猪腹泻病双重RT-PCR检测方法建立与PED抗原灭活及免疫效果评价

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分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：20160824专业硕士学位论文猪腹泻病双重RT-PCR检测方法建立与PED抗原灭活及免疫效果评价EstablishmentofdoubleRT-PCRdetectionmethodforpigdiarrheaandantigenicinactivationandimmuneeffectevaluationofPED作者姓名：张淼学位类别：农学硕士专业名称：兽医硕士研究方向：兽医指导教师：李静姬教授所在学院：动物科学技术学院2018年5月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Epidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的各个不同日龄阶段的猪均可发病的一类急性、高度接触性肠道传染病。以哺乳仔猪尤其是3-10日龄仔猪的腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为主要临床特征。从1971年被发现至今已然发展成为严重影响养猪产业的重大病毒性传染病之一。因此，做好猪流行性腹泻病的防控工作至关重要。通过对吉林农业科技学院疫病检测中心近年来送检病料的研究分析表明，吉林地区引起猪腹泻并致死的病毒性疾病主要包括两种，即流行性腹泻（PED）和传染性胃肠炎（TGE），且两种病多数存在交叉感染。因此，本试验在对PED的研究基础上，建立PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法进行研究分析。首先用胶体金试剂盒和常规RT-PCR方法筛选出PED单纯感染和PED、TGE双重感染的阳性病料；根据GeneBank公布的序列的对比分析，设计PEDV和TGEV的引物。目的基因长度分别为PEDV223bp，TGEV832bp。对建立的双重RT-PCR方法进行多次重复试验，最终摸索出反应的最佳条件为PremixTaqDNA酶12.5μL，PEDV上游引物1μL，PEDV下游引物1μL，TGEV上游引物1μL，TGEV下游引物1μL，cDNA模板2.5μL，灭菌双蒸水6μL，总体系为25μL。最佳的扩增程序为：94℃2min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。试验结果证明，PEDV和TGEV的双重RT-PCR具有良好的特异性。可用作临床快速检测PED和TGE。利用胶体金检测及上述建立的双重RT-PCR检测法对吉林市某猪场的发病猪群进行猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎以及其他引起腹泻的病毒病的检测。其结果显示为猪流行性腹泻病毒（PEDV）的单纯感染，排除其他病毒性腹泻的混合感染。将已确诊为PEDV的病猪采集肠道组织及淋巴结，用常规方法制备成自家组织灭活苗：用0.4%甲醛溶液灭活、双抗处理、无菌检验、安全试验后，将所制备的疫苗应用于本发病猪场的45头健康猪群的免疫，其中包括母猪18头，仔猪18头，后备猪9头。用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，在使用组织灭活苗前后监测抗体水平，与对照组即市售的两种常规疫苗的免疫效果进行比较。探索出预防本病的最佳免疫方案，为有效控制流行性腹泻病提供技术支持。试验结果表明，在组织灭活苗使用前后，所测得的抗体水平有明显提升，且相较于其他两种市售疫苗，平均值增长幅度较大，但离散度较高。总体来说效果良好。I 关键词：猪流行性腹泻；双重RT-PCR；抗原灭活；免疫效果评价II AbstractPorcineepidemicdiarrheaisakindofacute,highlycontactableintestinalinfectiousdiseasethatcanbecausedbyswineepidemicdiarrheavirusinpigsthatatdifferentstagesofage.Theprimaryclinicalfeaturesarediarrhea,vomiting,dehydrationandhighmortalityrateofsucklingpigs,especially3-10dayspiglets.Sincethediscoveryofitin1971,ithasbecomeoneofthemajorviralinfectiousdiseasesthatseriouslyaffectthepigindustry.Therefore,itisveryimportanttodoagoodjobofpreventionandcontrolofporcineepidemicdiarrhea.ThroughresearchandanalysisofthediseasedmaterialssubmittedbytheJiLinAgriculturalScienceandTechnologyUniversityinrecentyears,therearetwokindsofviraldiseasesthatcausediarrheainpigsinJilinregion,epidemicdiarrhea(PED)andinfectiousgastroenteritis(TGE),andtherearecrossinfectionsinbothdiseasesatmostcircumstances.Therefore,basedonthePED,thisstudyestablishesadualRT-PCRmethodforthedetectionofPEDVandTGEV.Firstly,thepositivematerialsofthesimpleinfectionofPED,thedoubleinfectionofPEDandTGEwerescreenedbycolloidalgoldkitandconventionalRT-PCRmethod;basedonthecomparisonanalysisofthesequencepublishedbyGeneBank,designtheprimersofPEDVandTGEV.Thelengthsofthetargetgeneswere832bpand223bp.ThedoubleRT-PCRmethodwasrepeatedseveraltimes.TheoptimalconditionsforthefinalreactionwerePremixTaqDNAenzyme12.5μL,PEDVupstreamprimer1μL,PEDVdownstreamprimer1μL,TGEVupstreamprimer1μL,TGEVdownstreamprimer1μL,cDNAtemplate2.5μL,sterilizeddouble-distilledwater6μL.Thetotalsystemwas25μL.Thebestamplificationprocedurewas:94°Cfor2minutes;94°Cfor30seconds,54°Cfor30seconds,72°Cfor1minute,35cycles;72°Cfor10minutes.TheresultsofthetestshowedthatthedualRT-PCRofPEDVandTGEVhasgreatspecificity.ItcanbeusedasarapidclinicaltestforPEDandTGE.PigepidemicdiarrheaandtransmissiblegastroenteritisandotherviraldiseasescausingdiarrheaweredetectedinpigsatapigfarminJilinthroughthecolloidalgolddetectionandthedoubleRT-PCRassayestablishedabove.Theresultsshowedthatjustasimpleinfectionwithporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV),whicheliminatemixedinfectionwithotherviraldiarrhea.CollecttheintestinaltissuesandlymphnodesfromdiseasedpigsdiagnosedasPEDV,andtheinactivatedtissuevaccineisIII preparedbyconventionalmethods:afterinactivationwith0.4%formaldehydesolution,double-antibodytreatment,sterilitytest,andsafetytest,theinactivatedtissuevaccinewereprepared.Itwasusedtoimmunize45healthypigsattheexperimentalfarm,including18sows,18piglets,and9replacementgilts.TheELISAmethodwasusedtomonitortheantibodylevelbeforeandaftertheuseofinactivatedtissuevaccines,andcomparetheimmuneeffectsoftwoconventionalvaccines,whicharecommerciallyavailableinthecontrolgroup.Explorethebestimmunizationprogramforpreventingthisdiseaseandprovidetechnicalsupportforcontrolofepidemicdiarrheaeffectively.Thetestresultsshowedthatthemeasuredantibodylevelsincreasedsignificantlybeforeandaftertheuseoftissue-inactivatedvaccines.Comparedwiththeothertwocommerciallyavailablevaccines,themeanincreasewaslarger,butthedispersionwashigher.Overallitworkswell.KeyWords：Porcineepidemicdiarrhea;MultipleRT-PCR;Antigeninactivation;EvaluationofimmuneeffectIV 