.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原域的高效表达及间接ELISA方法的初步建立.中国生物工程杂志,25(1):81-85王慧娟,薛晨阳,袁艳玲.2011.金纳米颗粒制备及其光学特性研究.传感技术学报,24(1):14-17王启宇,兰邹然,姜平,张月,刘娟.2012.猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达.动物医学进展,33(9):66-69吴海祥,张楚瑜,郑从义,王家富,潘兹书,李蕾,曹晟,伊光辉.2003.构建猪瘟病毒致细胞病变的PK-15细胞模型.科学通报,48(8):822-826徐学清.2004.猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白主要抗原区基因在巴斯德毕赤酵母中的表达和初步应用.[硕士学位论文].南京:南京农业大学姚文生,范学政,王琴,宁宜宝.2011.我国猪瘟流行现状与防控措施建议.中国兽药杂志,45(9):44-47殷震,刘景华.1997.动物病毒学-2版.科学出版社:余兴龙,涂长春,徐兴然,张茂林,陈义祥,刘伯华.2003.猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性.生物工程学报,19(4):439-443张文杰,李向东,赵铁柱,邓小雨,胡冬梅,孙明,遇秀玲,陈西钊,田克恭.2007.猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达.中国实验动物学报,15(1):30-34周景明,李鹏飞,张改平,祁艳华,裴艳艳,扣莉云,蒋敏,王爱萍.2015.猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及其可溶性分析.西北农业学报,24(11):24-28Bastús,N.G.,E.Sánchez-Tilló,S.Pujals,C.Farrera,C.López,E.Giralt,A.Celada,J.Lloberas,V.Puntes.2009a.Homogeneousconjugationofpeptidesontogoldnanoparticlesenhancesmacrophageresponse.AcsNano,3(6):1335-1344Bastús,N.G.,E.Sáncheztilló,S.Pujals,C.Farrera,M.J.Kogan,E.Giralt,A.Celada,J.Lloberas,V.Puntes.2009b.Peptidesconjugatedtogoldnanoparticlesinducemacrophageactivation.MolecularImmunology,46(4):743-748Bolhassani,A.,S.Safaiyan,S.Rafati.2011.Improvementofdifferentvaccinedeliverysystemsforcancertherapy.MolecularCancer,10(1):3Braun,N.J.,M.C.Debrosse,S.M.Hussain,K.K.Comfort.2016.Modificationoftheprotein41 corona-nanoparticlecomplexbyphysiologicalfactors.MaterSciEngCMaterBiolAppl,64(34-42Brown,L.O.,J.E.Hutchison.1999.ControlledGrowthofGoldNanoparticlesduringLigandExchange.J.am.chem.soc,121(4):882-882Chang-Chun,T.U.2003.Classicalswinefever:internationaltrend,Chinesestatusandcontrolmeasures.ScientiaAgriculturaSinica,Chen,Y.,X.Gu,C.G.Nie,Z.Y.Jiang,Z.X.Xie,C.J.Lin.2005.Shapecontrolledgrowthofgoldnanoparticlesbyasolutionsynthesis.ChemicalCommunications,33(33):4181-4183Chen,Y.S.,Y.C.Hung,I.Liau,G.S.Huang.2009.AssessmentoftheInVivoToxicityofGoldNanoparticles.NanoscaleResearchLetters,4(8):858-864Chen,Y.S.,Y.C.Hung,W.H.Lin,G.S.Huang.2010.Assessmentofgoldnanoparticlesasasize-dependentvaccinecarrierforenhancingtheantibodyresponseagainstsyntheticfoot-and-mouthdiseaseviruspeptide.Nanotechnology,2119):195101Cheung,W.H.,S.F.Chan,H.W.Pang,M.K.Wong,Z.H.Guo,K.H.Tam,C.M.Che,C.L.Lin,W.Y.Yu.2009.ConjugationofLatentMembraneProtein(LMP)-2EpitopetoGoldNanoparticlesasHighlyImmunogenicMultipleAntigenicPeptidesforInductionofEpstein−BarrVirus-SpecificCytotoxicT-LymphocyteResponsesinVitro.BioconjugChem,20(1):24-31Choi,M.R.,K.J.Stantonmaxey,J.K.Stanley,C.S.Levin,R.Bardhan,D.Akin,S.Badve,J.Sturgis,J.P.Robinson,R.Bashir.2007.AcellularTrojanHorsefordeliveryoftherapeuticnanoparticlesintotumors.NanoLetters,7(12):3759-3765Chou,H.Y.,X.Z.Lin,W.Y.Pan,P.Y.Wu,C.M.Chang,T.Y.Lin,H.H.Shen,M.H.Tao.2010.Hydrogel-deliveredGM-CSFovercomesnonresponsivenesstohepatitisBvaccinethroughtherecruitmentandactivationofdendriticcells.JImmunol,185(9):5468-5475Connor,E.E.,J.Mwamuka,A.Gole,C.J.Murphy,M.D.Wyatt.2010.Goldnanoparticlesaretakenupbyhumancellsbutdonotcauseacutecytotoxicity.Small,1(3):325-327Corti,C.W.,R.J.Holliday.2004.Commercialaspectsofgoldapplications:Frommaterialssciencetochemicalscience.GoldBulletin,37(1-2):20-26Dhennin,L.,B.Larenaudie,M.Remond.1976.[Anewinactivatedvaccineagainstclassicalswinefever].CRAcadSciHebdSeancesAcadSciD,283(12):1457-1460Dreaden,E.C.,S.C.Mwakwari,L.A.Austin,M.J.Kieffer,A.K.Oyelere,M.A.El-Sayed.2012.SmallMolecule-GoldNanorodConjugatesSelectivelyTargetandInduceMacrophageCytotoxicityTowardsBreastCancerCells.Small,8(18):2819-2822Dykman,L.A.,L.Y.Matora,V.A.Bogatyrev.1996.Useofcolloidalgoldtoobtainantibiotinantibodies.JournalofMicrobiologicalMethods,24(3):247-248Edwards,S.,A.Fukusho,P.C.Lefevre,A.Lipowski,Z.Pejsak,P.Roehe,J.Westergaard.2000.Classicalswinefever:theglobalsituation.VetMicrobiol,73(2-3):103-119Elbers,A.R.,J.A.Stegeman,M.C.deJong.2001.Factorsassociatedwiththeintroductionofclassicalswinefevervirusintopigherdsinthecentralareaofthe1997/98epidemicinTheNetherlands.VetRec,149(13):377-382Freitas,T.R.,L.A.Caldas,M.A.Rebello.1998.ProstaglandinA1inhibitsreplicationofclassicalswinefevervirus.MemInstOswaldoCruz,93(6):815-818Frens,G.1973.ControlledNucleationfortheRegulationoftheParticleSizeinMonodisperseGold42 Suspensions.NaturePhysicalScience,241(105):20-22Gavrilov,B.K.,K.Rogers,I.J.Fernandez-Sainz,L.G.Holinka,M.V.Borca,G.R.Risatti.2011.Effectsofglycosylationonantigenicityandimmunogenicityofclassicalswinefevervirusenvelopeproteins.Virology,420(2):135-145Gregory,A.E.,R.Titball,D.Williamson.2013.Vaccinedeliveryusingnanoparticles.FrontCellInfectMicrobiol,3(1):13Gribova,V.,R.Auzelyvelty,C.Picart.2012.PolyelectrolyteMultilayerAssembliesonMaterialsSurfaces