猪δ冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价

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学校代码：１０２２３分类号：Ｓ８５４学号：ＸＳ１４３０８２密级：公开＠黑龍重乂＃硕士学位论文猪δ冠状病毒重组Ｎ蛋白间接ＥＬＩＳＡ抗体检测方法的建立与评价研究生：苏明俊指导教师：孙东波教授学科专业：临床兽医学研究方向：兽医临床微生物培养学院：动物科技学院中·大庆国２０１７．０６ 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果一，也不包含为获得黑龙江八农垦大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名：曰期：＞年６月＜曰７关于论文使用授权的说明本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印一、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八农垦大学可以用不同方式在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：导师曰期：Ｗ年Ａ月乙曰曰期：＞／年Ｚ月／曰了 Universitycode：10223Classifiedcode：S854Graduatenumber：XS143082Confidentialdegree：PublicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationDevelopmentandEvaluationofanIndirectELISAforDetectionofAntibodiesAgainstPorcineDeltacoronavirusUsingRecombinantNucleoproteinAntigenPostgraduate：MingjunSuSupervisor：ProfessorDongboSunMajor：ClinicalVeterinaryMedicineResearchdirection：VeterinaryClinicalMicrobiologyCollegeofAnimalScienceandCollege：VeterinaryMedicineDaqingChinaJune.2017 目录摘要..................................................................................................................................................I英文摘要.......................................................................................................................................III1文献综述.....................................................................................................................................11.1PDCoV概述.........................................................................................................................11.1.1PDCoV流行..................................................................................................................21.1.2PDCoV临床症状与病理变化......................................................................................21.1.3PDCoV发病机理..........................................................................................................31.1.4PDCoV病毒分离..........................................................................................................41.1.5PDCoV遗传进化分析..................................................................................................41.2PDCoV病原学特性.............................................................................................................61.2.1PDCoV分类地位..........................................................................................................61.2.2PDCoV形态结构..........................................................................................................61.2.3PDCoV基因组结构......................................................................................................71.2.4PDCoV结构蛋白的功能..............................................................................................91.2.5PDCoV细胞培养特性..................................................................................................91.3PDCoV诊断方法.................................................................................................................91.3.1PDCoV病原学诊断方法............................................................................................101.3.2PDCoV血清学诊断方法............................................................................................121.4本研究的目的与意义........................................................................................................132PDCoV重组N蛋白的原核表达与鉴定.................................................................................152.1主要材料............................................................................................................................152.1.1血清.............................................................................................................................152.1.2主要试剂.....................................................................................................................152.1.3主要仪器.....................................................................................................................152.1.4相关试剂配制.............................................................................................................152.2试验方法............................................................................................................................16i 2.2.1PDCoVN基因的合成与克隆....................................................................................162.2.2重组质粒pET-32a-PDCoV-N的表达与纯化...........................................................162.2.3重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N的表达与纯化......................................................202.2.4重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的抗原性鉴定.................222.2.5重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的浓度测定.....................222.3结果....................................................................................................................................222.3.1重组质粒pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的鉴定.............................222.3.2重组质粒pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的表达与纯化.................232.3.3重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的抗原性鉴定.................242.3.4重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的浓度测定.....................252.4讨论....................................................................................................................................253PDCoV重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价............................................273.1主要材料............................................................................................................................273.1.1血清.............................................................................................................................273.1.2主要试剂.....................................................................................................................273.1.3主要仪器.....................................................................................................................273.1.4相关试剂配制.............................................................................................................273.2试验方法............................................................................................................................283.2.1PDCoV阴性血清的收集............................................................................................283.2.2反应条件的确定.........................................................................................................293.2.3阴阳性临界值（cut-offvalue）的确定....................................................................303.2.4特异性试验.................................................................................................................303.2.5重复性试验.................................................................................................................313.2.6ROC曲线分析.............................................................................................................313.2.7现地试验.....................................................................................................................313.3结果....................................................................................................................................313.3.1PDCoV阴性血清的收集............................................................................................313.3.2反应条件的确定.........................................................................................................32ii 