目录摘要...........................................................IAbstract.........................................................III目录...........................................................V前言...........................................................1第一篇文献综述....................................................2第一章猪流行性腹泻的研究进展......................................21.1病原学......................................................21.1.1分类...................................................21.1.2病原形态...............................................21.1.3病毒理化特性...........................................21.1.4病毒抗原性.............................................31.1.5培养特性...............................................31.2流行病学....................................................31.2.1传染源.................................................31.2.2传播途径...............................................31.2.3易感动物...............................................31.2.4流行特点...............................................41.3流行动态....................................................41.3.1国内流行动态...........................................41.3.2国外流行动态...........................................41.4发病机理....................................................51.5临床症状....................................................51.6病理变化....................................................61.6.1眼观病理变化...........................................61.6.2镜检病理变化...........................................61.7诊断方法....................................................61.7.1临床诊断...............................................61.7.2免疫学诊断.............................................61.7.3分子生物学诊断.........................................71.8PED的防治...................................................91.8.1饲养管理...............................................91.8.2疫苗的研究与应用.......................................9第二章猪传染性胃肠炎概述.........................................112.1病原学.....................................................112.1.1分类..................................................112.1.2病原形态..............................................112.1.3理化特性..............................................112.1.4培养特性..............................................112.2流行病学...................................................11V 2.3发病机理...................................................122.4临床症状...................................................122.5病理变化...................................................122.6诊断方法...................................................132.6.1临床诊断..............................................132.6.2免疫学诊断............................................132.6.3分子生物学诊断........................................13第二篇研究内容...................................................14第一章PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法的建立......................141.1材料.......................................................141.1.1主要试剂..............................................141.1.2主要仪器..............................................141.1.3病料样本与处理........................................141.2PEDV检测及PEDV与TGEV双重PCR检测条件优化.................151.2.1引物设计..............................................151.2.2病毒RNA的提取........................................151.2.3cDNA的制备...........................................161.2.4PCR反应条件的优化....................................161.2.5凝胶电泳..............................................161.2.6双重PCR反应的特异性试验..............................171.2.7PED病原鉴定..........................................171.3结果.......................................................171.3.1单重RT-PCR反应条件优化...............................171.3.2双重RT-PCR反应条件优化...............................181.3.3双重RT-PCR反应特异性试验.............................191.3.4双重PCR最终反应条件..................................191.3.5双重RT-PCR检测.......................................201.4讨论.......................................................201.5结论.......................................................21第二章抗原灭活及免疫效果评价.....................................222.1材料.......................................................222.1.1主要仪器..............................................222.1.2主要试剂..............................................222.2方法.......................................................222.2.1病料处理..............................................222.2.1.1氢氧化铝佐剂的制备..............................222.2.1.2抗原灭活........................................222.2.2无菌检验..............................................232.2.3安全性试验............................................232.2.4免疫效果评价..........................................232.2.4.1试验动物分组....................................232.2.4.2抗体检测........................................232.2.4.3接种免疫原......................................242.2.4.4测定抗体水平....................................24VI 