:FromCellAdhesiontoTissueEngineering.ChemistryofMaterials,24(5):854-869Guével,X.L.,F.Palomares,M.J.Torres,M.Blanca,T.D.Fernandez,C.Mayorga.2015.Nanoparticlesizeinfluencestheproliferativeresponsesoflymphocytesubpopulations.RscAdvances,5(104):85305-85309Hanson,R.P.1957.Originofhogcholera.JAmVetMedAssoc,131(5):211-218Haruta,M.2004.Goldasanovelcatalystinthe21stcentury:Preparation,workingmechanismandapplications.Cheminform,35(44):27-36He,Q.,A.R.Mitchell,S.L.Johnson,C.Wagner-Bartak,T.Morcol,S.J.Bell.2000.Calciumphosphatenanoparticleadjuvant.ClinDiagnLabImmunol,7(6):899-903Ji,W.,Z.Guo,N.Z.Ding,C.Q.He.2015.Studyingclassicalswinefevervirus:makingthebestofabadvirus.VirusRes,197(35-47Ji,Y.L.,W.Park,K.Y.Dong.2012.Immunostimulatoryeffectsofgoldnanorodandsilica-coatedgoldnanorodonRAW264.7mousemacrophages.ToxicologyLetters,209(1):51-57Kaden,V.,U.Ziegler,E.Lange,J.Dedek.2000.Classicalswinefevervirus:clinical,virological,serologicalandhematologicalfindingsafterinfectionofdomesticpigsandwildboarswiththefieldisolate"Spante"originatingfromwildboar.BerlMunchTierarztlWochenschr,113(11-12):412-416Kato,M.,F.G.Claveria,Y.Maki,K.Sanda,T.Tanaka,Y.Omata,H.Nagasawa,N.Suzuki.2007.ReactivityofsyntheticSAG1(p30)peptidesequenceswithRH,S273andBeverleystrain-inducedanti-Toxoplasmagondiiantibodies.PathobiologyJournalofImmunopathologyMolecular&CellularBiology,74(1):50-56Khlebtsov,N.,L.Dykman.2011.Biodistributionandtoxicityofengineeredgoldnanoparticles:areviewofinvitroandinvivostudies.ChemicalSocietyReviews,40(3):1647-1671Kim,Y.,R.C.J.And,J.T.Hupp.2001.GoldNanoparticle-BasedSensingof“SpectroscopicallySilent”HeavyMetalIons.NanoLetters,1(4):165-167Kimling,J.,M.Maier,B.Okenve,V.Kotaidis,A.H.Ballot,A.Plech.2006.TurkevichMethodforGoldNanoparticleSynthesisRevisited.JournalofPhysicalChemistryB,110(32):15700-15707Lim,Y.T.,M.Y.Cho,B.S.Choi,Y.W.Noh,B.H.Chung.2008.Diagnosisandtherapyofmacrophagecellsusingdextran-coatednear-infraredresponsivehollow-typegoldnanoparticles.Nanotechnology,19(37):375105Lv,Z.,C.Tu,X.Yu,J.Wu,Y.Li,G.Ma,M.Zhang.2001.CurrentepidemiologysituationofclassicalswinefeverinChina.Lynch,I.,K.A.Dawson.2008.Protein-nanoparticleinteractions.NanoToday3:40-47.NanoToday,3(1-2):40-47Marradi,M.,F.Chiodo,I.García,S.Penadés.2013.Glyconanoparticlesasmultifunctionalandmultimodal43 