3.3.3阴阳性临界值（cut-offvalue）的确定....................................................................333.3.4特异性试验.................................................................................................................343.3.5重复性试验.................................................................................................................353.3.6ROC曲线分析.............................................................................................................363.3.7现地试验.....................................................................................................................373.4讨论....................................................................................................................................384结论...........................................................................................................................................40参考文献.......................................................................................................................................42致谢...............................................................................................................................................52附录...............................................................................................................................................54个人简历.......................................................................................................................................62iii ContentsAbstractinChinese..........................................................................................................................IAbstractinEnglish........................................................................................................................III1Review..........................................................................................................................................11.1OverviewofPDCoV.............................................................................................................11.1.1PrevalenceofPDCoV....................................................................................................11.1.2ClinicalsymptomsandpathologicalchangesofPDCoV..............................................21.1.3NosogenesisofPDCoV..................................................................................................31.1.4VirusisolationofPDCoV...............................................................................................41.1.5AnalysisofGeneticevolutionofPDCoV......................................................................41.2PathogeniccharacteristicsofPDCoV...................................................................................61.2.1Taxonomicstatus............................................................................................................61.2.2Morphastructure............................................................................................................61.2.3Genomicstructure..........................................................................................................71.2.4ThefunctionofPDCoVproteins....................................................................................91.2.5CellcultureforpropagationofPDCoV.........................................................................91.3PDCoVdiagnosticmethods..................................................................................................91.3.1VirologicalmethodsforPDCoVdetection..................................................................101.3.2SerologicalmethodsforPDCoVdetection..................................................................121.4PurposeandSignificance....................................................................................................132RecombinantnucleocapsidproteinofPDCoVexpressionandidentification...........................152.1Materials.............................................................................................................................152.1.1Serums..........................................................................................................................152.1.2Reagents.......................................................................................................................152.1.3Apparatuses..................................................................................................................152.1.4Reagentformulas..........................................................................................................152.2Methods...............................................................................................................................16v 2.2.1SynthesisandcloningofPDCoVNgene....................................................................162.2.2ExpressionandpurificationofpET-32a-PDCoV-Ngene............................................162.2.3ExpressionandpurificationofpGEX-6p-1-PDCoV-Ngene.......................................202.2.4IdentificationoftherecombinantproteinpET-32a-PDCoV-NandrecombinantproteinpGEX-6p-1-PDCoV-N..........................................................................................................212.2.5ConcentrationofrecombinentproteinpET-32a-PDCoV-NandrecombinantproteinpGEX-6p-1-PDCoV-N..........................................................................................................222.3Results.................................................................................................................................222.3.1Identificationoftherecombinantplasmid...................................................................222.3.2ExpressionandPurificationofrecombinentplasmid..................................................232.3.3Identificationofrecombinentprotein...........................................................................242.3.4Concentrationofrecombinentprotein..........................................................................252.4Discussion...........................................................................................................................253DevelopmentandevaluationofanindirectELISAfordetectionantibodiesagainstporcinedeltacoronavirususingrecombinantnucleoproteinantigen......................................................273.1Materials..............................................................................................................................273.1.1Serums..........................................................................................................................273.1.2Reagents.......................................................................................................................273.1.3Apparatuses.................................................................................................................273.1.4Reagentformulas.........................................................................................................273.2Methods...............................................................................................................................273.2.1ScreeningofPDCoV-negativesera..............................................................................273.2.2ResponseconditionsofrPDCoV-N-ELISA.................................................................293.2.3Determinationofthecut-offvalue...............................................................................303.2.4Specificitytest..............................................................................................................303.2.5Repetitiontest...............................................................................................................303.2.6AnalysisofROCcurve.................................................................................................313.2.7DetectionofPDCoVinfieldsamplesbytherPDCoV-N-ELISA................................31vi 