2.3结果.......................................................242.3.1无菌检验..............................................242.3.2安全性试验............................................252.3.3抗体水平测定..........................................252.4讨论.......................................................312.5结论.......................................................32结论..........................................................33参考文献..........................................................34作者简介..........................................................41致谢..........................................................42VII 前言猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Epidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的各阶段日龄猪均可发病的一类急性、[1]高度接触性肠道传染病，以哺乳仔猪尤其是3-10日龄仔猪的腹泻、呕吐、脱[2-3]水性下痢和高死亡率为主要的临床特征。猪流行性腹泻（PED）最早是发生于1971年的英格兰等地，它的发病机制和临床症状与传染性胃肠炎（PorcineTransmissibleGastroenteritis，TGE）极为相似。由于本病流行范围的不断扩大，亚洲许多养猪产业较为发达的国家近年[4]来对该病有越来越多的报道。1977年，比利时的科学家从腹泻病料中发现并分离出一株与猪传染性胃肠炎（TGE）不同的病毒，并将其命名为类冠状病毒株。而后本病相继发生在包括英国、匈牙利、加拿大、日本在内的许多国家，且均有[5][6]报道。我国最早是在1982年分离到PEDV。目前，根据相关部门对我国多个省、市猪群疫病普查结果的不完全统计，在36种猪病中，由PED引起的死亡率占总死亡率的1.74%。随着该病流行范围的迅速扩大，PED已然成为严重危害养[7]猪业并造成巨大经济损失的病毒性传染病。本研究对吉林市某猪场的发病猪的病原进行鉴定，结果为单纯感染PED，同时将通过抗原灭活所制得的自家组织灭活苗应用于试验基地猪场进行小范围的免疫效果试验，与购买市面在售的其他两种疫苗进行对比分析。本试验所制备的组织灭活苗的病料来源于试验基地的发病动物群，抗原成分中几乎包括了引起该场疾病的所有病原。然而对于某些病原体，因其受环境因素及自身因素等影响，不同地区会流行不同的血清型，且血清型之间的抗原交叉保护力较弱，因此，将抗原灭活后应用于动物可提高机体的特异性免疫力，对预防疾病感染、控制疾病[8]爆发能起到较好的作用。本试验为应用自家组织灭活苗进行PED免疫效果研究提供技术支持，也可对PED进行有效防控。1 第一篇文献综述第一章猪流行性腹泻的研究进展1.1病原学1.1.1分类猪流行腹泻病毒（Epidemicdiarrheavirus，PEDV）属于套式病毒目冠状[9]病毒科冠状病毒属。基因型为单股正链RNA。目前已经测定PEDV-CV777，PEDV-CH/S，PEDV-CH/FJND-3/2011和PEDV-DR13及其弱毒株的全基因组序列[10-13]。1.1.2病原形态猪流行性腹泻病毒（PEDV）的病毒粒子在猪肠道上皮细胞内生长繁殖，它具有与冠状病毒科冠状病毒属其它成员同样的形态特征。病毒在胞浆内复制，装配则是以在内膜上出芽的方式。在粪便病料以及肠道内容物中所检测到的病毒粒子在镜下显示是多形态的，多数呈现类似球形。其包括纤突在内的平均直径约为130nm左右，范围为95～190nm之间。病毒粒子外有一层囊膜包被，囊膜上有类[14-16]似花瓣状的纤维突出，是由核心向外呈放射状排列，纤突长约为18～23nm。用电镜检查被感染的猪肠道上皮细胞时，在内质网池或胞浆空泡中可以检出病毒粒子，但从形态学上还是很难将PEDV与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）区别出来[17]。PEDV粒子有4种结构蛋白:S蛋白(Spikeprotein)、E蛋白(Envelope[18]protein)、M蛋白(Membraneprotein)和N蛋白(Nucleocapsidprotein)。S蛋白是一种表面抗原，可识别靶细胞；E蛋白可使T细胞发生凋亡；M蛋白在病毒装配时起重要作用；N蛋白与RNA的复制和合成有关。1.1.3病毒理化特性PEDV对外界的抵抗力较弱，因此包括酚类、氯制剂在内的一般的消毒药都可以破坏或杀死PEDV，从而影响其感染力，该病毒对乙醚和氯仿等脂溶性溶剂较为敏感。病毒需经60℃及以上处理一段时间，使其失去感染力后才可适应细胞培养，但在50℃条件下保持相对稳定。病毒在4℃pH4.0～9.0以及37℃pH6.5～7.5时相对稳定。此外，反复冻融的情况下，PEDV的感染力也不会被破[19-20]坏或影响。病毒的核酸为RNA。该病毒没有血凝性，且只有一种血清型。2 1.1.4病毒抗原性PEDV经免疫荧光和免疫电镜试验证明，与IBV、猪血凝性脑脊髓炎病毒、新生犊牛腹泻病毒、犬冠状病毒没有抗原关系。PEDV虽然与TGEV相似，但在与TGEV进行交叉中和试验等多项试验的结果都表明两种病毒在抗原性上完全不同，且无共同抗原。1.1.5培养特性目前相关资料表明，流行性腹泻病毒没有血凝性，因此在没有对其进行特殊处理的情况下，PEDV只能在猪肠道上皮细胞培养物内生长繁殖。长春农牧大学曾开辟了世界上首次体外分离PEDV毒株的先例，成功地在胎猪肠组织原代单层[21]细胞培养物中分离出PEDV。科研人员经过反复试验后发现，只有通过在培养液中加适当胰酶使PEDV适应Vero细胞后，才能顺利进行人工培养。PEDV在Vero细胞培养传代过程中主要的CPE现象前期是细胞肿胀变圆，间隙变大，颗粒物质增多，后期会出现细胞融合、多核细胞，且细胞产生大的空泡等变化。随后，PEDV[22]在分子生物学上便得到了较快的发展。1.2流行病学1.2.1传染源发病猪和带毒猪是本病最主要的传染源，康复猪会持续带毒，并不断地排出带有PEDV的分泌物，污染环境、饲料和饮水。1.2.2传播途径自然条件下，本病是通过粪便-口腔途径传播的，即通过消化道进行传播。病毒从口腔进入小肠，在小肠内增殖并严重侵害小肠绒毛上皮细胞。被病猪分泌物污染的饲料、饮水、环境、运输车辆、工作人员都可成为传播媒介。1.2.3易感动物PEDV感染力极强，各个阶段日龄的猪对本病毒都易感染，其发病率和死亡率的高低与年龄有密切的关系，即随年龄的增长而大幅下降。其中以3-10日龄哺乳仔猪的感染机率为最高，感染后的症状最严重，病死率最高可达100%，但是其中有的哺乳仔猪由于受到母源抗体的保护，会大大降低发病率和死亡率。老母猪和成年猪多呈亚临床感染，症状轻微。断奶猪、育肥猪、种猪的发病率会逐[23]级下降，并且病死率也较低甚至死亡率为零。3 1.2.4流行特点猪流行性腹泻的流行主要感染猪群，冬、春季节是本病的流行盛期，夏季也可发生。本病的流行有不明显的周期性，常在一个地区流行几年后逐渐缓和，间隔几年再次流行。本病在流行初期传播迅速，1-2周可感染整个猪场，发病率高，以后阶段性发病，流行期长达6个月。1.3流行动态1.3.1国内流行动态[6]在1982年，我国首次分离出PED病毒（PEDV）。自上世纪70-80年代起，国内许多省、市、地区都相继爆发PED。1988年，毕云龙等采用免疫荧光技术对云南6个县13份病料进行检测，荧光阳性率达到84.62%，并通过电镜观察和人[24]工感染试验证实了猪流行性腹泻在云南的流行。2000年，孙光等对黑龙江省3个规模化养猪场进行PED的流行病学调查，结果显示该病的发生时间多在10月至12月，且各阶段日龄的猪均可发病，发病率为47.14%，病死率为64.85%，病[25]死猪以3-10日龄的哺乳仔猪为主。2004年，杜坚等对广西6个市的6个规模化猪场进行了猪流行性腹泻的流行病学调查，结果显示该病的阳性率为42%，死[26]亡率为5.67%。2006年，杨群等采用多重RT-PCR方法对全国10余省市158份腹泻样品进行检测，结果显示该病的阳性率为53.2%。在2005年到2007年间，中国农科院哈尔滨兽医研究所对发生在国内养猪产业的几种引起猪群严重腹泻致死的病原进行了RT-PCR检测，结果显示，因病毒感染而导致腹泻的主要病毒有3种，即猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和轮状病毒（PROV）。