carbohydratesystems.Cheminform,42(11):4728-4745Mayer,D.,T.M.Thayer,M.A.Hofmann,J.D.Tratschin.2003.EstablishmentandcharacterisationoftwocDNA-derivedstrainsofclassicalswinefevervirus,onehighlyvirulentandoneavirulent.VirusRes,98(2):105-116Meyers,G.,T.Rumenapf,H.J.Thiel.1989.Molecularcloningandnucleotidesequenceofthegenomeofhogcholeravirus.Virology,171(2):555-567Meyers,G.,H.J.Thiel,T.Rumenapf.1996.Classicalswinefevervirus:recoveryofinfectiousvirusesfromcDNAconstructsandgenerationofrecombinantcytopathogenicdefectiveinterferingparticles.JVirol,70(3):1588-1595Moennig,V.1992.Thehogcholeravirus.CompImmunolMicrobiolInfectDis,15(3):189-201Moennig,V.2000.Introductiontoclassicalswinefever:virus,diseaseandcontrolpolicy.VetMicrobiol,73(2-3):93-102Moffett,J.R.,M.G.Espey,M.A.Namboodiri.1994.Antibodiestoquinolinicacidandthedeterminationofitscellulardistributionwithintheratimmunesystem.Cell&TissueResearch,278(3):461-469Moormann,R.J.,H.G.vanGennip,G.K.Miedema,M.M.Hulst,P.A.vanRijn.1996.InfectiousRNAtranscribedfromanengineeredfull-lengthcDNAtemplateofthegenomeofapestivirus.JVirol,70(2):763-770Moormann,R.J.,P.A.Warmerdam,B.vanderMeer,W.M.Schaaper,G.Wensvoort,M.M.Hulst.1990.MolecularcloningandnucleotidesequenceofhogcholeravirusstrainBresciaandmappingofthegenomicregionencodingenvelopeproteinE1.Virology,177(1):184-198Niikura,K.,T.Matsunaga,T.Suzuki,S.Kobayashi,H.Yamaguchi,Y.Orba,A.Kawaguchi,H.Hasegawa,K.Kajino,T.Ninomiya.2013.Goldnanoparticlesasavaccineplatform:influenceofsizeandshapeonimmunologicalresponsesinvitroandinvivo.AcsNano,7(5):3926Parveen,S.,R.Misra,S.K.Sahoo.2012.Nanoparticles:ABoontoDrugDelivery,Therapeutics,DiagnosticsandImaging.Nanomedicine,8(2):147-166Peek,L.J.,C.R.Middaugh,C.Berkland.2008.Nanotechnologyinvaccinedelivery.AdvDrugDelivRev,60(8):915-928Reusken,C.B.,T.J.Dalebout,P.Eerligh,P.J.Bredenbeek,W.J.Spaan.2003.AnalysisofhepatitisCvirus/classicalswinefeverviruschimeric5'NTRs:sequenceswithinthehepatitisCvirusIRESarerequiredforviralRNAreplication.JGenVirol,84(Pt7):1761-1769Risatti,G.R.,M.V.Borca,G.F.Kutish,Z.Lu,L.G.Holinka,R.A.French,E.R.Tulman,D.L.Rock.2005.TheE2glycoproteinofclassicalswinefevervirusisavirulencedeterminantinswine.JVirol,79(6):3787-3796Risatti,G.R.,L.G.Holinka,I.FernandezSainz,C.Carrillo,Z.Lu,M.V.Borca.2007.N-linkedglycosylationstatusofclassicalswinefevervirusstrainBresciaE2glycoproteininfluencesvirulenceinswine.JVirol,81(2):924-933Roldão,A.,M.C.Mellado,L.R.Castilho,M.J.Carrondo,P.M.Alves.2010.Virus-likeparticlesinvaccinedevelopment.ExpertReviewofVaccines,9(10):1149-1176Ruggli,N.,J.D.Tratschin,C.Mittelholzer,M.A.Hofmann.1996.NucleotidesequenceofclassicalswinefevervirusstrainAlfort/187andtranscriptionofinfectiousRNAfromstablyclonedfull-lengthcDNA.JVirol,70(6):3478-348744 