3.3Results.................................................................................................................................313.3.1ScreeningofPDCoV-negativesera..............................................................................313.3.2ResponseconditionsofrPDCoV-N-ELISA.................................................................313.3.3Determinationofcut-offvalue.....................................................................................333.3.4Resultofspecificitytest...............................................................................................343.3.5Resultofrepetitiontest................................................................................................353.3.6AnalysisofROCcurve.................................................................................................363.3.7DetectionofPDCoVinfieldsamplesbytherPDCoV-N-ELISA................................363.4Discussion...........................................................................................................................374Conclusion..................................................................................................................................39References.....................................................................................................................................41Acknowledgment..........................................................................................................................51Appendix.......................................................................................................................................53Resume..........................................................................................................................................61vii 摘要猪δ冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus,PDCoV）是一种以引起仔猪腹泻、呕吐以及脱水为特征的猪肠道传染病病毒。2012年，Woo等首次在我国香港的猪群中发现PDCoV，随后该病于2014年2月在美国暴发。据报道，在我国的江西、安徽、江苏、湖北、哈尔滨等地区的部分猪场中检测到PDCoV，该病毒已经成为严重影响我国猪群健康的新发病原体。因此，建立一种快速、准确的血清学诊断方法，对PDCoV进行血清学调查是非常必要的。冠状病毒的N蛋白高度保守，因此本研究选择PDCoVN蛋白作为诊断抗原。为了获得PDCoVN蛋白，本研究根据Genbank发表的PDCoVN基因的核苷酸序列，根据大肠杆菌密码子的偏嗜性，人工合成了PDCoVN基因。合成的基因分别连接至pET-32a和pGEX-6p-1原核表达载体，经IPTG诱导表达，成功获得了重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N，经鉴定重组蛋白均为可溶性蛋白。Westernblot结果显示，重组蛋白均能被PDCoV阳性血清识别，具有良好的抗原性，能够作为检测PDCoV抗体的诊断抗原。为了建立检测PDCoV抗体的血清学诊断方法，本研究以纯化的重组蛋白pET-32a-PDCoV-N作为诊断抗原建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法（rPDCoV-N-ELISA）。本研究通过反应条件优化、cut-off值的确定、特异性试验、重复性试验以及ROC曲线分析进行了rPDCoV-N-ELISA可行性评价。试验结果表明，rPDCoV-N-ELISA的最佳抗原包被浓度为1µg/mL，最佳一抗稀释度为1/200，最佳二抗稀释度为1/7500，最佳抗体孵育时间为均为1h。特异性试验表明，该抗原不与其他常见7种猪病的阳性血清发生交叉反应。重复性试验得出，批间批内重复性试验的变异系数均小于15%。ROC曲线分析得出，与westernblot相比，该方法的敏感性和特异性分别为100%和90.4%。上述试验结果表明，rPDCoV-N-ELISA具备检测PDCoV抗体的可行性。本实验室利用rPDCoV-N-ELISA对收集自黑龙江省部分地区的319份猪血清样本进行血清学调查发现，样本的PDCoV抗体总阳性率为11.59%（37/319），表明该病在黑龙江省部分地区呈现较低的流行性。本研究获得的PDCoV重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N均可以被I PDCoV阳性血清识别，可以作为检测PDCoV抗体的诊断抗原。本研究利用重组蛋白pET-32a-PDCoV-N建立的检测PDCoV抗体的间接ELISA方法，与westernblot相比，具有较高的敏感性和特异性，可以为PDCoV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。关键词：ELISA，原核表达，猪δ冠状病毒，血清学调查II AbstractPorcinedeltacoronavirus(PDCoV)isaporcineentericdiseaseviruswhichhasbeenproventobeassociatedwithseverediarrhea,vomiting,anddehydrationinpiglet.PDCoVwasinitiallyreportedinpigsinHongKongin2012.SincefirstreportedinswineinU.S.A.inFebruary2014,PDCoVrapidlyspreadtootherstatesintheU.S.A.ItwasreportedthatPDCoVwasidentifiedinJiangsu,Anhui,Jiangxi,HubeiandHaerbinprovinceswhichhasbecameanovelpathogenthatcausesseriousimpactonswinesinChina.ItisnecessarytodevelopeasimpleandrapidserologicaldiagnostictoolforinvestigationofPDCoVepidemiology.PDCoVNproteinwhichexhibitedahighdegreeofconservationsuitableasadiagnosticantigenfordetectionantibodiesagainstPDCoV.InordertoobtainPDCoVNprotein,thenucleotidesequenceoftheentireNgeneofPDCoVwhichwasobtainedfromtheGenBankwassynthesizedbasedonthecodonusagebiasofEscherichiacoli.ThesynthesizedPDCoVNgenewasclonedintotheprokaryoticexpressionvectorspET-32a(withaHis-tag)andp-GEX-6p-1(withaGST-tag),respectively.RecombinantplasmidsweretransformedintoE.coliBL21(DE3)cells,andthan,NgeneexpressioinwasinducedusingIPTG.TheresultsindicatedthattherecombinantNproteinsofPDCoVweresuccessfullyexpressedandbothofthemweresolubleproteins.Therecombinantproteinswasverifiedusinghyper-immuneserumofPDCoVbywesternblot,whichmeansitcanbeusedasadiagnosticantigentodetectPDCoVantibody.InordertoprovidedaserologicaldiagnostictoolforPDCoV,anindirectELISA,rPDCoV-N-ELISA,whichusedrocombinantproteinpET-32a-PDCoV-NthatwasexpressedfromE.coli,wasdevelopedtodetectantibodiesagainstPDCoVinthisstudy.rPDCoV-N-ELISAwasassessedbythetestofresponseconditions,determinationofthecut-offvalue,specificitytestandrepetitiontest.ContrasttestusedtheresultsofthewesternblotwhichwasverifiedbyusingrocombinantproteinpGEX-6P-1-PDCoV-Nasthegoldstandard.Theresultsindicatedthatthebestconcentrationofantigenforcoatis1µg/mL,bestconcentrationofsampleis1/100,bestconcentrationofanti-pigIgGperoxidaseconjugatewas1/7500,bestrcactiontimeofsamplesandanti-pigIgGperoxidaseconjugatewas1h.SensitivityandspecificityofrPDCoV-N-ELISAIII relativetowesternblotwasrespectively100%and90.4%whentheoptimizedPRcut-offvaluewas48.9.TherecombinantproteinantigenpET-32a-PDCoV-Nshowednocross-reactionwithantiseraagainstothersevenswineviruses.Thecoefficientofvariabilitypercent(C/V%)ofintro-batchduplicativitytestandinter-batchduplicativitytestwasless15%.ThesedatademonstratedthattherPDCoV-N-ELISAcanbeusedforepidemiologicalinvestigationsofPDCoVandthatPDCoVhadalowserumprevalenceinpigpopulationinHeilongjiangprovince,northeastChina.Inthisstudy,westernblotresultsshowedthattherecombinantproteinspET-32a-PDCoV-NandpGEX-6p-1-PDCoV-NcanbeverifiedbypositiveserumofPDCoV,andthisrPDCoV-N-ELISAbasedonrecombinantproteinantigenpET-32a-PDCoV-Nhasgoodsensitivityandspecificity,canbeasimpleandrapidmethodfordetectPDCoVantibodies.Keywords:ELISA,prokaryoticexpression,porcinedeltacoronavirus,serumepidemiologyIV 1文献综述1.1PDCoV概述冠状病毒（Coronaviruses,CoVs）属于尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科[1-4]（Coronavirinae），该病毒的宿主范围广，包括人、鸟类及其他哺乳动物。2011年，国际病毒分类委员会（TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）第九次会议中将冠状病毒分为α、β、γ、δ四个冠状病毒属。其中α冠状病毒属（Alphacoronavirus）和β冠状病毒属（Betacoronavirus）主要以哺乳动物冠状病毒组成，γ冠状病毒属（Gammacoronavirus）主要以鸟类冠状病毒为主。而δ冠状病毒属（Deltacoronavirus）是近年新分出的冠状病毒属，相对于上述三个冠状病毒属人们对它了解较少。[5]δ冠状病毒最早于2007年，从中国白鼬獾和亚洲豹猫中检测得到。δ冠状病毒属既包括鸟类冠状病毒，也包含哺乳动物冠状病毒。目前已经发现的δ冠状病毒有鹅口疮冠状病毒（Thrushcoronavirus,ThCoV）、黑水鸡冠状病毒（Commonmoorhencoronavirus,CMCoV）、麻雀冠状病毒（Sparrowcoronavirus,SPCoV）、文鸟冠状病毒（Muniacoronavirus,MunCoV）、鹊鸲冠状病毒（Magpierobincoronavirus,MRCoV）、绣眼鸟冠状病毒（White-eyecoronavirus,WECoV）、亚洲豹猫冠状病毒（Asianleopardcatscoronavirus,ALCCoV）、夜鹭冠状病毒（Nightheroncoronavirus,NHCoV）、野鸭冠状病毒（Wigeoncoronavirus,WiCoV）、夜莺冠状病毒（Bulbulcoronavirus,BuCoV）、中国白鼬獾冠状病毒（Chineseferretbadgercoronavirus,CFBVCoV）以及猪δ冠状病毒（Porcinedelatcoronavirus,PDCoV）。[6]PDCoV是2012年新发现的一种猪冠状病毒。通过动物试验证实，该病毒对仔猪有较强的致病性，可以引起仔猪水样腹泻、呕吐以及脱水等症状，剖检呈现出小肠严重受损，[7-11]肠壁明显变薄、透亮等。该病于2014年2月在美国俄亥俄州暴发，并迅速蔓延至美国[7,9,12-15]其他地区，对当地的养猪业造成了严重的经济损失。目前，除美国和加拿大外，韩[9,10,16-19]国、中国、泰国以及老挝等亚洲国家的猪群中也检测到了PDCoV。PDCoV是一种近年来新发现的病原体，作为δ冠状病毒属中成功分离得到的唯一病毒，对PDCoV进行深入系统的研究对δ冠状病毒属以及其他猪冠状病毒具有非常重要的意义。1 1.1.1PDCoV流行[6]PDCoV首先于2012年，从香港收集的猪粪便样本中检测到。随后，该病于2014年[7]2月在美国俄亥俄州暴发。据报道，该病已经蔓延至美国20多个地区。同年6月，在加拿大安达罗湖周边的5个猪场中检测到了PDCoV。对美国以及加拿大部分地区猪场的293[13]份样本进行PDCoV检测，有30%（89/293）的样本呈PDCoV阳性。此外，在韩国收集[20]的681猪腹泻样本中有2份为PDCoV阳性。对我国江西省安徽、广西、湖北和江苏等地区收集的571份样本（收集自2004年~2015年）进行PDCoV检测发现，样本中23.47%[10,21]（134/571）呈PDCoV阳性。另外，在30份泰国腹泻猪样本中87%（26/30）样本呈[9]PDCoV阳性。虽然还未能证实PDCoV是如何传入美国，但通过回溯试验发现PDCoV早在2013年已经存在于美国猪群中，而Thachil等在2010年的猪血清样本中检测到了PDCoV抗体，[22,23]说明该病毒早在2010年之前传入美国。另外，Dong等从我国2004年收集的猪腹泻样[21]本中检测到PDCoV，证实了PDCoV在我国大陆至少存在了13年。据报道，在PDCoV感染的猪群中猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）检出率很高。在我国部分地区收集的134份PDCoV阳性粪便样本中，PEDV阳性[10,21]率占57%（77/134）。对美国和加拿大部分猪场进行猪病病毒检测发现，在89份PDCoV[13]阳性样本中33%（29/89）呈PEDV阳性，另外C群轮状病毒占58%（52/89）。虽然常出现PDCoV与PEDV、C群轮状病毒混合感染的报道，但是否起到协同作用尚不清楚。1.1.2PDCoV临床症状与病理变化猪是PDCoV的自然宿主，不同日龄的猪均可感染，特别是对仔猪有较大的危害。