其中，PEDV、TGEV和PROV各占46%、15%和8%，并且猪群存在混[27]合感染的比例占31%。由此可见，我国猪群发生病毒性腹泻的主要病原是[28]PEDV。目前，根据相关部门对我国26个省、市的猪群疫病普查结果的不完全统计，36种猪病中，由PED引起的死亡率占总死亡率的1.74%。1.3.2国外流行动态[29-32]1971年，该病首次在英国发现，随后蔓延到其他欧洲国家和亚洲国家。1992年，猪流行性腹泻病毒在韩国被首次分离出来，随即PED爆发并持续两年，严重至发病率高达90%，死亡率达到56.3%。尽管制备了新型疫苗并投向市场使用，但PED还是在韩国大部分地区频繁发生，因其经消化道传播的特点，尤其多[33-34]发于冬季饲养条件相对较差的养殖场。日本爆发流行性腹泻是在1993年9月到1994年6月，在此期间，有超过14000头猪脱水性下痢导致死亡，其中产[35]房仔猪相比其他阶段日龄猪所占比例最高，死亡率高于90%以上。泰国开始爆4 发流行性腹泻的疫情是在2007年6月到12月。在2013之前，猪流行性腹泻病毒只在亚洲和欧洲大规模发生，随着PEDV的变异和流行的广泛性，越来越多的[36、19]国家和地区相继爆发。2013年4月，流行性腹泻疫情在美国养猪产业中突[37-41]然大规模爆发。随后在美国17个州的各大养猪场迅速传播，发病率和死亡[42]率占比最高的仍然是仔猪群。短短一年时间，流行性腹泻已经蔓延到包括加拿[41]大和墨西哥在内的整个北美洲。自2010年底以来，PEDV感染3-10日龄仔猪[42-44]是在临床中最为常见和普遍的，一旦发病，死亡率几乎达到100%。该病的流行区域逐渐在扩大，近年来，流行性腹泻的疫情发生在亚洲的形势越来越严峻，原因除了PEDV毒株有发生变异之外，受害猪群的饲养条件的匮乏使得猪群对PED[45]的免疫力大大下降。因此，流行性腹泻己经成为严重危害养猪业并造成巨大经[11]济损失的病毒性传染病之一。迄今为止，已测定了PEDVC777株完整的基因组[46]序列，基因组大小为28033bp。1.4发病机理[47]韩国科学家和欧洲科学家对PED发病机理的相关研究结果大致相同。猪流行性腹泻病毒主要通过消化道传播。在1981年，欧洲DeBouck等通过免疫荧光试验和透射电镜观察证明，PEDV从口腔或鼻腔侵入直接进入小肠，主要侵害小肠的黏膜上皮细胞，在胞浆中复制后，由感染处逐渐向周围扩散，主要的明显病变仍在小肠，表现为肠壁变薄，内容物稀薄甚至无内容物只有空气，小肠绒毛缩[48-49]短，严重时肠上皮细胞全部脱落。营养物质、电解质、无机盐等都需要小肠良好的吸收，但是小肠绒毛的损伤，使吸收的表面积减少，细胞运输电解质的功能紊乱，水分流失，猪群出现渗透性腹泻、消瘦、脱水等一系列症状，最终机体[50-51]衰竭而死亡。1.5临床症状目前，根据临床表现来区分猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎有很大难度。猪只感染PEDV初期，体温无太大变化，偶有升高，但精神沉郁，食欲减退或废绝，典型症状是严重呕吐，呕吐物有凝乳块，体表毛发蓬乱，全身发抖，随后出现剧烈腹泻，粪便多为黄绿色、灰黄色，恶臭，严重者排便呈喷射状，并混有气泡，臀部凹陷，脱水，腹泻最严重时排出的几乎全是水。患病母猪腹泻症状较轻微，泻下水泥样稀粪，严重时呈水样下痢。而育肥猪和成年猪常表现为精神萎顿、厌食，腹泻症状持续1-3周，若不出现脱水，则会逐渐康复，部分康复猪会出现发育受阻而成为僵猪。5 1.6病理变化1.6.1眼观病理变化剖检可见最具代表性的病变部位——小肠，其黏膜出现卡他性炎症，大量充血，肉眼可见整个小肠肠壁扩张变薄，半透明，缺乏弹性。内容物充满黄色或黄灰色液体，严重者呈大量泡沫状，有的内容物极其稀薄，甚至充满空气无内容物。肠系膜淋巴结充血，内充有黄色液体，腹股沟淋巴结充血肿大。结肠无明显的病理变化。1.6.2镜检病理变化由于PEDV的侵袭，使得小肠绒毛变短，变短的绒毛呈融合状，带有发育不良的刷状缘，严重时萎缩或消失，小肠绒毛的肠上皮细胞呈现空泡状甚至全部脱落。肾小管上皮细胞变性坏死。1.7诊断方法1.7.1临床诊断流行性腹泻潜伏期较短，仔猪在产床上就可能被感染并表现出明显的临床症状，虽然与TGE难以区别诊断，但该病的症状相较于TGE要轻，临床典型表现为呕吐、腹泻、脱水，粪便多呈黄色，水样，恶臭，发病后体温偶有升高，传播速度慢于TGE。1.7.2免疫学诊断目前，酶联免疫吸附试验（ELISA法）是在实验室诊断中应用最广泛的，其最大的优点就是方便快捷，可直接从粪便中检查到PEDV抗原的存在，且操作简单安全，适用于大批量的实验室检测。ELISA方法既可用于检测PEDV抗原，也可使用间接ELISA法检测PEDV抗体，已被国际贸易指定为检测PED标准诊断方法之一。随着科研深入，在ELISA法的基础上，发展出了双抗体夹心法ELISA、竞争阻断ELISA、间接ELISA以及斑点酶联免疫吸附试验法（Dot-ELISA法）等诊断方法。但是，ELISA法检测PED抗原时不能区分野毒和弱毒，若养殖场对猪群进行过PED的弱毒疫苗免疫，则检测结果会出现假阳性。这使得ELISA法的使[52]用受到了限制。免疫电镜法（IEM法）是研究抗原抗体相互作用的方法。可用己知的PEDV高免血清检测未知的病毒，也可用已知的PEDV抗原检测未知的抗体。取病猪的肠道组织及内容物，过滤后与等量稀释的PEDV高免血清混合，37℃感作30min，再移至4℃感作18h，然后将标本以13000rpm4℃离心60min，取出后向沉淀物中6 加入少许蒸馏水，以使沉淀物悬浮为宜，铺在铜网上，用2%磷钨酸负染后在电子显微镜下观察，根据抗原抗体相结合的特异性，若有PEDV，则病毒粒子将呈[53]晶格状排列，并可清晰见到毒粒间的抗体桥。王继科等把PEDV的抗原、抗体和免疫复合物离心后，通过电镜观察到了典型的病毒粒子形成的免疫复合物，并[54]建立了具有3次筛选作用改良的IEM法。改良后的IEM法更加直观、简单且准确，但该方法对电子显微镜设备的先进性要求很高，而且电镜检查的报告结果一般需要较长时间，因此在进行大规模的临床诊断时，并不推荐此方法。免疫荧光技术（immunofluorescence，IF）是通过使用异硫氰酸荧光素或四乙基罗丹明对显微镜标本进行免疫荧光标记，使标本显示结果的一种技术，多应用于实验室免疫学诊断，包括直接免疫荧光法（FAT）、间接免疫荧光法（IFAT）和免疫过氧化物酶技术。若IF或免疫过氧化物酶试验呈阳性，并伴有腹泻症状，则几乎可以确诊为PEDV。在1990年，崔现兰等通过对病猪小肠的冷冻切片或小肠抹片的FAT检查，PEDV人工感染仔猪检出率为91.4%，电镜观察阳性率为[55]67.4%，应用间接免疫荧光法（IFAT）对PED阳性猪血清的检出阳性率为89%。1997年，林志雄等从有严重腹泻、脱水致死症状的6个猪场中采集155份仔猪肠黏膜样品，用直接免疫荧光法进行检测，结果显示检出率为52%，并用血清中[56]和试验检测该6个猪场的PEDV抗体，证实都被PEDV感染过。同时，应用哈尔滨兽研所的荧光抗体方法与上述检测结果进行比较，阳性符合率达95%，阴性符合率达90%，且不与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和大肠杆菌等发生交叉反[57]应。证明直接免疫荧光法具有较高的准确性和特异性。而朱维正等用间接血凝[58，52]试验与间接免疫荧光法（IFAT）)比较后认为IFAT法更敏感。中和试验是动物受到病毒感染后产生的特异性抗体，与相应的抗原即病毒或毒素进行特异性结合，使病毒粒子失去致病性，阻止病毒侵入机体破坏细胞的一个过程。中和试验主要用于诊断病毒性传染病、鉴定细菌的毒素类型、测定效价等。试验方法主要有简单定性中和试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法。在1994年，林志雄等建立了PEDV微量中和试验方法，判定标准以血清最高稀释倍数50%以上不出现细胞变性（CPE）判定为该血清PEDV抗体效价的滴度。血清中和抗体效价1:8以上为阳性反应，1：4为可疑反应，≤1:2为阴性反应。此项研究的结果表明，PEDV在传代过程中主要的CPE现象是细胞融合、萎缩，而且这种病变会在用PK15细胞培养时更加明显。本试验充分证实了中和试验具有较高的敏感性，可用于流行病学调查。这给该病诊断方法的完[56]善奠定了基础。1.7.3分子生物学诊断随着分子生物学的不断发展，病原分离鉴定是确诊包括PED在内的很多病毒7 引起的传染病最有效的方法。目前，分子生物学诊断技术被广泛应用于实验室检测，因为其具有准确性高、敏感性强、特异性强、便于操作等一系列的优点。目前，许多实验室对PED进行诊断时不仅仅局限于传统的聚合酶链式反应，而是反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），这种分子生物学技术，除了要将RNA反转录为DNA外，其他的与聚合酶链式反应基本相似，由于提取的DNA或RNA可能相对微量，RT-PCR则能特定地对目的片段进行以指数形式的大量扩增，且能够保持准确，因此RT-PCR的灵敏度远远高于传统意义上的PCR。但也正是因为其高度灵敏性，易使得已经注射过PED弱毒疫苗的发病猪呈现假阳性。对此，针对野毒和弱毒疫苗基因的不同，设计不同的引物进行区分检测，可有效降低结果出现假阳性的概率。IshikawaK等根据PEDV的S基因序列设计了一对引物，成功建立了PEDV的RT-PCR法，灵敏度可达100TCID50/mL，并可在短时间内得出检测结果[59]。Kubota等根据PEDV的N基因序列也设计了一对引物，目的基因片段长度为[60]540bp，并成功在肠道组织和肠道内容物中检测出PEDV的存在。韩国KimO等已建立了TGEV和PEDV的双重RT-PCR诊断方法，可同时检测出10TCID50/ml的TGEV和PEDV，并对免疫组化、原位杂交、RT-PCR3种方法进行了比较，并得[61-62]出结论，RT-PCR法检测结果的重复性最好。此外，吴凌等利用GeneBank中公布的基因序列设计合成了2对针对PEDV的M基因的特异性引物，将其分离株HLJ02经过胰酶处理后，在Vero细胞上增殖，应用RT-PCR和RT-nested-PCR分别扩增出HLJ02的M全基因片段和部分片段，目的基因长度分别为854bp和[63]412bp，该结果表明RT-nested-PCR可用于检测猪流行性腹泻病毒。