Rumenapf,T.,G.Unger,J.H.Strauss,H.J.Thiel.1993.Processingoftheenvelopeglycoproteinsofpestiviruses.JVirol,67(6):3288-3294Sasidharan,A.,P.Chandran,N.A.Monteiroriviere.2016.BiocoronaBoundGoldNanoparticlesAugmentTheirHematocompatibilityIrrespectiveofSizeorSurfaceCharge.AcsBiomaterialsScience&Engineering,2(9):Shiosaka,S.,H.Kiyama,A.Wanaka,M.Tohyama.1986.Anewmethodforproducingaspecificandhightitreantibodyagainstglutamateusingcolloidalgoldasacarrier.BrainResearch,382(2):399-403Shukla,R.,V.Bansal,M.Chaudhary,A.Basu,R.R.Bhonde,M.Sastry.2005.Biocompatibilityofgoldnanoparticlesandtheirendocytoticfateinsidethecellularcompartment:amicroscopicoverview.Langmuir,21(23):10644-10654Slutter,B.,P.C.Soema,Z.Ding,R.Verheul,W.Hennink,W.Jiskoot.2010.Conjugationofovalbumintotrimethylchitosanimprovesimmunogenicityoftheantigen.JControlRelease,143(2):207-214Smith,D.M.,J.K.Simon,J.J.Baker.2013.Applicationsofnanotechnologyforimmunology.NatureReviewsImmunology,13(8):592Staroverov,S.A.,N.M.Aksinenko,K.P.Gabalov,O.A.Vasilenko,I.V.Vidyasheva,S.Y.Shchyogolev,L.A.Dykman.2009.Effectofgoldnanoparticlesontherespiratoryactivityofperitonealmacrophages.GoldBulletin,42(2):153-156Staroverov,S.A.,I.V.Vidyasheva,K.P.Gabalov,O.A.Vasilenko,V.N.Laskavyi,L.A.Dykman.2011.ImmunostimulatoryEffectofGoldNanoparticlesConjugatedwithTransmissibleGastroenteritisVirus.BulletinofExperimentalBiology&Medicine,151(4):436Terpstra,C.,G.Wensvoort.1997.Acongenitalpersistentinfectionofbovinevirusdiarrhoeavirusinpigs:clinical,virologicalandimmunologicalobservations.VetQ,19(3):97-101Terpstra,C.,R.Woortmeyer,S.J.Barteling.1990.DevelopmentandpropertiesofacellcultureproducedvaccineforhogcholerabasedontheChinesestrain.DtschTierarztlWochenschr,97(2):77-79vanRijn,P.A.,G.K.Miedema,G.Wensvoort,H.G.vanGennip,R.J.Moormann.1994.AntigenicstructureofenvelopeglycoproteinE1ofhogcholeravirus.JVirol,68(6):3934-3942Wensvoort,G.,C.Terpstra,E.P.deKluijver,C.Kragten,J.C.Warnaar.1989.Antigenicdifferentiationofpestivirusstrainswithmonoclonalantibodiesagainsthogcholeravirus.VetMicrobiol,21(1):9-20Widjojoatmodjo,M.N.,H.G.vanGennip,A.J.deSmit,R.J.Moormann.1999.ComparativesequenceanalysisofclassicalswinefevervirusisolatesfromtheepizooticinTheNetherlandsin1997-1998.VetMicrobiol,66(4):291-299Zhang,H.,X.Li,G.Peng,C.Tang,S.Zhu,S.Qian,J.Xu,P.Qian.2014.GlycoproteinE2ofclassicalswinefevervirusexpressedbybaculovirusinducestheprotectiveimmuneresponsesinrabbits.Vaccine,32(49):6607-6613Zhang,Q.,V.M.Hitchins,A.M.Schrand,S.M.Hussain,P.L.Goering.2011.Uptakeofgoldnanoparticlesinmurinemacrophagecellswithoutcytotoxicityorproductionofpro-inflammatorymediators.Nanotoxicology,5(3):284Zhao,L.,A.Seth,N.Wibowo,C.X.Zhao,N.Mitter,C.Yu,A.P.Middelberg.2014.Nanoparticlevaccines.Vaccine,32(3):327-33745 致谢光阴似箭，转眼之间三年的硕士研究生学习生涯已经接近尾声。在这美好的青春年华里，不仅仅是实验技能的提高，更多的是学术思想的成熟；不仅仅是岁月留下的痕迹，更多的是对自己心智的磨练；不仅仅是身体素质的提升，更多的是承受力和自信心的增加。值此论文完成之际，我谨向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最真挚的感谢与最美好的祝愿。我的硕士论文相关研究工作是在河南省农业科学院动物免疫学重点实验室开展并完成的。在此衷心感谢我的导师张改平院士，感谢张老师为我们提供优秀的实验平台和实验环境，让我们可以专心实验，心无旁骛。感谢张老师引领我在科研思维、实验设计、实验技能等方面得到了很大的提高和进步。在以后的学习和工作生活中，我会时刻提醒自己，以您为榜样，努力去做一个有思想并拥有广阔胸怀的人。在西农学习的1年，感谢周恩民教授让我踏入了科学的殿堂，感受科研的力量，完成了硕士研究生阶段的课程学习。您孜孜不倦的工作作风，认真负责的工作态度，让我看到了以后需要努力的方向。感谢南雨辰老师在试验技能、文献追踪与阅读等方面对我提供的帮助和指导，在此衷心感谢南雨辰老师的悉心指导和特别帮助。感谢王婷、马志倩、古国谦、陆敏杰、尤延飞等同学在西农为我提供了很多方面的帮助与支持，让我在郑州能够安心从事自己的实验工作，感谢你们让我在学校的生活变得丰富多彩，让我得到那么多快乐的回忆，谢谢你们。在郑州的两年时光里，感谢我的指导老师金前跃博士。两年来，无论从课题的选择、开展还是到最终课题的完成，都得到了金老师的悉心指导和帮助。金老师的耐心指导、无私帮助和真诚鼓励都使我在学习的过程中得到了很大的提高。希望我成长为优秀的科研工作者，在毕业之后能够独立面对和从容处理各种实验工作。感谢河南省动物免疫学重点实验室老师乔松林、郭军庆、赵东、杨继飞、郅玉宝、柴书军、魏蔷、王建中、刘艳梅等老师在实验中给予的热情帮助与无私指导。感谢课题小组成员丁培阳、柴永笑、周稳、李旭锋等同学对于实验过程中提供的无私帮助，因为有了你们的协助才使得我的实验能够顺利开展下去，谢谢你们。感谢实验室的其他成员黄丽嫒、宋利娜、黄晓静、南靓靓等同学在我的实验和生活过程中增添了几分色彩，让这枯燥无味的实验室生活充满了欢乐与生机，很高兴能与你们一同走过这段岁月，谢谢你们。感谢我的父母及家人，这么多年来一直支持我所做的任何选择。在我即将硕士毕业之际，由衷地对你们说声谢谢，我会更加努力的学习来回报你们。李亚菲2018.5.2146 作者简介李亚菲，女，汉族，中共党员，1991年4月出生于河南省新密市。2011年9月考入河南科技大学动物科技学院，2015年6月毕业，获得农学学士学位。同年考入西北农林科技大学动物医学院预防兽医学专业，攻读硕士学位，师从张改平院士。硕士期间主要从事新型纳米疫苗的研究，发表论文如下：1.GoldnanpparticlesenhanceimmuneresponsesinmiceagainstrecombinantCSFVE2protein.（待接收）2.Ding,P.,Zhang,T.,Li,Y.,Teng,M.,Sun,Y.,&Liu,X.,etal.(2017).Nanoparticleorientationallydisplayedantigenepitopesimproveneutralizingantibodylevelinamodelofporcinecircovirustype2.InternationalJournalofNanomedicine,12,5239-5254.3.Zhang,T.,Jin,Q.,Ding,P.,Wang,Y.,Chai,Y.,&Li,Y.,etal.(2016).Molecularepidemiologyofhydropericardiumsyndromeoutbreak-associatedserotype4fowladenovirusisolatesincentralchina.VirologyJournal,13(1),188.47