患[14]病猪临床症状为腹泻、呕吐以及脱水等。该病的主要传染源是患病的猪，口-粪途径是主[24]要的感染途径，健康猪经口接触带有病毒的粪便即可发生自然感染。研究表明，发病初期仔猪表现为哺乳、吃食后出现呕吐，呕吐物呈黄色或乳白色，并常伴有水样腹泻。发病后期，病猪表现为脱水、行走蹒跚以及精神沉郁等，而食欲并未有[24,25]减退的迹象。该病对成年猪的病死率较低，一般发病后自愈，仔猪的病死率在[12,19]30%~40%。病理变化结果显示，人工感染24h后病猪的主要病变出现在十二指肠、空肠和回肠上2 [24,26-28]皮组织，表现为肠壁透亮、绒毛萎缩等。另外，胃上皮细胞和胃黏膜上皮细胞均有[24]病变，伴有合胞体细胞，而盲肠和结肠的黏膜上皮细胞没有明显的变化。但有报道显示，[25,29]在病猪的盲肠和结肠上皮细胞表现出轻度的空泡化。人工感染48h后，病猪的小肠绒毛进一步萎缩、脱落，受侵害的绒毛范围更广，胃部病变进一步加剧。人工感染72h以后，病猪空肠的V/C值（绒毛高度/隐窝深度）可以达到1.4~3.6，这与感染PEDV的病猪相似。与猪流行性腹泻病（Porcineepidemicdiarrhea,PED）和TEG不同，感染PDCoV病猪胃部[24]组织和呼吸道组织中均存在病变。Shi等试验结果显示，在人工感染PDCoV24h后，病猪的胃黏膜上皮细胞有明显的病变，这与严重急性呼吸道综合征（Severeacuterespiratory[29]syndromevirus,SARS-CoV）相似。人工感染PDCoV48h后发现病猪患有轻度的间质性肺炎，镜下表现为肺间质纤维组织增生、肺泡间隔增厚变宽、炎症细胞浸润、肺泡结构改[24,29]变等，并且在肺组织及支气管黏膜上皮细胞中可以检测到病毒。而在冠状病毒家族中[30]猪呼吸冠状病毒（Porcinerespiratorycoronavirus,PRCV）会引起相似的症状。1.1.3PDCoV发病机理研究人员将处理的PDCoV阳性病料人工感染10日龄的无菌仔猪，感染21h后呈现明显的发病症状，主要症状表现为水样腹泻；48h后病情加重，出现呕吐症状，进而导致病[24,25]猪严重脱水、体重减轻以及昏睡等症状。为了证实猪肠道细菌在PDCoV的致病过程中是否起到协同作用，研究人员分别对无菌仔猪和普通仔猪进行了人工感染。试验发现，普通仔猪的腹泻症状可以持续7天~10天，体重有所减轻，但随后症状逐渐缓解，体重也逐渐恢复正常。与无菌仔猪相比，人工感染的普通仔猪腹泻更为严重，持续时间更长，在人工感染后21天仍能检测到病毒，提示[25]PDCoV的致病过程中肠道细菌可能起到协同作用。尽管感染PDCoV后的病猪主要出现腹泻症状，但通过RT-PCR检测发现除了在消化道可以检测到病毒外，还分布于血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、膈肌、肠系膜淋巴结等，表明PDCoV具有较强组织嗜性的特点，这与其他能引起腹泻的猪肠道[31]冠状病毒PEDV和TEGV不同。病毒载量检测发现，人工感染PDCoV24h后，在病猪911的肠道内检测到10~10copies/g病毒RNA，并在48h时达到高峰。十二指肠在攻毒24h4后达到高峰随后逐渐降低，72h后只能检测到10copies/g病毒RNA。病猪在发病期间，3 10粪便中可以检测出较高的病毒载量，约为10copies/g。另外，在肝脏、脾脏、肺脏、肾36[24]脏等非肠道组织器官以及血液中病毒载量为10~10copies/g。此外，在病猪的肠固有层[27]和肠系膜淋巴结也可以检测到病毒。1.1.4PDCoV病毒分离PDCoV在美国大规模流行后，研究人员进行了病毒分离工作。在2014年，美国的实验室从临床样本中成功分离得到了3株PDCoV分离株，包括从美国密歇根州分离得到的Michigan/8977/2014毒株，从美国俄亥俄州分离得到的OH-FD22毒株以及从美国伊利诺斯[32]州分离得到的USA/IL/2014毒株。在我国也分离得到了2株PDCoV分离株，分别是华中农业大学实验室从河南省分离得到的CHN-HN-2014毒株以及中国农业科学院哈尔滨兽医研究所从黑龙江省分离到的PDCoV-NH毒株。PDCoV分离株CHN-HN-2014毒株具有较强的细胞感染能力，在接种第一代的细胞就出现了比较明显细胞病变（Cytopathiceffect,8.5CPE），可以达到10TCID50/mL，电镜结果呈现出典型的冠状病毒形态，镜下病毒粒子[31]呈球型，有囊膜，直径约为120nm~180nm。PDCoV-NH分离株在细胞上感染后，通常在12h~24h出现CPE，主要表现为细胞变大、形成合胞体以及细胞脱落等。测序结果表明，该分离株与PDCoV参考毒株HKU15-44和HKU15-155的核苷酸同源性分别可以达到[22]99.4%和99.7%。1.1.5PDCoV遗传进化分析目前，Genbank收录了来源于中国、中国香港、韩国、泰国、老挝以及美国等地区的PDCoV毒株的全基因组序列。序列对比发现，各毒株间的S基因序列存在着较大的差异（核苷酸同源性为95.4%~100%）。美国毒株与韩国毒株KOR/KNU14-04/2014的S基因核苷酸序列最接近，核苷酸同源性为99.5%~99.9%，全基因组核苷酸序列同源性为99.6%~99.9%，[33]且没有基因序列的插入或缺失，遗传进化树分析发现美国毒株与韩国毒株KOR/KNU14-04/2014处于同一分支，表明它们可能起源于同一毒株。与参考毒株HKU15-44/2009的S基因序列比较发现，除了中国毒株CHN/CHN-AN-2004外，其他中国毒株包括HKU15-155/2010、CHN/CH-SXD1/20154、CHN/CH-Sichuan-S27/2012、CHN/CHJXNI2/2015、CHN/CHNHN-201、CHN/CHN-JS-2014、CHN/CHN-HB-2014以及[33]CHN/NH的S基因序列在19473nt~19477nt之间有AAT3个核苷酸缺失的特点。另外，4 与参考毒株相比，香港毒株HKU15-155/2010和中国毒株CHN/CHN-AN-2004的3′UTR有TTA缺失的特点。此外，泰国毒株THA/S5015L/2015、THA/S5011/2015和中国毒株CHN/CH-Sichuan-S27/2012的ORF1a基因序列在1738nt~1745nt之间以及2810nt~2820nt之间分别有TTTGAA6个核苷酸和CCGGTTGGT9个核苷酸缺失的特点。遗传进化树分析发现（图1-1），美国毒株与韩国毒株KOR/KNU14-04/2014处于同一分支，核苷酸同[16,32,33]源性为99.6%~99.9%。中国毒株间核苷酸同源性为98.6%~99.5%。2株泰国毒株与其[9,19,33]他毒株的亲缘关系相对较远，核苷酸同源性为97.1%~97.7%。近期在老挝发现的[19]P1-16-BTL-0116毒株与其他毒株形成独立的分支。据报道，δ冠状病毒极有可能起源于鸟类，尤其是推测δ冠状病毒是禽冠状病毒通过[24]某种跨种间传播机制，最终适应猪等哺乳动物。但由于获得的δ冠状病毒基因组序列有限以及毒株的来源地区等限制，对δ冠状病毒进行进化分析很难反应该病毒的进化特征。因此，系统地对δ冠状病毒进行病原学研究以及血清学调查，对进一步阐明δ冠状病毒发展具有深远的意义。图1-1PDCoV基因进化树[33][33]Fig1-1PhylogeneticanalysisofPDCoVcompletegenome5 1.2PDCoV病原学特性1.2.1PDCoV分类地位2011年，国际病毒分类委员会第九次会议中将PDCoV划归为尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒亚科（Coronavirus）、δ冠状病毒属（Deltacoronavirus）（图1-2）。图1-2PDCoV分类地位Fig1-2TaxonomicstatusofPDCoV1.2.2PDCoV形态结构PDCoV病毒粒子结构与其他冠状病毒相似，呈典型的冠状病毒形态。电镜观察显示，[13,31,32,34]PDCoV病毒粒子的直径约为120nm~180nm，具有囊膜、纤突，呈球形（图1-3）。6 [32]图1-3PDCoV病毒粒子形态[32]Fig1-3ThemorphologyandstructureofPDCoV1.2.3PDCoV基因组结构PDCoV是一种具有囊膜、单股正链的RNA病毒，其基因组全长约为25.4kb，GC含[7,13]量约占43%，是冠状病毒家族中基因组长度最小的病毒。PDCoV的基因组组成及排列顺序与已知的其他冠状病毒相似（图1-4）。病毒的基因组结构从5′端到3′端依次为：5′非编码区（5′Untranslatedregions,5′UTR,1nt~539nt），开放阅读框1a/1b（Openreadingframe,ORF1a/1b,540nt~19342nt），纤突蛋白（Spike,S,19342nt~22806nt）、小膜蛋白（Envelope,E,22800nt~23051nt）、膜糖蛋白（Membrane,M,23044nt~23697nt）、辅助蛋白NS6（23697nt~23981nt）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid,N,24002nt~25030nt）、辅助蛋白NS7（24096nt~24698nt）、3′非编码区（3′Untranslatedregions,3′UTR,25031nt~25421nt），其中辅助蛋白NS7基因序列和N基因序列是重叠[6,31]序列。[33]图1-4PDCoV的基因组示意图[33]Fig1-4SchematicdiagramsofPDCoVgenomeorganizationPDCoV的ORF1a/1b序列约占整个基因组的3/4（18803nt），分别编码pp1a和pp1ab7 两个多聚蛋白，它们可能被切割、加工形成了15个成熟的非结构蛋白，主要形成了与病毒复制和转录相关的蛋白酶，包括木瓜蛋白酶（NSP3）、糜蛋白酶（NSP5）、RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）以及解旋酶（NSP13）等，其中，Zhu等发现NSP5与干扰素的产[31,35,36]生有密切关系。PDCoV的N基因内部以及M基因和N基因之间存在一个ORF，分别编码辅助蛋白NS7和NS6，但其具体功能还未知。另外在N基因下游和poly（A）序列上游之间有一段茎环结构区（25220nt~25251nt），在IBV、SARS-CoV、BuCoVHKU11、ThCoVHKU12、MunCoVHKU13、ALCCoV、WECoV、SPCoV、MRCoV以及CMCoV[10,11,18,31]的基因组序列中也存在类似保守区域，具体功能还不清楚（表1-1）。表1-1冠状病毒3′UTR茎环结构Table1-1Coronavirus3′UTRstemloopstructure冠状病毒ACC.No.3′UTR茎环结构CAGTGCCGGGGCCACGCGGAG27471~27513IBVNC001451TACGATCGAGGGTACAGCACTATTTCATCGAGGCCACGCGGAG29584~29626SARSCoVNC004718TACGATCGAGGGTACAGTGAATATGTGCCGAGGCCACGCGGAG26267~26309BuCoVHKU11FJ376619TACGATCGAGGGTACAGCACAAATATGCCGAGGCCACGCGGAG26173~26215ThCoVHKU12FJ376621TACGATCGAGGGTACAGCATAAATGTGTCGAGGCCACGCGGAG26329~26371MunCoVHKU13FJ376622TACGATCGAGGGTACAGCACAAATATGCCGAGGCCACGCGGAG12603~12645ALCCoVEF584908TACGATCGAGGGTACAGCATAAATATGCCGAGGCCACGCGGAG25214~25256PDCoVHKU15JQ065042TACGATCGAGGGTACAGCATAATTGCACCGAGGCCACGCGGAG25819~25861WECoVHKU16JQ065044TACGATCGAGGGTACAGTGCACATATGCCGAGGCCACGCGGAG25859~25901SPCoVHKU17JQ065045TACGATCGAGGGTACAGCATAAATGTGCCGAGGCCACGCGGAG26466~26508MRCoVHKU18JQ065046TACGATCGAGGGTACAGCATAAATGAACCGAGGCCACGCGGAG26007~26049CMCoVHKU21JQ065049TACGATCGAGGGTACAGTTCAA8 1.2.4PDCoV结构蛋白的功能目前，PDCoV结构蛋白的具体功能未知，有待进一步研究。通过同属其他冠状病毒的可知，PEDV的S蛋白在病毒与细胞受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞的过程中发挥重[37,38][39]要生物学作用。此外，PEDVS蛋白的羧基末端细胞结构域具有固定蛋白的功能。研究人员将PEDV的S基因分为S1和S2两个区域，其中S1区域内有线性抗原表位，能[38,40,41]够介导中和抗体的产生。猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus,TGEV）的S蛋白能诱导中和抗体的产生，而且在病毒通过膜融合入侵宿主细胞中发挥重[42,43]要的作用。此外，TGEV的S蛋白与该病毒的抗凝血作用密切相关。PEDV的N蛋白在病毒复制过程中起重要作用。据报道，PEDV的N蛋白能够定位到细胞核和细胞质中，与纤维素蛋白存在相互作用，而影响核仁功能，推测PEDV可能通过破坏核仁蛋白从而促[44,45][46]进病毒的复制。TGEV的N蛋白在病毒RNA复制及加工过程中起重要作用。此外，PEDV和TGEV的N蛋白的保守性强，同时具有良好的免疫原性，因此常以N蛋白作为诊[41,47-49]断抗原。TGEV和PEDV的M蛋白在构建中病毒颗粒起到重要作用，而且具有抗干[46,50-53][39]扰素活性的功能。PEDV的E蛋白在病毒粒子的组装及出芽过程中发挥重要作用。1.2.5PDCoV细胞培养特性Hu等通过PDCoV细胞适应性比较证实，该病毒可以在猪睾丸细胞（Swinetesticular,ST）和猪肾细胞（LLCporcinekidney,LLC-PK）中进行传代培养，产生明显的细胞病变。此外，在病毒分离过程中加入适量的胰酶、胰腺酶以及健康仔猪的小肠内容物均会显著增[32]强病毒的感染作用。虽然在培养基中不加入上述添加剂也能检测到PDCoV，但不会产生明显的细胞病变，而且检测到的病毒滴度明显降低。这表明胰酶、胰腺酶以及健康仔猪的小肠内容物在病毒复制过程中起到非常重要的作用。据报道，PEDV在体外细胞培养时，也需要含有胰酶培养基，这提示PDCoV与PEDV在病毒入侵细胞以及病毒复制过程中有[39,54]相似的机制。1.3PDCoV诊断方法PDCoV引起的发病症状和病理变化与PED和猪传染性胃肠炎（Transmissible9 gastroenteritis,TGE）极为相似，仅通过肉眼观察很难辨别，必须要借助实验室诊断才能确诊。常用的实验室诊断方法分为病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断方法主要有：电子显微镜技术、逆转录-聚合酶链式反应、原位杂交技术、免疫荧光染色和免疫组织化学[13,25,27,47]。血清学诊断方法主要有间接免疫荧光技术、病毒中和试验以及酶联免疫吸附试验等。1.3.1PDCoV病原学诊断方法电子显微镜技术（Electronmicroscopy,EM）在掌握病毒超微结构的形态，研究病毒与[55]细胞的关系以及病毒性诊断中尤为重要。电子显微镜诊断技术主要是通过辨别病毒粒子在镜下的形态学。PDCoV病毒粒子的特点是具有囊膜，直径为120nm~180nm之间的球型颗粒，再结合病猪有腹泻、呕吐、脱水等临床特点，可以准确的对疾病进行诊断。由于电子显微镜比较昂贵、需要较高水平的技术要求以及灵敏度弱等限制，只有部分研究机构配备该技术。在PDCoV的研究中，电子显微镜技术主要在病毒分离鉴定的工作中起到重要的作用。聚合酶链式反应（Ploymerasechainrection,PCR）是一种可以在体外扩增并复制特定基因片段的技术。该技术是通过变性、退火、延伸三个步骤，可以将目的基因片段复制一百亿至一千亿倍，再结合核酸电泳分析可以准确的进行诊断。反转录PCR（Reversetranscription,RT-PCR）是将RNA反转录和cDNA的扩增相结合的技术。在PDCoV流行初[8]期，Wang等以PDCoVM基因和N基因为靶基因建立了PDCoVRT-PCR方法。荧光定量RT-PCR（QuantitativeReal-timeRT-PCR,RT-qPCR）是通过对RT-PCR扩增反应中每一个循环产生荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定性及定量的分析。据报道，Marthaler等和Chen等以PDCoVM基因建立了PDCoVRT-qPCR方法，Ma等以PDCoVN[12,17,24]基因建立了PDCoVRT-qPCR方法。PCR具有较高的特异性和敏感性，广泛应用于分子生物学领域中，并衍生出多种PCR。目前，在PDCoV的病原学诊断方法中，除了传统的RT-PCR外还有套式RT-PCR、多重RT-PCR以及恒温RT-PCR等。套式RT-PCR（NestedRT-PCR,nRT-PCR）的原理是以外套特异性引物对样本进行扩增，再用内套特异性引物对扩增产物进行二次扩增。由于nRT-PCR是用两对特异性引物进行二[56,57]次扩增，因此具有更高的特异性和敏感性。Song等以PDCoVN基因为靶基因建立了10 [10]PDCoVnRT-PCR，并对我国江西省PDCoV感染情况进行了流行病学调查。在PDCoV暴发早期，由于PDCoV与PEDV引起的临床症状极为相似，在普通实验室很难进行准确的诊断，因此建立一种针对两种病毒的诊断方法是非常必要的。