荧光定量PCR（fluorescencequantitativepolymerisechainreaction，FQ-PCR）技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量实验技术，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，利用荧光信号对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。相较于传统PCR方法，具有更高的灵敏度和特异性。[64-65]尤其对于PED的诊断，可以弥补传统PCR无法区别假阳性的缺陷。刘邓和李军等对TGEV和PEDV的多重RT-PCR检测方法进行了改进，通过提高引物特异性、优化RT-PCR的反应条件，优化RNA提取过程等方法，提高了RT-PCR的敏感性，特别是早期感染的敏感性，并以此为基础建立了用于检测PEDV的TaqMan荧光定量RT-PCR法，将结果与普通RT-PCR检测进行比较，表明TaqMan荧光定量RT-PCR法更准确、灵敏度更高、特异性更强且省时省力，而普通RT-PCR方法可能会出[66-67]现漏检的情况。但该方法对实验操作人员以及实验条件等的要求较为严格，以及检测成本的限制，因此在推广上仍有很大的限制。2015年，于长青等人用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段，并克隆到PUC-T载体中，构建含有PEDVM8 基因片段的重组质粒。将系列稀释后的重组质粒作为模板，基于SYBRGreenI进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增。结果显示，扩增效率为100.4%，最低可[68]准确检测520拷贝/μl的核酸模板，重复性试验的变异系数小于3%。Kim，S-H等根据TaqMan探针荧光定量分析原理建立了多重实时荧光定量PCR，其最低检11[69]出量分别为9x10拷贝/μl和7X10拷贝/μl。由此可见，构建一种灵敏度高、特异性强的荧光定量PCR方法对于PEDV的快速诊断和定量检测有着重大意义。1.8PED的防治1.8.1饲养管理流行性腹泻的防治需要从以下几个方面入手：首先就是日常的管理，包括猪舍温湿度的控制，做好仔猪断奶工作，以及舍内外的及时清扫和消毒，PEDV经过消化道感染，如若不及时清理粪便，将会造成PEDV的快速大面积传播。饲养人员也是带毒的传染途径之一。其次是做好饲喂工作，包括日粮的控制，并且要充分对仔猪进行母乳喂养，保证母源抗体的传递。再次是要减少对猪群的应激。1.8.2疫苗的研究与应用对于包括流行性腹泻病等一系列病毒性传染病的预防，目前最经济有效的预防措施是疫苗免疫，但疫苗的研发过程是异常艰难和漫长的。据冯力研究员介绍，从上世纪70年代PED在国内的爆发开始一直至今，对该病的研究步伐始终没有[70]停歇过。市场上有很多疫苗种类，PED细胞灭活苗，PED弱毒苗等。每一类疫苗的使用都是有针对性的。如处于妊娠晚期的母猪可口服PED弱毒苗，有效预防仔猪感染。据新华社2015年3月24日报道，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自主研制成功“猪腹泻三联活疫苗”并正式投产，填补了国内空白，技术达国际[71]先进水平。目前我国针对病毒性腹泻的正式上市产品有猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒（G5型）三联活疫苗、猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联灭活疫苗及最近通过规程的猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联活疫苗三种。三联活疫苗能同时预防三种病毒性腹泻疾病的发生，对控制混合感染具有很好的效果。疫苗的使用要根据具体情况来设计相应的免疫程序，并严格按照生产厂家[72]推荐方法认真落实免疫接种。除此之外，自家苗也是一种很重要的、针对性极强的疫苗，是从发病猪场自然发病病例中分离到的病原或将病变组织捣碎并作适[73]当稀释，用灭活剂将病原灭活后加入佐剂而制成。抗原成分完全、具有很强的针对性等优点让自家苗得以广泛应用，但是灭活不全、有应激反应等缺点也让自[74]家苗的使用率大大降低。自家组织灭活苗是在2002年前后开始推广使用的。最初开始投入使用时，确实取得了相对显著的效果。但是自家苗的制备和使用也9 是存在很多误区的。首先，是不可长期使用，只有当发病猪场的病例足够典型、所含病毒含量多且病毒不存在较大的变异时，自家苗才会取得显著和相对稳定的效果。但是当采集的发病猪病料所含病毒含量不够或者该猪场的病毒存在大程度变异，自家组织灭活苗都不会取得理想的效果。事实证明，自家组织灭活苗只能[75]作为临时应急的措施，而不能长期使用，因为效果会越来越差。如果做不好流行性腹泻病的科学防控，猪流行性腹泻还会继续成为养猪业的一大威胁，甚至造成不可估量的损失。10 第二章猪传染性胃肠炎概述2.1病原学2.1.1分类猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）属于套病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科[76](Coronavirus)冠状病毒属（Coronavirus）成员。1946年，美国首次报道猪传染性胃肠炎（TGE），随后该病在养猪业较为发达的国家均有发生，我国在上世纪70年代首次出现该病的报道，目前，TGE的流行已经给各国养猪业带来了[77-82]极大的经济损失。2.1.2病原形态TGEV病毒粒子的直径为90～200nm之间，形态略呈球形，在粪便中的病毒粒子常呈现多形态，有双层囊膜，囊膜上覆有纤突，多呈梨形或花瓣形，长12～24nm，末端呈球形，直径约为10nm，有极小的柄将纤突连接在囊膜的表面，[54]由核心向四周放射呈皇冠状。2.1.3理化特性TGEV对乙醚、氯仿、氢氧化钠、甲醛溶剂等敏感；不耐光照，病毒细胞培养物在紫外线照射下30min即可失去活力。病毒对胆汁有抵抗力，耐酸，毒株在pH2-3的环境下仍然稳定，因此在经过乳酸发酵的产品里仍有活力。病毒对热敏感，56℃30min即可灭活，37℃4d丧失毒力，但耐低温，在低温条件下可长期保存。2.1.4培养特性TGEV可在猪甲状腺细胞、猪睾丸细胞(ST)、唾液腺细胞和胎猪肾细胞(PK15)上进行很好的生长增殖，另外还可以使用食道、小肠组织块分离病毒。近年来，[83]ST细胞和PK15细胞系成为实验室培养TGEV中最易感和常用的细胞。2.2流行病学TGEV的发生和流行具有明显的季节性，多发于冬春季节，即寒冷的12月至次年4月。病猪和带毒猪是本病传染源，可通过猪的直接接触和猪的分泌物进行传播，随后分泌物会污染饲料、饮水、用具等，再经消化道和呼吸道将病毒传染11 [84]给易感猪群。本病主要感染猪，对马、牛、羊、鸡、兔和人等不感染，但小鼠、仓鼠、犬、猫等其它动物可能成为传播媒介使病毒在猪群间传播。本病呈地方流行性和周期流行性，且潜伏期很短，一般为15-18h，因此一旦发病，就可迅速[85-86]蔓延至整个猪场。2.3发病机理TGEV经呼吸道或消化道进入易感猪体内，通过抵抗胃酸和胰酶的作用到达易感组织小肠，在小肠绒毛上皮细胞内进行大量的增值，造成肠绒毛上皮细胞破坏，肠绒毛萎缩变短，导致其吸收功能以及酶生成能力降低，致使蛋白质、乳糖不能分解，水分和营养物质不能被有效的吸收，使肠内渗透压升高，组织内水分大量进入肠道，造成水样腹泻，机体脱水，进而导致代谢性酸中毒和高血钾，造[87]成心、肾衰竭，最终导致死亡。2.4临床症状不同阶段日龄的猪感染TGEV后，所表现的临床症状具有明显的差异。哺乳仔猪潜伏期一般为12h-24h，发病初期会在哺乳后剧烈呕吐，而后水样腹泻，粪便呈灰白色或黄绿色，其中含有未消化的凝乳块，并带有腥臭味。发病末期，由于脱水，体重迅速下降，导致血液酸碱平衡紊乱，10日龄内的仔猪多在发病后2-7d内死亡，即使耐过，病愈后也会因生长发育不良成为僵猪。日龄越小、病[88]程越短、病死率越高。母猪常与仔猪同期发病，处于哺乳期的母猪表现为泌乳停止、呕吐、食欲不振和严重腹泻；妊娠母猪症状不明显，偶尔可见流产。育肥猪，感染后2-4d发病，发病率几乎为100%，临床表现为喷射状水样腹泻，粪便呈灰色或褐色，含有少量未消化的食物，个别猪出现呕吐症状，多数会在5-8d后停止腹泻，死亡率低，但常呈营养不良状态，成为僵猪。育成猪感染后多数没有明显的临床症状，部分猪表现轻重度不一的水样腹泻，3-4d可自愈，对体重[89-90]影响较轻微。后备猪等其他成年猪因其自身体质不同而症状轻重不一，普遍食欲减退甚至食欲废绝，个别病猪出现呕吐、腹泻等症状，排出灰色或灰褐色水样便，粪便中含有部分未消化的饲料，发病后5-7d可自愈，死亡率较低，能够通过药物来进行有效的控制。2.5病理变化该病重要的病变特征是空肠绒毛的显著缩短。主要病变表现为急性肠炎，胃肠粘膜可见明显的卡他性炎症，胃内充满未消化的凝乳块，胃底黏膜充血甚至脱落，形成溃疡。小肠壁松弛、变薄且呈现透明状态，内充满气体或灰白色和黄绿色泡沫样内容物，大肠病变较轻微。肠系膜充血肿胀，淋巴结肿胀。组织病理切12 片显示肠绒毛严重萎缩；粘膜上皮细胞不同程度变性甚至坏死，变性后呈扁平或方形的未成熟细胞；心、肺、肾一般无明显病变，但病程长时，肾脏会发生脂肪[91]变性，并伴有沉积的白色尿酸盐。2.6诊断方法2.6.1临床诊断可根据发病猪或病死猪的临床症状进行诊断，进而可剖检，观察内部病理变化进行确诊。2.6.2免疫学诊断周仲芳等用杆状病毒表达系统生产的猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白建立了一种用于检测血清抗体的间接方法，并在结果判定中采用终点滴定技术，使结果[92-93]判定更为直观和迅速。2.6.3分子生物学诊断[94]王黎等根据TGEV的N基因设计上下游引物建立的RT-PCR方法，赵雯雯等根据TGEV的S蛋白建立的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻双重RT-PCR检测方法[95]，焦洋等建立的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒病的多重PCR[96]检测方法等均能有效的检测TGEV病毒，且这些RT-PCR检测方法都具有较高的敏感度和特异性；李军等建立了RT-PCR检测猪传染性胃肠炎的方法比夹心ELISA[67]检测法敏感性更高。