多重PCR（DuplexPCR）方法是Chamberian在1988年首次应用于人的杜氏营养不良症（DMD）的[58]检测方法。其原理是将两对或两对以上的引物同时加入到同一PCR反应体系中，并在相同的程序中扩增出多个基因片段。Wirz等在1993年将多重PCR技术引入兽医诊断领域，[59-61]目前应用于多种动物的病毒性、细菌性以及寄生虫性疾病的诊断工作中。Zhang等在传统RT-PCR基础上以PDCoV和PEDV的M基因作为靶基因建立了一种针对PDCoV和[33]PEDV的多重RT-PCR。该方法与传统PEDVRT-PCR相比，敏感性和特异性分别为98.86%[62][26]和96.34%，与传统PDCoVRT-PCR相比，敏感性为96.34%，特异性为100%。PCR诊断技术由于需要专用的仪器设备难以普及，特别是在条件有限的牧场。在此背景下研究人员建立了恒温扩增技术（Reversetranscription-insulatedisothermalPCR,RT-iiPCR），该技术的特点是扩增反应的过程不像常规PCR需要经历多个温度变化，而在单一的温度即可进行扩增反应。RT-iiPCR与传统PCR相比，同样具有高效、快速特点，[63]而且无需专用的扩增仪器，仅需要水浴锅即可。目前该技术广泛应用于猪瘟病毒以及其[26,64-71][26]他病原体的检测中。Zhang等建立的PDCoVRT-iiPCR与传统RT-PCR相比，其敏[33]感性、特异性均达到了100%，具有极高的应用价值。免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）是以抗原抗体特异性结合的原理，利用显色剂（酶、金属离子、荧光素、同位素）对标记的抗体通过化学反应显色，确定细胞组织[72,73]中抗原（多肽和蛋白质）的方法。单克隆抗体和多克隆抗体均可以作为该方法标记抗体，南达科他州立大学研究室已经成功获得了PDCoVN蛋白单克隆抗体，为PDCoV的进行IHC试验提供了物质基础。目前IHC主要应用于PDCoV分离鉴定以及相关致病性研究[20-26,32,33]。原位杂交技术（Insituhyridization,ISH）是20世纪80年代末发展起来的一类分子细胞遗传学技术。该技术目前已经在动植物基因组结构分析、分辨染色体异位、构建DNA[74-84]物理图谱、人产前诊断以及病毒的感染等领域中广泛应用。Jung等利用ISH进行了[27]PDCoV致病性相关研究。11 1.3.2PDCoV血清学诊断方法间接免疫荧光（Indirectfluorescentantibody,IFA）的原理是利用已知的特异性抗体与待测抗原样本进行特异性反应，再与荧光标记的抗体结合，形成抗原-抗体-抗体复合物，最后通过荧光显微镜观察。IFA具有较高的特异性，常应用于病毒抗体的鉴定工作中。在感染PDCoV的ST或LLC-PK细胞样本中，可以通过IFA检测猪血清样本中PDCoV抗体水平。病毒感染动物后，会在其体内产生特异性中和抗体，并与入侵病毒粒子特异结合，从而阻碍病毒吸附在机体的敏感细胞，进而达到抑制病毒入侵的目的，使病毒降低或失去感染能力。病毒中和试验（Virusneutralization,VN）是通过比较病毒被免疫血清中和后感染力变化为依据，确定血清中和能力的血清学方法。该技术是评价血清的中和能力、疾病[85]预后以及疫苗效果的重要指标。目前，该技术广泛应用于监测猪群中PEDV、TGEV抗[86,87]体水平。酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassays,ELISA）是一类简便、灵敏，具有高通量快速检测等优点的血清学诊断方法。它是通过抗原抗体特异性反应，再通过吸光度值的变化进行诊断的技术。由于酶的催化效率较高，可以间接放大免疫反应的结果，使ELISA具有较高的敏感性。与上述血清学诊断方法相比，ELISA价格低廉、操作简单以[39]及快速安全，可以更好的适用于大规模样本的检查和基础检疫。目前，在多种检测抗体的ELISA方法中，间接ELISA是应用最广泛的一种血清学检测方法。间接ELISA的原理与IFA相似，但前者操作更简短、更快速。传统的直接ELISA方法需要将一抗用酶进行标记，费用相对较高，而且不是每一种抗体都适合做标记。而间接ELISA选用酶标二抗来识别一抗，具有更好的稳定性。目前，间接ELISA广泛应用于检测猪肠道冠状病毒抗体。研究人员利用TGEV和PEDV的结构蛋白建立了多种检测病毒抗体[88-93]的间接ELISA方法，而且市场上已经有一系列检测PEDV不同抗体亚型的间接ELISA[94-96][23,24,44]试剂盒。而检测PDCoV的血清学诊断方法的相关报道较少。其中，Thachil等[23]以原核表达的PDCoVS蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。该ELISA方法通过对已知的210份样本进行PDCoV抗体检测，得出该方法的敏感性和特异性分别为90.6%和94.8%。[24]此外，Ma等利用以PDCoV全病毒作为抗原建立了间接ELISA方法。血清流行病学（Seroepidemiology）是流行病学的一个重要分支，是用血清学诊断技术，12 分析机体血清中特异性抗原或抗体的分布规律及其影响因素，以阐明传染性疾病的发生与流行的规律，考核预防接种的效果等。血清学调查可以客观的表明疾病在畜群中的感染情况、免疫水平、流行特点以及传播方式，而且可以在评价疫苗免疫水平和研究疾病病因等方面提供重要的科学依据。目前血清学调查已经成为我国疾病监测，预防接种策划及评价[97]等日常卫生防疫工作中必不可少的研究方法。目前，PED、TGE等猪腹泻性传染病的血清学调查已经趋于完善，但PDCoV的血清学调查比较落后，特别是我国还没有系统的进行过该病的血清学调查，而且市面上也没有相关商品化的诊断试剂盒，很难掌握PDCoV在我国的流行特点，因此建立一种可靠的PDCoV血清学诊断方法具有非常必要。1.4本研究的目的与意义本研究的目的在于利用PDCoV重组N蛋白建立检测PDCoV抗体的间接ELISA方法，为我国PDCoV流行病学调查提供一种可靠的血清学诊断方法。13 14 2PDCoV重组N蛋白的原核表达与鉴定2.1主要材料2.1.1血清PDCoV阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，血清于-20℃保存备用。2.1.2主要试剂XhoI和BamHI限制性内切酶（TaKaRa）；pET-32a原核表达载体、pGEX-6p-1原核表达载体、E.coliBL21（DE3）（均保存于黑龙江八一农垦大学动物科技学院临床兽医学实验室）；Glycine（Sigma）；TRIS（Sigma）；SDS（Sigma）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Solarbio）；质粒提取试剂盒（Solarbio）；IPTG（Biosharp）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（Solarbio）；2×蛋白上样缓冲液（Solarbio）；脱脂奶粉（BD）；Tween-20（Amresco）；Ni-NTAHis结合树脂（Novagen）；谷胱甘肽琼脂糖（GEHealthcare）；鼠源抗His标签抗体（Tiangen）；鼠源抗GST标签抗体（Tiangen）；红外抗鼠二抗Dy800（Sigma）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（Thermo）。2.1.3主要仪器微量移液器（GA96826-P2，GILSON）；微波炉（MM721AAV-PW-X，Medi）；涡旋混匀器（HYQ-2110，Crystal）；台式恒温振荡器（IS-RDV1，Crystal）；电热恒温水槽（DK-8D，上海精宏）；室温台式离心机（Centrifuge5418，Eppendorf）；低温高速离心机（AllegraTMX-22RCentrifuge，Beckman）；电泳仪（DYY-6C，六一仪器厂）；紫外分析仪（JY02S，君意东方）；恒温连接仪（CoolingBlockHB-R48，WishThermo）；电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9070B型，森信实）；稳压稳流型电泳仪（DYY-III型-8B，六一仪器厂）；半干+转印仪（Trans-BlotSDCell，Bio-Rad）；凝胶成像仪（GelDocXR，Bio-Rad）；红外荧光扫描成像系统（Odyssey，li-cor）。2.1.4相关试剂配制1×Ni-NTAHis结合树脂缓冲液（pH8.0，定容至500mL）：3.94gNaH2PO4，8.77gNaCl，0.34g咪唑（10mM）。15 1×Ni-NTAHis结合树脂漂洗液（pH8.0，定容至500mL）：3.94gNaH2PO4，8.77gNaCl，0.68g咪唑（20mM）。1×Ni-NTAHis结合树脂洗脱液（pH8.0，定容至500mL）：3.94gNaH2PO4，8.77gNaCl，8.51g咪唑（250mM）。1×谷胱甘肽琼脂糖纯化蛋白洗液（pH8.0，定容至500mL）：2.92gNaCl，1mL0.5MEDTA，25mL1MTris，5mLTritonX-100，2.5mL1MDTT。1×谷胱甘肽琼脂糖纯化蛋白洗脱液（pH8.0，定容至100mL）：0.615g谷胱甘肽，10mL1MTris。2.2试验方法2.2.1PDCoVN基因的合成与克隆参考Genbank收录的PDCoVN基因核苷酸序列（登陆号：JQ065043），并优化针对大肠杆菌具有偏嗜性的密码子，分别在优化后序列的5′和3′黏性末端加入BamHI和XhoI两种酶切位点，人工合成PDCoVN核苷酸序列。合成的基因分别连接至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1，即合成带有His标签的重组质粒pET-32a-PDCoV-N和GST标签的重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N。上述合成重组质粒由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。2.2.2重组质粒pET-32a-PDCoV-N的表达与纯化2.2.2.1重组质粒pET-32a-PDCoV-N的转化1.从-80℃冰箱中取出1支E.coliBL21感受态细胞（50µL/支），置于冰水混合物中缓慢融化。2.将10µL重组质粒pET-32a-PDCoV-N加入到融化的50µLE.coliBL21感受态细胞中，混匀后冰浴30min。3.冰浴后在42℃水浴锅中热休克90s，再迅速冰浴5min。4.将上述混合物用移液枪加入到37℃预热的1mLSOB中（1mL/支），置于220rpm，37℃的摇床中摇菌45min。+5.随后涂布在含100µg/mL氨苄青霉素抗性（Amp）的固体LB培养基平板上，37℃培养12h。16 2.2.2.2重组质粒pET-32a-PDCoV-N的提取转化后，从固体LB培养基上随机挑取5~10个单菌落分别加入到5mL含100µg/mL+Amp的液体LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养12h。培养后，取出1mL菌液于4℃冰箱备用，其余4mL菌液用质粒提取试剂盒（Corning）提质粒，具体步骤如下：1.取出4mL上述菌液，于离心机12000×g离心1min，离心后弃尽上清。2.加入250µL含有RNaseA的BufferS1于上述离心管中，温和悬浮细菌沉淀。3.加入250µLBufferS2于离心管中，缓慢并充分地上下翻转4~6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。4.加入350µLBufferS3于离心管中，温和并充分地摇晃混合6~8次，混匀后于离心机12000×g离心10min。5.吸取上述离心后的上清液转移至制备管中，置于离心机中12000×g离心1min，离心后弃去滤液。6.加入500µLBufferW1洗液于上述制备管中，置于离心机中12000×g离心1min，离心后弃滤液。7.加入700µLBufferW2洗液于制备管中，置于离心机中12000×g离心1min，离心后弃滤液；以同样的方法再用700µLBufferW2洗液洗涤一次。弃滤液。8.将制备管置于2mL离心管中，12000×g离心1min。9.将制备管移入新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加60µL~80µLEluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min。2.2.2.3重组质粒pET-32a-PDCoV-N的双酶切鉴定将上述提取的重组质粒pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N用BamHI和XhoI限制性内切酶进行双酶切，酶切反应体系如下：Cutsmartbuffer2µLBamHI0.5µLXhoI0.5µLddH2O7µL17 重组质粒10µL将混匀后混合物在37℃下水浴2h，反应后的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。2.2.2.4重组质粒pET-32a-PDCoV-N的诱导表达选取1mL双酶切鉴定为阳性的pET-32a-PDCoV-N菌液，加入到200mL含100µg/mL+Amp的LB液体培养基中扩大培养。当OD600值到达0.6时，取1mL菌液加入无菌甘油-20℃保菌，其他用终浓度为1.0mM的异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）在37℃诱导4h。2.2.2.5蛋白样本的制备与SDS-PAGE分析各取诱导后菌液1mL于1.5mL离心管中，8000×g离心3min，弃去上清。将离心后的菌体用20µL灭菌后的PBS缓冲液悬起，再加入20µL2×蛋白上样缓冲液，混匀后于水中煮沸15min备用。利用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒配制凝胶，具体如下：1.将配胶用玻璃板安装在制备架上，再用蒸馏水灌满，检验是否漏液。2.首先配制5mL下层12%分离胶。向50mL离心管中依次加入以下试剂。每加入一种试剂后混匀充分。混匀后加入5µLTEMED，加入后迅速混匀，再快速加入到玻璃板中，最后缓慢加入蒸馏水压平、封闭。在常温下静置40min。蒸馏水1.60mL1.5MTris-Hcl溶液（pH8.8）1.30mL30%丙烯酰胺溶液2.00mL10%SDS0.05mL10%过硫酸铵溶液0.05mL3.配制5%上层浓缩胶。下层胶凝固后将蒸馏水弃去，残余的水用移液器或滤纸吸出。再向50mL离心管中依次加入以下试剂。每加入一种试剂后充分混匀。混匀后加入3µLTEMED，加入后迅速混匀，再快速加入到玻璃板中，并立刻插入加样梳子，在常温下静置至凝固。蒸馏水1.40mL1.0MTris-Hcl溶液（pH6.8）0.25mL30%丙烯酰胺溶液0.33mL10%SDS0.02mL18 10%过硫酸铵溶液0.02mL配制蛋白电泳胶后，对上述制备的样本进行SDS-PAGE分析。起始电泳电压为60V，当样品跑到分离胶时电压调至100V，直至溴酚蓝跑到最底层。完成电泳后，加入新配置的考马斯亮蓝R250染色液（25%异丙醇、10%冰醋酸、65%蒸馏水、0.1%的考马斯亮蓝R250），在摇床上染色30min，再利用脱色液（10%冰醋酸、5%乙醇、85%蒸馏水）进行脱色。2.2.2.6重组蛋白pET-32a-PDCoV-N的纯化将诱导后pET-32a-PDCoV-N菌液进行8000×g离心3min，并将上清弃尽。以灭菌后的PBS缓冲液重悬菌体，再进行8000×g离心3min，弃液，如此重复洗菌3次。洗菌后加入15mL灭菌PBS缓冲液与菌体混匀，在冰浴的条件下进行超声破碎，直到混合液清亮不黏稠。超声破碎后的液体进行8000×g离心10min，吸取上清液及沉淀，再进行SDS-PAGE分析，以确定表达的蛋白是否为可溶性蛋白。重组蛋白pET-32a-PDCoV-N利用His标签蛋白纯化试剂（Novagen）进行纯化，具体步骤如下：1.向过滤柱（20mL）中加入3mLNi-NTAHis结合树脂，再加入1×Ni-NTAHis结合树脂缓冲液20mL，依靠重力排净。2.利用盖子封住过滤柱底端，加入超声破碎后的上清液15mL后再封住过滤柱上端，并在4℃冰箱中温和摇晃1h。3.充分结合后打开盖子，依靠重力排净，再向过滤柱中加入1×Ni-NTAHis结合树脂洗涤液20mL，依靠重力排净，重复3次。4.用盖子封住过滤柱下端，加入1×Ni-NTAHis结合树脂洗脱液3mL后再封住过滤柱上端，并在4℃冰箱中温和摇晃1h。最后收集依靠重力排出的液体即为纯化的蛋白。2.2.2.7重组蛋白pET-32a-PDCoV-N的westernblot分析纯化后的蛋白利用westernblot方法进行鉴定，具体方法如下：1.纯化后的蛋白经处理后，进行SDS-PAGE电泳（具体见2.2.2.5）。2.转印前，先将硝酸纤维素膜（NC膜）浸泡在转膜液中备用。将电泳胶取出，按滤纸、NC膜、电泳胶、滤纸从下至上的顺序，在半干转印仪上转印，转印条件为15V，50min。19 3.转印结束后用5%脱脂乳进行封闭，在室温下摇晃封闭2h。4.封闭后弃去脱脂乳，用PBST（10mmol/L,pH7.4；Tween-20,0.05%）洗膜。5.洗膜后以抗His标签抗体作为一抗，室温下与NC膜孵育2h。6.孵育后用0.05%的PBST洗膜，每次10min，重复4次。7.以红外抗鼠二抗作为二抗，在室温下避光孵育1h。8.重复步骤6。9.利用红外荧光扫描成像系统（Odyssey，li-cor）进行扫膜。