13 第二篇研究内容第一章PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法的建立通过对近年来送检本实验室病料的研究分析表明，吉林地区引起猪腹泻并致死的病毒性疾病主要包括两种，即流行性腹泻（PED）、传染性胃肠炎（TGE），且两种病存在双重感染，因此，在原来PED研究的基础上，建立PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法进行研究分析。1.1材料1.1.1主要试剂胶体金试纸、组织基因组DNA/RNA提取试剂盒TAKARA9766、反转录试剂盒TAKARA6210A（5×gDNAEraserBuffer、gDNAEraser、PrimescriptRTEnzymeMix1、RTprimerMix、5×PremescriptBuffer2、RNaseFreedH2O）、PremixTaqDNA聚合酶、灭菌双蒸水均购自于大连宝生物工程有限公司、50×TAETop0751购自于北京博奥拓达科技有限公司、琼脂糖、DEPC水。1.1.2主要仪器移液器（Thermo）；超净台（AIRTECH，型号：SW-CJ-2FD）；生物安全柜（Thermo，型号：1388）；-80℃冰箱（Thermo，型号：994）；梯度PCR仪（TAKARA，型号：TP600）；4℃离心机（SIGMA，型号：1-14K）；恒温水浴锅（丹瑞，型号：DK-90A）；电子天平（上海菁海仪器有限公司，型号：FA2004N）；电泳仪（君意，型号：JY300E）；凝胶成像系统（基因有限公司，型号：G-BOXXT4）。1.1.3病料样本与处理吉林市周边猪场发病猪群疑似病料的采集2016年9月-2017年9月间，用采样拭子采集来自吉林市周边养殖场疑似爆发流行性腹泻的病猪及病死猪肠内容物，将所采集的样品放入含有稀释液的样品稀释管中，充分混匀。用滴样管吸取混合物的上清液4-5滴，加样至试纸条加样孔中，5-10min内观察结果。若对照线和检测样品线均显色，则呈PED、TGE阳性。在采集的8份样本中，单纯感染PED4例，单纯感染TGE2例，混合感染2例。采集上述所有阳性动物的肠道组织及内容物、颌下淋巴结及腹股沟淋巴结装入灭菌的自封袋中-20℃保存。其他阳性病料包括猪瘟阳性、蓝耳阳性、圆环阳性、伪狂犬阳性由预防兽医学吉林省重点实验室保存。14 吉林市某猪场发病猪病料采集对发病仔猪及病死仔猪的淋巴结、肠内容物以及肠组织，进行如上检测。将筛选出的阳性病料进行保存。1.2PEDV检测及PEDV与TGEV双重PCR检测条件优化1.2.1引物设计根据GenBank上公布的PEDV、TGEV的序列，对PEDV和TGEV的序列进行比对分析，查找出一段31bp左右PEDV、TGEV完全相同的序列，应用Primer5.0软件设计下游引物，然后再分别设计出上游引物，其中PEDV、TGEV要扩增的目的片段分别为：223bp、832bp，引物序列见表1。表1多重RT-PCR引物设计Table1ResultofprimerdesignformultiplexRTPCR病毒引物序列（5＇-3＇）PCR扩增产物长度/bpVirusPrimerSequence（5＇-3＇）LengthofPCRProducts/bpPEDV（F）5＇-TGCTTATACTAAGCGTAACA-3＇223PEDV（R）5＇-TAAGCATATTGTCCCAACCA-3＇TGEV（F）5＇-ATTTCTACGATTTCATAACA-3＇832TGEV（R）5＇-TAAGCATATTGTCCCAACCA-3＇1.2.2病毒RNA的提取a.分别取PED和TGE的阳性病料，以及试验基地初步确诊为PED的病猪病料。其中淋巴结＜10mg，肠道组织＜10mg，总质量＜20mg，混合后置于高压灭菌后的1.5mL离心管中，加入200μL的BufferATL，研磨棒研磨组织成悬液，加入200μLRNasefreedH2O；b.向上述产物中加入200μL的BufferVGB、20μL的ProteinaseK和1.0μL的CarrierRNA，充分混匀后于56℃水浴温浴10min至组织完全溶解；c.加入200μL的无水乙醇至上述离心管中，充分吸打混匀；d.将SpinColumn安置于CollentionTube上，将步骤c中的混合物用移液器移至SpinColumn中，4℃12000rpm离心2min，保留SpinColumn，弃滤液；e.将500μL的BufferRWA加入至SpinColumn中，4℃12000rpm离心1min，保留SpinColumn，弃滤液；f.用移液器沿着SpinColumn管壁的四周，缓慢地将700μL确认加入指定体积的100%乙醇的BufferRWB加入至SpinColumn中，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐分，4℃12000rpm离心1min，保留SpinColumn，弃滤液；g.重复操作步骤f；h.将SpinColumn重新放置于CollectionTube上，4℃12000rpm离心2min，15 保留SpinColumn，弃掉CollentionTube；i.将SpinColumn安置于新的1.5mLRNasefreecollectiontube（DNA/RNA提取试剂盒提供）上，在SpinColumn膜的中央处加入40μL的RNasefreedH2O，室温静置5min；j.4℃12000rpm离心2min，洗脱RNA，保留1.5mLRNasefreecollectiontube，弃掉SpinColumn即可。1.2.3cDNA的制备a.取0.2mL离心管，加入gDNAEraser1μL；b.加入5×gDNAEraserBuffer2μL；c.加入RNaseFreedH2O4μL；d.加入1.2.2中得到的DNA和RNA的混合物即TotalRNA3μL，最终总体系为10μL。混匀；e.将产物放入PCR仪，42℃反应2min，取出；f.取新的0.2mL离心管，加入PrimescriptRTEnzymeMix11μL；g.加入RTPrimerMix1μL；h.加入5×PrimescriptBuffer24μL；i.加入RNaseFreedH2O4μL；j.加入步骤e的反应产物10μL，最终总体系为20μL。k.将产物放入PCR仪，经37℃15min，85℃5s后取出，4℃保存备用。1.2.4PCR反应条件的优化以反转录出的cDNA为模板，在固定PremixTaqDNA酶浓度和cDNA模板量的情况下，分别对PCR反应的引物浓度和退火温度进行优化，确定最佳的PCR反应条件，取5μLPCR扩增产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。引物浓度设置为0.7μM/L、0.85μM/L、1.0μM/L三种浓度下进行PCR扩增，选择最适浓度。退火温度设置为53℃、54℃、55℃三个温度进行梯度PCR扩增，选择最适温度。1.2.5凝胶电泳将50×TAE稀释成1×TAE，将琼脂糖与1×TAE按照1.5:100进行配制，装入三角烧瓶中，用微波炉加热，每隔30s观察一次，确保溶液被溶解至澄清透明，静置溶液至约60℃左右加入核酸染料。摇匀后制备胶板，进行电泳试验。16 1.2.6双重PCR反应的特异性试验因临床上能引起猪严重腹泻的病有猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪蓝耳病、猪瘟。因此，用DNA/RNA试剂盒从实验室保存的阳性病料中提取PRV、PCV病毒DNA，PRRSV、CSFV病毒RNA，并反转录成cDNA，然后按优化后的PCR反应条件进行RT-PCR扩增。1.2.7PED病原鉴定将吉林市某猪场用胶体金试纸筛选出的PED阳性病料进行双重RT-PCR的检测。1.3结果1.3.1单重RT-PCR反应条件优化如图1-1所示，PEDV扩增条带在引物浓度为0.85μM/L时最明晰。因此，PEDV的引物浓度最终选择0.85μM/L。M1232000bp1000bp750bp500bp250bp223bp100bp图1-1单重PCR最适引物浓度的确定（PEDV）Fig.1-1OptimalprimerconcentrationsofsinglePCR（PEDV）M：DNA标准DL2000（DL2000DNAMaker）；1：1.0μM/L；2：0.85μM/L；3：0.7μM/L如图1-2所示，TGEV扩增条带在引物浓度为1μM/L时最明晰。所以，TGEV的引物浓度最终选择1μM/L。M1232000bp1000bp832bp750bp500bp250bp100bp图1-2单重PCR最适引物浓度的确定（TGEV）Fig.1-2OptimalprimerconcentrationsofsinglePCR（TGEV）M：DNA标准DL2000（DL2000DNAMaker）；1：1.0μM/L；2：0.85μM/L；3：0.7μM/L17 如图1-3所示，PEDV在退火温度为55℃时，PCR扩增效率最高。因此，PEDV的最佳退火温度为55℃。M1232000bp1000bp750bp500bp250bp223bp100bp图1-3单重PCR最佳退火温度的确定（PEDV）Fig.1-3OptimalannealingtemperatureofsinglePCR（PEDV）M：DNA标准DL2000（DL2000DNAMaker）；1：53℃；2：54℃；3：55℃如图1-4所示，退火温度在54℃的条件下，PCR扩增效率最高。因此，TGEV的最佳退火温度选择为54℃。M1232000bp1000bp832bp750bp500bp250bp100bp图1-4单项PCR最佳退火温度的确定（TGEV）Fig.1-4OptimalannealingtemperatureofsinglePCR（TGEV）M：DNA标准DL2000（DL2000DNAMaker）；1：53℃；2：54℃；3：55℃1.3.2双重RT-PCR反应条件优化如图1-5所示，当退火温度为54℃，引物浓度为1μM/L时，扩增效果最佳。M1234567892000bp1000bp832bp750bp500bp223bp250bp100bp图1-5双重RT-PCR最佳条件的确定Fig.1-5ThedeterminationofthebestconditionofdoubleRT-PCRM：DNA标准DL2000（DL2000DNAMaker）；1：53℃，1.0μM/L；2：54℃，1.0μM/L；3：55℃，1.0μM/L；4：53℃，0.85μM/L；5：54℃，0.85μM/L；6：55℃，0.85μM/L；7：53℃，0.7μM/L；8：54℃，0.7μM/L；9：55℃，0.7μM/L；18 1.3.3双重RT-PCR反应特异性试验如图1-6显示，多重RT-PCR扩增出了PEDV、TGEV的目的条带，长度分别是223bp和832bp，而CSFV、PRRSV、PRV、PCV2结果均呈阴性。说明本试验建立的双重RT-PCR检测PEDV、TGEV的方法具有很好的特异性。M123452000bp1000bpTGEV750bp500bpPEDV250bp100bp图1-6PEDV、TGEV双重RT-PCR反应特异性试验Fig.1-6AnalysisofspecificityofdoubleRT-PCRM：DNA标准DL2000（DL2000DNAMaker）；1：PEDV和TGEV混合阳性对照；2：CSFV；3：PRRSV；4：PRV；5：PCV21.3.4双重PCR最终反应条件TaqDNA酶12.5μLPEDV上游引物1μLPEDV下游引物1μLTGEV上游引物1μLTGEV下游引物1μLcDNA模板2.5μL双蒸水6μLPCR反应总体系为25μL扩增程序：94℃2min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。19 1.3.5双重RT-PCR检测如图1-7所示，双重RT-PCR结果显示，仅在长度为223处扩增出目的基因片段，其它均为阴性。将吉林市某猪场的猪确诊为PED。M123452000bp1000bp750bp500bpPEDV250bp100bp图1-7PEDV、TGEV双重RT-PCR检测Fig.1-7detectionofdoubleRT-PCRM：DNA标准DL2000（DL2000DNAMaker）；1：PEDV和TGEV；2：CSFV；3：PRRSV；4：PRV；5：PCV21.4讨论常规RT-PCR鉴别不同病原需要分别设计引物进行单独扩增。而多重RT-PCR只需将多对引物混合进行单个扩增，就可以快速准确地进行临床鉴别诊断，且具[97]有特异性高、敏感性高等优点。要建立完整的体系还需要多次试验，多次改进，并多次总结。引物设计是多重RT-PCR建立成功与否的关键，在设计引物时要将引物设计在20bp左右，G+C的含量以40%-60%为宜，太少了扩增效果不佳，过多易出现非特异性条带。同时要充分考虑到引物与靶基因是否具有高度的特异性，避免交叉错配产生引物二聚体和非特异性条带等；引物长度、G+C含量和Tm值要符合常规PCR引物设计要求。每对引物设计后要与其它病毒进行比对，确定其[98]良好的特异性。通过GeneBank中的序列比对分析，找到保守区，分别设计上下游引物，并且将扩增的目的基因片段长度之间的差距扩大为100bp以上，以便在凝胶电泳图上易于区分。在探索引物浓度时，需注意引物的特异性和引物量，每条引物浓度0.1-1μmol或10-100pmol，当多个引物量可得到所需结果，应以最低引物量为佳，因为引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。本试验的引物设计展现了良好的特异性。在双重RT-PCR反应条件优化的过程中，摸索不同的退火温度也是本试验的难点。最终PCR反应的最佳条件为退火温度54℃，引物浓度分别为PEDV0.85μM/L，TGEV1μM/L。对吉林市周边采集的病料进行双重RT-PCR的结果显示，此方法的建立具有真实性和可靠性，且检出率高，敏感性高，同时排除了假阳性出现的可能。在RT-PCR试验过程中，要严格遵守操作规范，在研磨病料过程中，曾多次将病料离开冰盒，导致病毒因研磨时温度过高而死亡，最终结果不准确。同时应20 严格避免污染，在配制PCR体系时要在无菌操作台中操作，否则会导致污染，使得条带结果出现错误。在向溶解后的凝胶中加入核酸染料EB时，应在凝胶温度降低至60℃左右时加入，否则核酸染料会在高温时挥发，对空气造成污染，从而危害人体健康。在试验过程中应避免污染，尤其DNA/RNA提取时，要用浸泡过DEPC水的棉球反复擦拭移液器，枪头一次一换，且在操作过程中注意自我防护。科学实验需要严谨的态度。1.5结论通过对单项RT-PCR反应条件优化，PEDV在引物浓度为0.85μM/L，退火温度在55℃时，扩增效果最佳；TGEV在引物浓度为1μM/L，退火温度在54℃时，扩增效果最佳。通过双重RT-PCR反应条件的优化，PEDV和TGEV在引物浓度为1μM/L，退火温度在55℃时，扩增效果最佳。因此，最佳的反应条件为PremixTaqDNA酶12.5μL，PEDV上游引物1μL，PEDV下游引物1μL，TGEV上游引物1μL，TGEV下游引物1μL，cDNA模板2.5μL，双蒸水6μL。最佳的扩增程序为94℃2min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。在此条件下，引物具有很高的特异性。快速确诊吉林市某猪场的病原仅为PEDV，无交叉感染。21 第二章抗原灭活及免疫效果评价对试验猪场确诊病例进行病料采集并进行抗原灭活，通过临床免疫接种试验，进行免疫效果评价。2.1材料2.1.1主要仪器超净台、匀浆机、电子天平、高压锅、剪刀、镊子、冰箱、显微镜、酶标仪。2.1.2主要试剂生理盐水、0.4%的甲醛、双抗液、氢氧化铝凝胶、猪流行性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒（北京飞凯生物技术有限公司）。2.2方法2.2.1病料处理2.2.1.1氢氧化铝佐剂的制备a.称取氢氧化铝干粉50-55g，加入60mL沸水中（搪瓷缸）搅拌均匀；b.缓慢倒入硫酸100mL。爆沸至颜色呈棕褐色，大约30-60min；c.加温水，边加边搅拌约至总量为350mL；d.加温水稀释至1000mL，温度约为80℃（A液）；e.另一缸盛80g烧碱，加水至1000mL，加温至75℃（B液）；f.将A液与B液等量缓慢倒入另一耐酸搪瓷缸内（控制两液流速），化合物PH为6.9±0.1时化合结束；g.用蒸汽吹沸熟化10min，调节PH6.9±0.1，继续熟化3min，稳定PH6.9±0.1，静置沉淀；h.吸去上清液后加入约5倍量的去离子水，搅拌洗涤沉淀，弃上清液，重复3-5次；i.用100-120目铜沙筛滤过，装入布袋脱水过夜，收藏于容器内，约得600g氢氧化铝佐剂。2.2.1.2抗原灭活将采集的病猪颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、肠道及肠内容物除去结缔组织和筋膜，从中称取混合组织100g，放入冰箱，反复冻溶三次后，按照1g：10mL的比例加入生理盐水，在预先消毒好的组织匀浆机中搅拌2-3min，再2000rpm/min22 匀浆4-5min，至组织呈糊状，装入适当容器。在超净工作台内，用双层无菌医用纱布过滤，将纱布逐次重叠，最终经过十二层纱布过滤，反复两次。加入容积比为0.4%的甲醛溶液，1h摇匀后，37℃条件下灭活，灭活期间每6h摇动一次。灭活48h后，按1500UI/ml比例加入双抗液，即青霉素和链霉素于灭活液中并摇匀。最终加入氢氧化铝佐剂，分装备用，4℃保存。2.2.2无菌检验将灭活的抗原接种于普通琼脂平板培养基及肉汤，37℃培养，每天观察，有无细菌生长。2.2.3安全性试验（1）单剂量接种的安全性试验灭活后对14只健康小鼠进行腹部注射，设置试验组、阴性对照组及健康对照组，将组织灭活苗分别对试验组的9只小鼠注射0.5mL、0.8mL、1mL三个量，对3只阴性对照组注射生理盐水0.5mL、0.8mL、1mL，健康对照组的2只正常饮食，观察其食欲、行为活动、精神状态等24h。剖杀后进行病理学检查。（2）单剂量重复接种的安全性试验另取5只健康小鼠对其进行腹部注射，第一次将组织灭活苗分别注射0.5mL、0.8mL、1mL，24h后第二次注射同等剂量，观察其食欲、行为活动、精神状态等24h。剖杀后进行病理学检查。（3）一次超剂量接种的安全性试验另取5只健康小鼠对其进行腹部注射，剂量为1.5mL/只。观察其食欲、行为活动、精神状态等7d，剖杀后进行病理学检查。2.2.4免疫效果评价2.2.4.1试验动物分组将18头健康母猪，18头健康仔猪，9头健康后备猪平均分为三组，分别为A组、B组、C组（A组：自家组织灭活苗组；B组：市售二联弱毒疫苗；C组：市售二联活疫苗）。2.2.4.2抗体检测采集45头猪的耳缘静脉血，编号记录，应用EIISA法进行抗体水平测定，分析抗体情况。a.用一次性真空管采集被检猪的耳缘静脉血，静置，分离出血清，移入1.5mL离心管中，标号；23 b.待检血清用血清样本稀释液按1：50稀释，4℃备用；c.将猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min后使用，液体试剂使用前需混匀；d.将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照1：19稀释；e.取出抗原包被板，将血清依次加入反应孔，同时设置2个阴性对照孔，2个阳性对照孔，每孔100μL，两个空白对照孔不加样；f.附上封板膜，置37℃温箱中，30min；g.弃去反应液，每孔加入300μL稀释后的洗涤液，轻微震荡，弃去，反复洗涤4次拍干；h.每孔加入抗猪IgG抗体辣根酶标记物100μL，两个空白对照孔不加酶；i.附上封板膜，置37℃温箱中，30min；j.重复步骤g；k.每孔加入显色底液A、显色底液B各50μL，包括两个空白对照孔；l.附上封板膜，置37℃温箱中，避光显色15min；m.每孔加入显色终止液50μL，包括两个空白对照孔，终止反应；n.测定各孔450nm的OD值。结果判定：阳性对照测定OD值应不低于0.4，否则试验无效；计算阳性对照平均值，临界值=0.3*阳性对照均值。样本测定OD值-空白值≥临界值者判为阳性；否则为阴性。2.2.4.3接种免疫原给45头猪逐个进行后海穴注射，组织灭活苗用量：3-10日龄仔猪1mL/头，20-50kg猪2mL/头，50kg以上猪3mL/头；市售二联灭活苗用量：3-10日龄仔猪1mL/头，20-50kg猪2mL/头，50kg以上猪4mL/头；市售二联活疫苗用量：3-10日龄仔猪0.5mL/头，20-50kg猪1mL/头，50kg以上猪1.5mL/头。