2.2.3重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N的表达与纯化2.2.3.1重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N的转化1.从-80℃冰箱中拿出1支E.coliBL21（DE3）感受态细胞（50µL/支），放置于有冰水混合物的冰盒中缓慢解冻。2.将重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N加入上述解冻的50µLE.coliBL21感受态细胞中，缓慢混匀后再置于冰水混合物中，冰浴30min。3.将上述冰浴后的混合物置于42℃水浴锅中热休克90s，再快速冰浴5min。4.冰浴后将混合物加入到37℃预热的SOB培养液中（1mL/支），在37℃，220rpm摇菌45min。5.将取出上述SOB培养液200µL，用灭菌的三角棒均匀涂布在带有氨苄青霉素抗性+（Amp）的固体LB培养基平板上，置于37℃培养箱，培养12h。2.2.3.2重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N的提取从上述培养12h后的LB培养平板中随机挑取5~10个单菌落于5mL含100µg/mL+Amp的LB培养液中，置于37℃培养箱，培养12h。培养后，取出4mL菌液（1mL保存于4℃，备用）用质粒提取试剂盒（Corning）提取质粒，具体步骤见2.2.2.2。2.2.3.3重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N的双酶切鉴定将上述提取的重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N用BamHI和XhoI限制性内切酶进行双酶切，酶切反应体系同2.2.2.3。最后将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。2.2.3.4重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N的诱导表达20 选出1mL鉴定为阳性的pGEX-6p-1-PDCoV-N菌液，用移液枪加入到200mL含100+µg/mLAmp的LB液体培养基中置于37℃220rpm扩大培养。培养至OD600值为0.6时，用终浓度为1.0mM的IPTG在37℃诱导4h。诱导前取1mL菌液置于无菌甘油中，保存在-20℃冰箱中备用。2.2.3.5蛋白样本的制备与SDS-PAGE分析具体方法同2.2.2.5。2.2.3.6重组蛋白pGEX-6p-1-PDCoV-N的纯化取诱导后pGEX-6p-1-PDCoV-N菌液，置于离心机中8000×g离心3min，离心后弃尽上清液。用无菌的PBS缓冲液缓慢重悬菌体，8000×g离心3min，离心后弃液，上述步骤重复3次。在洗菌后菌体中加入15mL灭菌的PBS缓冲液与菌体充分混匀，并置于冰水混合液中进行超声破碎，直至液体清亮不浑浊。超声破碎完成后，将液体进行8000×g离心10min，离心后收集上清液进行蛋白纯化。重组蛋白pGEX-6p-1-PDCoV-N利用谷胱甘肽琼脂糖（GEHealthcare）进行纯化，具体步骤如下：1.向过滤柱中加入3mL谷胱甘肽琼脂糖，再加入1×谷胱甘肽琼脂糖洗液20mL，依靠重力排净。2.利用盖子封住过滤柱底端，加入超声破碎后的上清液15mL后再封住过滤柱上端，在4℃冰箱中温和摇晃1h。3.充分结合后打开盖子，依靠重力排净，再向过滤柱中加入1×谷胱甘肽琼脂糖20mL，依靠重力排净，重复3次。4.利用盖子封住过滤柱下端，加入1×谷胱甘肽琼脂糖洗脱液3mL后再封住过滤柱的上端，并在4℃冰箱中温和摇晃1h。最后收集依靠重力排出的液体。收集的液体即为纯化后的蛋白。2.2.3.7重组蛋白pGEX-6p-1-PDCoV-N的westernblot分析具体方法同2.2.2.7。21 2.2.4重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的抗原性鉴定通过westernblot，以PDCoV阳性血清作为一抗，对重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N进行抗原性鉴定。具体步骤见2.2.2.7。2.2.5重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的浓度测定将纯化的重组蛋白按照BCA法蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度的测定。具体方法如下（微型定量法）：1.按照说明书制备BSA浓度标准液，并加入96孔板中，每份标准液重复2孔。2.吸取25µL待测蛋白，加入96孔板中，每份待测蛋白重复2孔。3.每孔中加入200µL的BCA工作液，缓慢摇晃30s后，用盖子封闭。4.在37℃恒温箱中孵育30min后，在562nm测吸光度值。5.对比已知标准曲线读取待测蛋白浓度。2.3结果2.3.1重组质粒pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的鉴定重组质粒pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N用BamHI和XhoI限制性内切酶进行双酶切，分别获得了大小为4984bp、1029bp和5901bp、1029bp两组片段，与预期目的片段大小一致（图2-1），表明成功获得了目的基因片段。图2-1重组质粒双酶切鉴定M.DNAMarkerDL8000；1.重组质粒pGEX-6P-1-PDCoV-N；2.重组质粒pET-32a-PDCoV-NFig2-1DoubleenzymedigestionofrecombinantplasmidLaneM.DNAMarkerDL8000;Lane1.RecombinantplasmidpGEX-6p-1-PDCoV-N;Lane2.RecombinantplasmidpET-32a-PDCoV-N22 2.3.2重组质粒pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的表达与纯化用IPTG诱导表达的pET-32a-PDCoV-N基因和pGEX-6p-1-PDCoV-N基因经SDS-PAGE电泳分析，分别在56kDa和64kDa处有一条表达量较高的条带，且与预期目的蛋白大小相符（图2-2），表明pET-32a-PDCoV-N基因和pGEX-6p-1-PDCoV-N基因在大肠杆菌中成功表达。重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N通过过镍柱的方法成功纯化，分别在56kDa和64kDa处出现单一的条带（图2-3）。Westernblot鉴定显示，重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N可以分别被His标签抗体和GST标签抗体识别，在56kDa和64kDa处有明显的条带（图2-4），表明成功获得了纯化的重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N。图2-2重组蛋白的诱导表达1.诱导后的pGEX-6p-1-PDCoV-N；2.诱导后的pGEX-6p-1空载体对照；M.蛋白Marker；3.诱导后的pET-32a空载体对照；4.诱导后的pET-32a-PDCoV-NFig2-2ExpressionofrecombinantproteinLane1.TheIPTG-inducedrecombinantbacteriaofthepGEX-6p-1-PDCoV-N;Lane2.TheIPTG-inducedrecombinantbacteriaofthepGEX-6p-1vector;LaneM.PageRulerPrestainedProteinLadder;Lane3.TheIPTG-inducedrecombinantbacteriaofthepET-32avector;Lane4.TheIPTG-inducedrecombinantbacteriaofthepET-32a-PDCoV-N23 图2-3重组蛋白的纯化M.蛋白Marker；1.纯化后的pGEX-6p-PDCoV-N蛋白；2.纯化后的pET-32a-PDCoV-N蛋白Fig2-3PurificationofrecombinantproteinLaneM.PageRulerPrestainedProteinLadder;Lane1.PurifiedpGEX-6P-1-PDCoV-Nprotein;Lane2.PurifiedpET-32a-PDCoV-Nprotein图2-4重组蛋白的westernblot分析1.纯化后的pGEX-6p-1-PDCoV-N蛋白；2.纯化后的pET-32a-PDCoV-N蛋白Fig2-4WesternblotoftherecombinantproteinLane1.PurifiedpGEX-6p-1-PDCoV-Nprotein;Lane2.PurifiedpET-32a-PDCoV-Nprotein2.3.3重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的抗原性鉴定以PDCoV阳性血清作为一抗，通过westernblot对重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N进行鉴定。试验结果显示，在56kDa和64kDa处均有明显的条带（图24 2-5），表明重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N具有良好的抗原性，可以作为检测病毒抗体的诊断抗原。图2-5重组蛋白抗原性鉴定1.纯化后的pET-32a-PDCoV-N蛋白；M.蛋白Marker；2.纯化后的pGEX-6p-1-PDCoV-N蛋白Fig2-5IdentifideimmunogenicityofrecombinentproteinLane1.PurifiedpET-32a-PDCoV-Nprotein;LaneM.PageRulerPrestainedProtein;Ladder2.LanePurifiedpGEX-6p-1-PDCoV-Nprotein2.3.4重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的浓度测定通过BCA法蛋白浓度测定试剂盒提供的标准曲线得出重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N的蛋白浓度分别为526.09µg/mL和494.85µg/mL。2.4讨论研究表明，TGEV的N蛋白在病毒的结构蛋白中含量最高，在感染的细胞中能得到有效的表达，同时具有良好的免疫原性，因此，猪在感染TGEV的早期，病猪体内就能产生[91]抗N蛋白的高水平抗体。同样，PEDV的N蛋白在病毒的结构蛋白中所占比例最大，在感[39]染初期能产生针对N蛋白的抗体。又鉴于TGEV和PEDV等冠状病毒的N蛋白高度保守，[46,98-101]因此常利用N蛋白建立分子生物学诊断方法。基于以上理论基础表明，PDCoVN蛋白非常适合作为检测病毒抗体的诊断抗原。25 为了有效的在大肠杆菌中表达出PDCoVN基因，本研究根据大肠杆菌密码子偏嗜性，对PDCoVN基因进行密码子优化，人工合成了PDCoVN基因。为了避免在建立诊断方法时出现交叉反应，本研究将优化的PDCoVN基因分别连接至原核表达载体pET-32a和pGEX-6P-1中，以获得带有His标签和GST标签的两种PDCoV重组N蛋白。根据上述试验设计，PDCoVN基因成功在大肠杆菌中表达，获得了重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N。对重组蛋白进行超声破碎处理后，经SDS-PAGE分析获得的重组蛋白均为可溶性蛋白，因此本研究利用过镍柱的方法获得了纯化的重组蛋白。本研究利用PDCoV阳性血清对纯化的重组蛋白进行了鉴定，试验结果显示重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N均可以被PDCoV阳性血清识别，表明能够用于检测PDCoV抗体的诊断抗原。26 3PDCoV重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价3.1主要材料3.1.1血清PDCoV阳性血清、PEDV阳性血清、TEGV阳性血清、pGARV阳性血清、CSFV阳性血清、PCV-2阳性血清、PRV阳性血清、PRRSV阳性血清，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，血清于-20℃保存备用。3.1.2主要试剂RNA提取试剂盒（Qiagen）；反转录试剂盒（TaKaRa）；ExTaqDNA聚合酶（TaKaRa）；2×预混酶（TaKaRa）；T4DNALigase（Fermentas）；96孔酶标板（Costar）；脱脂奶粉（BD）；Tween-20（Amresco）；辣根过氧化氢酶（HRP）标记羊抗猪二抗（Sigma）；TMB底物溶液（Amresco）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（Solarbio）；2×蛋白上样缓冲液（Solarbio）。3.1.3主要仪器微量移液器（GA96826-P2，GILSON）；基因扩增仪（C1000Touch，Bio-Rad）；酶标仪（ELX808，BioTEK）；半干转印仪（Trans-BlotSDCell，Bio-Rad）；凝胶成像仪（GelDocXR+，Bio-Rad）。3.1.4相关试剂配制碳酸盐缓冲液（0.05M，pH9.6）：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，定容于1000mLddH2O。洗涤液：含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。封闭液（5%的脱脂奶粉）：20mLPBS，5g脱脂奶粉。终止液（2M盐酸）：5.55mL98%浓硫酸，44.45mLddH2O。27 3.2试验方法3.2.1PDCoV阴性血清的收集收集黑龙江省部分猪场的猪粪便样品，利用RT-PCR方法筛选出PDCoV阴性猪场。并从筛选的阴性猪场中收集未吮初乳的健康仔猪的血清。具体如下：表3-1PDCoVM基因引物Table3-1PrimerofPDCoVMgene基因片段引物序列PDCoV-M-F5′-ATCCTCCAAGGAGGCTATGC-3′PDCoV-M-R5′-GCGAATTCTGGATCGTTGTT-3′3.2.1.1病毒RNA的提取1.用无菌的500µLPBS稀释收集的猪肛拭子于2mL离心管中，并编号。2.将离心管于5000×g离心10min，取上清备用。3.取试剂盒提供的离心管加入560µLAVL、5.6µLcarrierRNA混匀，在加入140µL上述处理的液体，并在荡器中振荡15s。4.将离心管静置5min后，加入560µL无水乙醇，震荡15s。5.将制备管置于新的离心管中，加入630µL混合液于柱子中，8000×g离心30s。6.加入500µLAW1于柱子中，8000×g离心1min，弃液。7.加入500µLAW2于柱子中，20000×g，离心3min，弃液。再20000×g空离1min。8.加入40µLAVE于柱子中，静置1min，再8000×g离心1min。收集离心液于-20℃保存备用。3.2.1.2病毒RNA的反转录建立20µL反转录体系：OligodT1µLdNTP1µLRandomprimers1µL5×primescripttwoBuffer4µL反转录酶0.5µL28 抑制剂0.5µL病毒RNA12µL1.取病毒RNA12µL于PCR管，再加入1µLRandomprimers，1µLOligodT，放入水浴锅中，70℃水浴10min。2.加入4µL的5×primescripttwoBuffer、反转录酶0.5µL以及抑制剂0.5µL，42℃水浴1h，再70℃水浴15min。3.2.1.3PDCoVRT-PCR检测建立50µLRT-PCR体系：ddH2O19µL2×预混酶25µL上下游引物各2µL模板2µLRT-PCR反应条件：95℃5min98℃10min55℃30s30循环72℃2min72℃7min取3μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳中进行鉴定。3.2.2反应条件的确定3.2.2.1重组蛋白最佳包被浓度与血清稀释度的确定用0.05M的CBS作为抗原包被液，将纯化的pET-32a-PDCoV-N蛋白稀释为2ng/µL、1ng/µL、0.5ng/µL、0.25ng/µL、0.125ng/µL，再以100µL/孔加入96孔酶标板中，并置于37℃恒温箱中孵育过夜。取出酶标板后弃液，用PBST洗涤3次并拍干。再200µL/孔加入5%脱脂乳置于37℃恒温箱中封闭2h。封闭后取出酶标板去液，再用PBST洗涤3次，洗涤后拍干备用。将PDCoV阳性和阴性血清用灭菌PBS以1/50、1/100、1/200、1/400、1/800倍比梯度稀释，再将每个稀释度的血清以100µL/孔加入到不同包被浓度的96孔酶29 标板中，并置于37℃恒温箱中孵育1h。孵育后取出酶标板去液，用PBST洗涤4次、拍干。洗涤后以100µL/孔加入1/5000稀释的HRP标记的抗猪酶标二抗，并置于37℃恒温箱中孵育1h。孵育后取出96孔酶标板去液，再用PBST洗涤4次。拍干后以100µL/孔加入TMB底物溶液，置于37℃恒温箱中避光作用10min，再加入终止液终止反应。最后96孔酶标板置于酶标仪中读取OD450吸光度值。通过方阵法算出各个PDCoV阳性和阴性对照的P/N值，并结合OD450吸光度值确定最佳的包被浓度和血清稀释度。3.2.2.2最佳酶标二抗稀释度的确定以确定的最佳包被浓度包被96孔酶标板，再用最佳血清稀释度稀释PDCoV阴性和阳性血清作为一抗，100µL/孔各加12孔，孵育1h。