每天观察其精神状态、行为活动、进食饮水等情况。2.2.4.4测定抗体水平15d后采集静脉血测定抗体水平。2.3结果2.3.1无菌检验连续观察3d后，平板培养基和肉汤培养基均无杂菌生长。24 2.3.2安全性试验（1）单剂量接种的安全性试验14只小鼠的精神状态、行为活动、进食、饮水情况均正常，剖杀后，体内无病变。（2）单剂量重复接种的安全性试验5只小鼠的精神状态、行为活动、进食、饮水情况均正常。剖杀后，体内无病变。（3）一次超剂量接种的安全性试验其中4只小鼠的精神状态、行为活动、进食、饮水情况均正常，1只精神沉郁，饮食减少，有轻微过敏现象。2.3.3抗体水平测定如表2-1、2-2、2-3所示，猪群在接种A组疫苗前后，抗体水平平均值从0.72升高到1.40，离散度从28.96%升高到41.52%，阳性率从33.33%升高到93.33%；B组抗体水平平均值从0.74升高到1.33，离散度从19.81%升高到28.26%，阳性率从40%升高带86.67%；C组疫苗抗体水平平均值从0.87升高到1.31，离散度从76.20%降低到31.56%，阳性率从46.67%升高到93.33%。25 表2-1A组免疫前后抗体水平Tab.2-1AntibodylevelbeforeandafterimmunizationinGroupAA组免疫前A组免疫后种类判定判定OD值OD-空白OD值OD-空白结果结果0.8820.838阳性1.1941.147阳性0.560.516阴性1.2851.238阳性0.6920.648阴性1.511.463阳性母猪0.450.406阴性1.281.233阳性0.9690.925阳性1.030.983阳性0.9530.909阳性1.3121.265阳性0.710.666阴性2.812.763阳性0.720.676阴性1.71.653阳性0.6920.648阴性2.6912.644阳性仔猪0.7220.678阴性0.710.663阴性0.6520.608阴性1.3211.274阳性1.3171.273阳性1.3171.270阳性0.7990.755阳性1.5421.495阳性后备猪0.5810.537阴性1.0711.024阳性0.7210.677阴性0.9620.915阳性平均值0.721.40标准差0.210.58离散度28.96%41.52%阳性率33.33%93.33%26 0.73920.7152图2-1A组免疫前后抗体水平柱状图Fig.2-1HistogramofantibodylevelofAgroupbeforeandafterimmunization27 表2-2B组免疫前后抗体水平Tab.2-2AntibodylevelbeforeandafterimmunizationinGroupBB组免疫前B组免疫后种类判定判定OD值OD-空白OD值OD-空白结果结果0.6460.602阴性1.2131.166阳性1.061.016阳性1.171.123阳性0.7390.695阴性0.6570.61阴性母猪0.7760.732阴性1.351.303阳性1.0030.959阳性1.371.323阳性0.6780.634阴性1.2231.176阳性0.820.776阳性1.821.773阳性0.7530.709阴性1.581.533阳性0.8860.842阳性1.3391.292阳性仔猪0.7220.678阴性1.921.873阳性0.6910.647阴性1.5071.460阳性0.7910.747阳性1.9721.925阳性0.7740.730阴性1.2671.220阳性后备猪0.4920.448阴性0.730.683阴性0.9740.930阳性1.5691.522阳性平均值0.741.33标准差0.150.38离散度19.81%28.26%阳性率40.00%86.67%28 0.73920.7152图2-2B组免疫前后抗体水平柱状图Fig.2-2HistogramofantibodylevelofBgroupbeforeandafterimmunization29 表2-3C组免疫前后抗体水平Tab.2-3AntibodylevelbeforeandafterimmunizationinGroupCC组免疫前C组免疫后种类判定判定OD值OD-空白OD值OD-空白结果结果0.8020.758阳性1.2131.166阳性0.6490.605阴性1.061.013阳性1.0771.033阳性0.8210.774阳性母猪0.130.086阴性0.7760.729阳性0.1560.112阴性0.630.583阴性0.5550.511阴性1.2231.176阳性0.5980.554阴性1.821.773阳性2.8572.813阳性1.581.533阳性0.720.676阴性1.3391.292阳性仔猪0.620.576阴性1.921.873阳性0.750.706阴性1.5071.460阳性1.1261.082阳性1.9721.925阳性1.671.626阳性1.2671.220阳性后备猪0.8250.781阳性1.621.573阳性1.1661.122阳性1.5691.522阳性平均值0.871.31标准差0.660.41离散度76.20%31.56%阳性率46.67%93.33%30 0.73920.7152图2-3C组免疫前后抗体水平柱状图Fig.2-3HistogramofantibodylevelofCgroupbeforeandafterimmunization2.4讨论自家组织灭活苗包含多种抗原成分，且灭活完全，相较于活疫苗来说风险小。且由于PEDV没有血凝性，目前人工培养需要耗费大量的人力物力，要经过病毒的提取、驯化等一系列复杂程序，难度较大，成功率较低，多次在提取病毒时试验失败，因此本试验最终设计了组织灭活苗的制备与小范围应用，同时将组织灭活苗与市面上在售的两种疫苗进行免疫前后的抗体水平测定及比较，探索自家组织灭活苗的效果，偏于实践，可为临床提供案例。对PED阳性病料进行灭活及安全性检测后用于试验基地的猪群，测定其免疫前后抗体水平。从上述结果可以看出，C组疫苗使用后的抗体平均值不仅略低于其他两组，且使用前后的抗体水平增长率也较低。但是C组的离散度大大降低，31 这说明免疫后猪只的整体抗体水平趋于稳定。而A组的离散度明显升高，说明组织灭活苗的使用刺激猪群产生了较大的应激反应，原因是在制备灭活苗的过程中，所使用的佐剂没有较好的保护剂，使得效果不稳定。自家组织灭活苗的抗原相较于市面上在售的疫苗更具有针对性，只包含本猪场所带病原及病毒种类或亚型。能迅速控制和预防本场主要流行病。2002年前后自家组织灭活苗最初开始在猪场推广使用时，确实取得了显著的效果。但是自家苗的制备和使用也是存在很多误区的。首先，是不可长期使用。对于发病猪场的猪症状典型时，病毒含量多时，变异程度不大时，自家组织灭活苗的效果才会显著为稳定。但是随着病原的变异和症状的不够典型，通过采集自然发病猪的病变组织制备自家组织灭活苗所得到的效果远不如前。所以自家组织灭活苗知识临时应急的一种措施，不能长期使用。但由于本试验是完全确诊为流行性腹泻病毒引起的脱水性下痢，死亡，症状典型，因此采集病料时，发病猪及病死猪内的肠组织及肠内容物的抗原含量达到可以制备自己组织灭活苗的标准，基本可以达到有效的免疫抗原量。在病料进行搅碎的过程中，由于捣碎机高速运转，温度上升很快，易使蛋白质变性，从而破坏病原的免疫原性，所以病料加入捣碎机中的生理盐水和用于水浴冷却病料的冷水，都应预先在冰箱中经过冷冻。在氢氧化铝凝胶制备过程中，应注意一般使用的都是去离子水，因为氢氧化铝具有较强的吸附力，且为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态，因此掌握好化合时的PH也十分重要。储存氢氧化铝要将其放入耐酸容器中，室温保存，保质期三个月。2.5结论从上述结果可以看出，A组疫苗和B组疫苗的抗体水平平均增长率相近，而C组疫苗使用后的抗体平均值不仅略低于其他两组，且使用前后的抗体水平增长率也较低。但是C组的离散度大大降低，而A组的离散度明显升高。A组疫苗的阳性率升高最明显。32 结论胶体金试验和双重RT-PCR结果显示，吉林市某猪场的致病病原是PEDV。通过在甲醛灭活浓度0.4%、灭活时间48h的条件下制备组织灭活苗，应用于试验基地的母猪、仔猪及后备猪群，并与其他两种市面上在售疫苗进行比较。抗体水平检测结果显示，平均抗体水平与阳性率相较于其他两种疫苗有明显提升，组织灭活苗针对吉林市某猪场试验基地的猪群的免疫效果显著。33 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作者简介姓名张淼性别女民族汉籍贯吉林省政治面貌团员入学时间2016.09申请学位类别专业硕士论文答辩日期授予学位年月就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2012年9月-2016年6月，就读于吉林农业科技学院动物科技学院，时任学生会记者站站长和班级团支书2016年9月-2018年6月，就读于吉林农业大学研究生学院攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署名发表情况发表学术论文题目刊物名称（级别）署名单位次序(刊出时间/录用)署名获奖名称成果级别署名单位发表情况次序项目及专利41 致谢在此论文完成之际，首先我要感谢我的导师李静姬教授，从最初的选题到试验设计，到最终的完稿，都离不开老师的帮助与支持。恩师严谨的工作态度和为人师表的作风令我深深敬佩，并且值得我终生以为榜样，向科研方向努力奋斗。这篇论文也是倾注了导师的心血，反复修改，孜孜不倦。感恩学校提供给了我良好的学习环境和实验条件，让我得以将毕业设计顺利完成。感恩副校长李国江教授、院长尹柏双教授、沙万里老师、闫满老师在我在校求学期间给予我的鼓励和悉心的指导，让我的研究生生活收获颇丰，充实而精彩。我将向他们学习，对待科学严肃认真，扎实提高专业技能水平，注重理论与实践相结合。在研究生期间，有幸结交了学识渊博的刘东旭老师，在我的试验道路上，给予我无私的帮助，生活中也对我非常关照，在此特别感谢。其次还要感谢师兄、师姐，在我实验上的帮助，感谢学弟学妹带给我们的欢笑，让我们的生活充满乐趣。最后，感谢父母，能一直默默地支持我考学深造，在生活上也对我无微不至地关怀，你们的大爱将永远激励着我前行！42