孵育后用PBST洗涤并拍干。将酶标二抗分别稀释成1/2500、1/5000、1/7500、1/10000分别以100µL/孔加入到96孔酶标板中，每个稀释度重复3次，其余步骤与3.2.2.1相同。算出4组PDCoV阳性和阴性对照的P/N值，并结合OD450吸光度值确定最佳的酶标二抗稀释度。3.2.2.3最佳孵育时间的确定确定最佳包被浓度、血清稀释度及酶标二抗稀释度后，加入血清及酶标二抗置于37℃恒温箱中分别孵育30min、45min、60min三个不同时间，并做3个重复。其余步骤与3.2.1.1相同。最后算出9组PDCoV阳性和阴性对照的P/N值，并结合OD450吸光度值确定最佳孵育时间。3.2.3阴阳性临界值（cut-offvalue）的确定本研究阴阳性判定标准采用cut-off值法，利用rPDCoV-N-ELISA检测筛选出的56份PDCoV阴性猪血清样本，每份重复3次。再将每份阴性血清OD450吸光度的平均值转换成样本百分反应活性（Percentreactivity，PR），PR（样本）=[OD450（样本）-OD450（阴性）]/[OD450（阳性）-OD450（阴性）]×100%。并算出所有阴性血清的PR平均值和标准差（SD）。3.2.4特异性试验在已确定的最佳反应条件下对PRV、PRRSV、PCV-2、pGARV、TEGV、PEDV以及CSFV的阳性血清进行rPDCoV-N-ELISA检测，每项重复3次，同时设置PDCoV的阳性30 及阴性对照。3.2.5重复性试验3.2.5.1批内重复性试验在已确定的最佳反应条件下，对6份PDCoV抗体水平不同的猪血清样本进行rPDCoV-N-ELISA检测，每份猪血清样本重复8孔，结果进行统计学分析。3.2.5.2批间重复性试验用同一批纯化的蛋白作为包被抗原，利用6份PDCoV抗体水平不同的猪血清样本，在4个不同的时间进行rPDCoV-N-ELISA检测，每份猪血清样本重复3孔，结果进行统计学分析。用4批不同批次纯化的蛋白作为包被抗原，利用6份PDCoV抗体水平不同的猪血清样本进行rPDCoV-N-ELISA检测，每份猪血清样本重复3孔，结果进行统计学分析。3.2.6ROC曲线分析利用rPDCoV-N-ELISA和westernblot（pGEX-6P-1-PDCoV-N）分别对62份猪血清样本进行PDCoV抗体检测，再以westernblot的结果为标准利用SPSS统计学软件绘制ROC曲线，对rPDCoV-N-ELISA进行敏感性和特异性分析。3.2.7现地试验利用rPDCoV-N-ELISA对黑龙江省15个猪场收集的319份猪血清样本进行PDCoV抗体检测。319份猪血清样本收集自2014年1月至2015年6月，其中210份猪血清样本收集自9个未发生腹泻的猪场，109份猪血清样本收集自6个发生腹泻的猪场。每份猪血清样本检测3次，同时设阳性对照及阴性对照，最后将OD450吸光度值转换为PR值进行分析。3.3结果3.3.1PDCoV阴性血清的收集利用RT-PCR方法确定为PDCoV阴性的猪场中共收集了56份PDCoV阴性猪血清。31 3.3.2反应条件的确定3.3.2.1重组蛋白最佳包被浓度与血清稀释度的确定如表3-2所示，包被浓度较低（0.125ng/µL、0.25ng/µL），且血清稀释度较高（1/400、1/800）时，会导致阳性对照的吸光度值偏低；包被浓度较高（2ng/µL），且血清稀释度较低（1/50）时，非特异性结合影响较大，导致阴性对照的吸光度值偏高。当重组蛋白包被浓度为1ng/µL、血清稀释度为1/200时，阳性对照的吸光度值在1.0以上，阴性对照的吸光度值在0.2以下，且P/N值较大。因此确定的最佳包被浓度为1ng/µL、最佳血清稀释度为1/200。表3-2方阵滴定结果Table3-2ResultofcheckerboardtitrationOD450吸光度值蛋白包被浓度血清稀释浓度2ng/µL1ng/µL0.5ng/µL0.25ng/µL0.125ng/µL3.6743.3212.9462.412.221/500.4120.3960.3540.3060.241P/N8.9178.3868.3227.8759.2112.7492.5442.412.2221.9421/1000.2640.2480.2220.1970.184P/N10.41210.25810.85511.27910.5542.2612.1121.9011.7461.531/2000.210.1840.170.1580.141P/N10.76611.47811.18211.05110.8511.6771.411.1090.9320.8471/4000.1640.1420.120.1050.098P/N10.2259.92959.2418.8768.6420.9880.8780.7630.6510.6141/8000.1410.1020.0890.0810.074P/N7.0078.6078.5738.0378.2973.3.2.2最佳酶标二抗稀释度的确定如表3-3所示，酶标二抗稀释度为1/2500时，阳性对照和阴性对照的吸光度值均较大；相反，酶标二抗稀释度为1/10000时，阳性对照和阴性对照的吸光度值均较小。当酶标二抗稀释度为1/7500时，阳性对照的吸光度值在1.0以上，阴性对照的吸光度值在0.2以下，且P/N值较大，因此确定的最佳酶标二抗稀释度为1/7500。32 3.3.2.3最佳抗体孵育时间的确定如表3-4所示，抗体孵育时间较短时，阳性对照及阴性对照的吸光度值均较低。当一抗孵育时间和酶标二抗孵育时间均为60min时，阳性对照的吸光度值在1.0以上，阴性对照的吸光度值在0.2以下，且P/N值较大，因此确定最佳一抗孵育时间和酶标二抗孵育时间均为60min。表3-3酶标二抗最佳稀释度的确定Table3-3OptimizationofconcentrationoftheHRP-conjugatedantibodyreactionOD450吸光度值酶标二抗稀释浓度血清稀释浓度1/25001/50001/75001/100003.2462.0491.5210.8761/2000.3870.1970.1430.124P/N8.38710.40110.6367.064表3-4最佳血清孵育时间和酶标二抗孵育时间的确定Table3-4OptimizationofreactiontimeoftestedserumandHRP-conjugatedantibodyOD450吸光度值血清孵育时间酶标二抗孵育时间30min45min60min0.740.810.9830min0.0920.1070.12P/N8.0437.5718.1660.9641.1121.33545min0.1280.1350.147P/N7.5318.2379.0811.121.3011.54160min0.1290.1350.149P/N8.6829.63710.3423.3.3阴阳性临界值（cut-offvalue）的确定56份阴性血清经rPDCoV-N-ELISA检测后，以血清样本数为横坐标，以PR值为纵坐33 标，绘制了阴性血清PR值分布图（图3-1）。所有阴性血清样本PR值经统计学处理，得到样本的平均值和标准差（SD）分别为20.9和13.8。因此，本研究得到的rPDCoV-N-ELISA阴阳性临界值为48.5（平均值+2×SD）。图3-1Cut-off值的测定Fig3-1Determinationofthecut-offvalue3.3.4特异性试验在最佳反应条件下对PRV、PRRSV、PCV-2、pGARV、TEGV、PEDV、CSFV的阳性血清进行rPDCoV-N-ELISA检测。试验结果表明，重组蛋白与7种常见猪病的阳性的PR值均小于48.5，表明该方法的诊断抗原pET-32a-PDCoV-N与上述7种猪病的阳性血清不发生交叉反应（图3-2）。34 图3-2特异性试验结果Fig3-2Resultofspecificitytest3.3.5重复性试验批内重复性试验及批间重复性试验的变异系数（C/V）均小于15%（表3-5，3-6，3-7），表明rPDCoV-N-ELISA具有良好的重复性。表3-5批内重复性试验结果Table3-5Resultofintro-batchrepetitiontestPRValueSeraRepeattimesC/V%S1125.5113.7128.7109.5122.6118.8127.4120.15.543S298.695.791.494.897.299.392.796.72.867S377.586.784.971.487.179.986.290.47.531S457.655.954.862.460.462.755.754.25.895S543.540.240.849.444.846.147.840.37.999S629.422.322.426.727.826.122.524.710.721表3-6批间重复性试验结果Table3-6Resultofinter-batchrepetitiontestPRValueSeraRepeattimesC/V%S1112.8125.4132.8135.68.043S287.497.586.198.77.132S373.276.170.486.39.065S456.868.159.764.98.142S541.543.748.953.211.237S630.235.937.231.010.39835 表3-7批间重复性试验结果Table3-7Resultofinter-batchrepetitiontestPRValueSeraRepeattimes(differentpurificationbatches)C/V%S1125.4109.7115.6131.28.006S287.598.695.285.76.703S364.582.168.377.811.161S450.847.462.352.911.963S544.746.252.753.89.254S626.724.428.924.18.6113.3.6ROC曲线分析ROC曲线分析得出，当阴阳性临界值为48.9时，与westernblot相比，rPDCoV-N-ELISA的敏感性和特异性分别可以达到100%和90.4%，且ROC曲线下面积为0.962，表明具有较高的诊断准确性（图3-3）。同时，也进一步验证了本研究确定的阴阳性临界值48.5可以作为该诊断方法判定标准。36 图3-3ROC曲线（westernblot为标准）Fig3-3TheROCcurveusingwesternblotasdiagnosticstandard3.3.7现地试验如表3-8所示，对黑龙江部分地区15个猪场319份猪血清样本进行rPDCoV-N-ELISA检测分析得出，样本总阳性率为11.59%（37/319），其中未发生腹泻猪场血清样本中的PDCoV抗体阳性率为3.33%（7/210），发生腹泻猪场血清样本中的PDCoV抗体阳性率为27.52%（30/109）。表3-8rPDCoV-N-ELISA检测样本结果Table3-8DetectionofrPDCoV-N-ELISAinfieldsamplesPDCoV抗体阳性率未腹泻猪场3.33%（7/210）腹泻猪场27.52%（30/109）总阳性率11.59%（37/319）37 3.4讨论ELISA检测技术具备操作简易、价格低廉、快速、高通量等特点，尤其是间接ELISA在病毒学、血清学及免疫学等领域得到了较高的认可。大量研究表明，冠状病毒的N蛋白[25,100-102]在建立分子生物学诊断技术中具有较好的应用前景。因此本研究选用PDCoVN蛋白作为诊断抗原建立了检测抗体的间接ELISA诊断方法。序列比对得出，PDCoVN蛋白与PEDV（strainCV777），TGEV（strainH）以及PRCV（strainISU-1）等病毒的N蛋白氨基酸同源性较低，分别为22.2%、28.2%以及18.4%，表明PDCoVN蛋白与上述病毒的阳性血清发生交叉反应的可能性较小。而且，特异性试验表明重组蛋白pET-32a-PDCoV-N与PRV、PRRSV、PCV-2、pGARV、TEGV、PEDV以及CSFV的阳性血清不发生交叉反应。重复性试验得出，批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于15%，表明rPDCoV-N-ELISA具有良好的重复性。在ELISA诊断方法中，阴阳性临界值是的判定样本血清的标准，采用cut-off值法，可使检测的结果更加可靠，目前该方法在其他商品化的ELISA试剂盒中取得了较好的效果。rPDCoV-N-ELISA作为一种新建立的诊断方法，与其他方法进行对比试验非常必要。由于目前还没有PDCoV相关的商品化试剂盒，本研究以westernblot为标准进行了对比试验。通过ROC曲线分析得出，当PRcut-off值为48.9时，与westernblot相比，rPDCoV-N-ELISA的敏感性和特异性分别为100%和90.4%。而上述结果与本研究确定的阴阳性临界值48.5极为接近，说明本研究确定的rPDCoV-N-ELISA阴阳性临界值比较可靠。利用本研究建立的rPDCoV-N-ELISA对黑龙江部分地区进行血清学调查，得出黑龙江部分地区PDCoV抗体阳性率达到了11.59%，呈较低的流行性，其中未发生腹泻猪场中PDCoV抗体阳性率为3.33%，发生腹泻猪场中PDCoV抗体阳性率为27.52%。38 39 4结论本研究成功获得了PDCoV重组N蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N，经鉴定重组蛋白均可以被PDCoV阳性血清识别，具有良好的抗原性；成功建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法，与westernblot相比，该方法的敏感性和特异性分别为100%和90.4%；对黑龙江省部分地区进行PDCoV血清学调查发现，猪群中PDCoV抗体阳性率为11.59%，呈较低的流行性。40 41 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causedbyFusobacteriumnecrophorum[J].Anaerobe,2010,16(4):317-32051 致谢时光匆匆，光阴似箭！值此毕业论文完成之际，我首先由衷感谢我的导师孙东波教授！感谢恩师对我的殷切教诲、辛勤培养和在生活上、学习上的帮助。恩师严谨的科研态度、对工作一丝不苟、精益求精的精神、实事求是的态度和豁达的人生观是我学习的榜样，使我在今后的学习、生活中受用一生。在研究生学习期间，恩师不仅教会了我力争独立思考的习惯，更是教会了我成为一名有担当的人。谢谢您，老师！特别感谢黑龙江八一农垦大学临床实验室武瑞教授、基础实验室郭东华教授给予我学习上指导和生活的帮助。感谢朱庆贺硕士、谷城硕士，张红硕士、王彩宏硕士、李春秋博士、高晶硕士、刘娜硕士、王欣宇硕士、耿雨菲硕士、姚爽硕士、赵喜文硕士、王恩雨硕士、魏姗硕士、王志慧硕士、张备硕士、刘秋瑾硕士、乔成鹏硕士、朱金海硕士、蒋剑成硕士、张思瑶硕士给予的帮助！感谢哈尔滨兽医研究所猪消化道创新团队首席科学家冯力研究员、陈建飞副研究员、张鑫副研究员、时洪艳副研究员、刘建波博士、袁婧博士的在学习上的指导。特别感谢石达师叔的关心和帮助。感谢朱向东博士、张家林博士、常铁成博士、董慧博士、王潇博博士、王宇飞硕士、季朝阳硕士、王鑫硕士、朱蕴暖硕士、卢曼曼硕士、高冉硕士、丛广义硕士、刘烨硕士，他们的帮助促进了本论文的顺利完成。感谢室友朱寓硕士、刘阳阳硕士、赵静虎硕士、陈杰硕士、宋坤硕士、徐云飞硕士为我营造了一个舒适的休息环境，让我在学习之余能放松疲劳的身心。感谢各位室友对我各各方面的关心和帮助。感谢同班所有同学以及任课老师的帮助。衷心的感谢我的父母、哥哥和嫂子对我多年来在外求学的鼓励和支持，特别要感谢卢曼曼女士在生活上的陪伴！最后，再次感谢所有帮助过我的人。52 53 附录PDCoVN基因密码子优化序列比对（1seq为优化后序列，2seq为优化前序列）1seq:ATGGCCGCACCAGTTGTGCCTACGACGGATGCA332seq:ATGGCCGCACCAGTAGTCCCTACTACTGACGCG1seq:TCTTGGTTTCAGGTTCTGAAAGCCCAGAACAAG662seq:TCTTGGTTTCAGGTGCTCAAAGCTCAAAACAAA1seq:AAAGCTACACATCCGCAGTTTCGCGGCAATGGC992seq:AAGGCTACTCATCCTCAGTTTCGTGGCAATGGA1seq:GTTCCACTGAATAGTGCTATCAAACCAGCGGAA1322seq:GTTCCGCTTAACTCCGCCATCAAACCCGCTGAA1seq:AATCATGGCTATTGGTTACGCTATACCCGTCAG1652seq:AACCATGGCTACTGGCTGCGTTACACCAGACAA1seq:AAACCTGGTGGCACCCCAATTCCTCCTTCTTAT1982seq:AAGCCAGGTGGTACTCCGATTCCTCCATCCTAT1seq:GCATTTTATTATACGGGCACCGGTCCACGCGGC2312seq:GCCTTTTATTATACTGGCACAGGTCCCAGAGGA1seq:AATCTGAAATATGGCGAACTGCCTCCAAATGAT2642seq:AATCTTAAGTATGGTGAACTCCCTCCTAATGAT1seq:ACACCAGCGACGACCCGTGTGACCTGGGTTAAA2972seq:ACCCCAGCAACCACTCGTGTTACTTGGGTTAAG1seq:GGCTCTGGCGCCGATACAAGTATCAAACCTCAT3302seq:GGTTCGGGAGCTGACACTTCTATTAAGCCTCAT1seq:GTTGCGAAACGTAATCCTAACAACCCTAAACAT3632seq:GTTGCCAAACGCAACCCCAACAATCCTAAACAT1seq:AGCTGTTACCGTTACGCTTTCCGACGGGCGATG3962seq:AGCTGCTACCTCTCCGATTCCCAACCGGAGATG1seq:GTCCGGCCCAGGGCTTTCGCGTTGATCCATTCA4292seq:GCCCAGCTCAAGGTTTCAGAGTTGACCCCTTCA1seq:ATGCTCGTGGTCGTCCGCAGGAACGCGGTAGT4622seq:ACGCTAGAGGAAGACCTCAGGAGCGTGGAAGT1seq:GGTCCCCGTAGTCAGAGTGTTAATTCTCGTGGT4952seq:GGCCCAAGATCTCAATCTGTTAACTCCAGAGGC1seq:ACTGGTAATCAGCCTCGCAAACGTGATCAGAGC5282seq:ACAGGCAATCAGCCCAGGAAACGCGACCAATCT1seq:GCCCCTGCGGCAGTTCGTCGGAAAACACAGCAT5612seq:GCACCCGCTGCGGTACGTCGTAAGACCCAACAT1seq:CAGGCTCCTAAACGTACACTGCCGAAAGGCAAA5942seq:CAAGCTCCCAAGCGGACTTTACCCAAGGGTAAA1seq:ACGATCTCACAGGTGTTTGGCAATCGCTCACGC6272seqACCATTTCTCAGGTATTTGGCAACCGGTCTCGT54 1seq:ACGGGTGCCAATGTGGGTAGCGCTGATACGGAA6602seq:ACTGGTGCCAATGTCGGCTCTGCAGACACTGAG1seq:AAAACGGGTATGGCCGATCCGCGTATCATGGCC6932seq:AAGACGGGTATGGCTGATCCTCGCATCATGGCT1seq:TTAGCTCGCCATGTTCCGGGCGTGCAGGAAATG7262seq:CTAGCCAGACATGTGCCTGGTGTTCAGGAAATG1seq:CTGTTTGCCGGTCACTTGGAATCTAATTTTCAG7592seq:CTTTTCGCTGGCCACCTTGAGAGCAACTTTCAG1seq:GCTGGTGCGATTACCCTGACCTTTAGCTATAGT7922seq:GCGGGGGCAATTACCCTTACCTTCTCTTACTCA1seq:ATTACCGTTAAAGAAGGTAGCCCGGATTATGAA8252seq:ATCACAGTCAAGGAGGGTTCTCCTGACTATGAG1seq:CGTCTGAAAGATGCACTGAATACAGTTGTGAAT8582seq:AGACTTAAGGATGCGCTCAACACGGTCGTTAAC1seq:CAGACCTATGAACCACCGACCAAACCTACCAAA8912seq:CAGACCTATGAGCCACCCACCAAACCAACTAAG1seq:GATAAAAAACCTGATAAACAGGATCAGAGCGCC9242seq:GACAAGAAGCCTGACAAACAAGACCAGTCTGCT1seq:AAACCTAAACAGCAGAAAAAACCGAAAAAAGTG9572seq:AAACCCAAACAGCAGAAGAAACCTAAAAAGGTA1seq:ACACTGCCAGCAGATAAACAGGATTGGGAATGG9902seq:ACTCTGCCAGCAGACAAACAGGATTGGGAGTGG1seq:GATGATGCTTTTGAAATTAAACAGGAATCTGCG10232seq:GATGATGCTTTTGAGATAAAGCAGGAATCAGCA1seq:GCCTAA10292seq:GCGTAG55 PDCoVN基因碱基序列对比6183655637078104124128144176182183222264270283297324370384390398405487500534HKU15-44/2009CCTGCGTGCTCTCGTTAGGACTCCCCCCHKU15-155/2010CCTGCGTGCCCTCGTTAGGGCCCCTTCCCHN/CHN-AN-2004CCTGCGTGCCCTCGGTAGGGCCCCTTCTCHN/CH-Sichuan-S27/2012CCTCCGTGCTCCCGTTAGGACCCCTTCACHN/CHNHN-2014TCTGCGTGCTCTCGTTAGGGCCCCTTCCCHN/CHN-JS-2014CCTGCGTGCTCTCGTTAGGACCCCTTCACHN/CHNHB-2014CCTGCGTGCTCCCGTTAGGACTCCCTCCCHN/CH-SXD1/2015CCTGCGTGCTCCCGTTAGGACTCCCTCCCHN/CHJXNI2/2015CCTGCGTGCTCCCGTTAGGACTCCCTCCCHN/NHTCTGTGTGCTCTCGTCAGGGCCCCTTCCKOR/KNU14-04/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCTTCATHA/S5015L/2015TTGGTGCGCCCCCGTTTGAGCCTTTTCTTHA/S5011/2015TTGGTGCGCCCCCGTTTGAGCCTTTTCTUSA/Minnesota/2013TCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCTTCAUSA/Illinois121/2014TCTGCGTTATTTCGTTAGGACCCCTTCAUSA/Illinois133/2014TCTGCGTGCTCTTCTTAGGACCCCTTCAUSA/Illinois134/2014TCTGCGTGCTCTTCTTAGGACCCCTTCAUSA/Illinois136/2014TCTGCGTTATTTCGTTAGGACCCCTTCAUSA/Ohio137/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGATCCCTTCAUSA/Ohio/OH1987/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGATCCCTTCAUSA/Nebraska209/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAAGACCCCTTCAUSA/Nebraska210/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAAGACCCCTTCAUSA/Minnesota159/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCTTCAUSA/Illinois/IL2768/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCTTCA56 USA/Indiana/IN2847/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCTTCAUSA/PA3148/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCTTCAUSA/Iowa/IA8734/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCTTCAUSA/SD3424/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGATCCCTTCAUSA/Nebraska/NE3579/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAAGACCCCTTCAUSA/Illinois272/2014TCTGCGTTCTTTCGTTAGGACCCCTTCAUSA/Illinois273/2014TCTGCGTTCTTTCGTTAGGACCCCTTCAUSA/OhioCVM1/2014TCTGCTTGCTCTCCTTAGGATCCCCTCCUSA/Minnesota442/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGATCCCTTTAUSA/Kentucky/KY4813/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCCTCAUSA/Minnesota214/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGATCCCCTTAUSA/Minnesota292/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCAUSA/Michigan8977/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCCTCAUSA/Michigan/MI6148/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCAUSA/Ohio444/2014TCTGCTTGCTCTCCTTAGGATCCCCTCAUSA/Ohio445/2014TCTGCTTGCTCTCCTTAGGATCCCCTCAUSA/Michigan447/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCAUSA/Michigan448/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCAUSA/Illinois449/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCCTCAUSA/NorthCarolina452/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCCTCAUSA/Ohio/OH11846/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCAUSA/Indiana453/2014TCTGCGTGCTCTCCTTAGGATCCCCTCAUSA/Minnesota454/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCAUSA/Minnesota455/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCAUSA/Illinois/2014/026PDVTCTGCGTGCTCTCCTTAGGACCCCCTCAUSA/Iowa459/2014TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCAUSA/Arkansas61/2015TCTGCGTGCTTTCGTTAGGACCCCCTCA57 552558564570580585623627633645723729732761762771777786795809825846858876879905906HKU15-44/2009GAACTCCTTCATCCGTTTCGGCCCCACHKU15-155/2010GAACTCCTTCATCCGTTTCGGCCCCACCHN/CHN-AN-2004GAACTCCTTTATCCGCGTGGGCTCCGCCHN/CH-Sichuan-S27/2012GGACTCCTTCATCCGTTTCGGTCCCACCHN/CHNHN-2014GAACTTCTTCATCCGTTTCGGCCCCACCHN/CHN-JS-2014AGACTCCCTCATCCATTTCGGTCCCACCHN/CHNHB-2014GAACTCCTTCATCCGTTTCGGCCCCACCHN/CH-SXD1/2015GAACTCTCTCATCCATTTCGGTCCCACCHN/CHJXNI2/2015GAACTCTCTCATCCATTTCGGTCCCACCHN/NHGAACTCCCTCGTCCGTTTCGGTCCCACKOR/KNU14-04/2014GGACTCCCTCATCCGTTCCGGTTTCACTHA/S5015L/2015AAATTCCTCCACCCGTGTGGGCCCTATTHA/S5011/2015AAATTCCTCCACCCGTGTGGGCCCTATUSA/Minnesota/2013GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Illinois121/2014GGACTCCTTCATCTGTTCCGGTCTCACUSA/Illinois133/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Illinois134/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Illinois136/2014GGACTCCTTCATCTGTTCCGGTCTCACUSA/Ohio137/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Ohio/OH1987/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Nebraska209/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Nebraska210/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Minnesota159/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Illinois/IL2768/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/Indiana/IN2847/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCACUSA/PA3148/2014GGACTCCTTCATCCGTTCCGGTCTCAC58 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PDCoVN基因同源性（HKU15-44/2009为参考序列）HKU15-44/2009HKU15-44/2009HKU15-44/2009(%)(%)(%)HKU15-155/201099.6USA/Ohio137/201499.0USA/Minnesota292/201499.0CHN/CHN-AN-200498.8USA/Ohio/OH1987/201499.0USA/Michigan8977/201499.0CHN/CH-Sichuan-S27/201299.3USA/Nebraska209/201499.0USA/Michigan/MI6148/201498.1CHN/CHNHN-201499.5USA/Nebraska210/201499.0USA/Ohio444/201498.9CHN/CHN-JS-201499.2USA/Minnesota159/201499.1USA/Ohio445/201499.8CHN/CHNHB-201499.9USA/Illinois/IL2768/201499.1USA/Michigan447/201499.1CHN/CH-SXD1/201599.5USA/Indiana/IN2847/201499.1USA/Michigan448/201499.1CHN/CHJXNI2/201599.5USA/PA3148/201499.1USA/Illinois449/201499.1CHN/NH99.1USA/Iowa/IA8734/201499.0USA/NorthCarolina452/201499.1KOR/KNU14-04/201498.9USA/SD3424/201498.8USA/Ohio/OH11846/201499.0THA/S5015L/201597.5USA/Nebraska/NE3579/201499.0USA/Indiana453/201499.0THA/S5011/201597.5USA/Illinois272/201499.0USA/Minnesota454/201499.0USA/Minnesota/201399.1USA/Illinois273/201499.0USA/Minnesota455/201499.0USA/Illinois121/201499.8USA/OhioCVM1/201498.2USA/Iowa459/201499.0USA/Illinois133/201499.0USA/Minnesota442/201498.8USA/Arkansas61/201599.0USA/Illinois134/201499.0USA/Kentucky/KY4813/201499.1USA/Illinois136/201498.8USA/Minnesota214/201498.860 61 个人简历个人情况姓名：苏明俊性别：男民族：朝鲜族出生日期：1990年7月籍贯：辽宁省沈阳市政治面貌：群众教育背景2009.09-2013.06黑龙江八一农垦大学动物科技学院农学学士学位动物药学专业2014.09-2017.06黑龙江八一农垦大学动物科技学院农学硕士学位临床兽医学专业科研经历2016.10–2017.05大庆市指导性科技计划项目（zd-2016-092）参加人2017.01–2017.05黑龙江省博士后科研启动金一等资助（LBH-Q16188）参加人2015.01–2017.05国家自然科学基金面上项目（31472209）参加人在学期间发表论文（1）SuM,LiC,SunD,etal.Arecombinantnucleocapsidprotein-basedindirectenzyme-linkedimmunosorbentassaytodetectantibodiesagainstporcinedeltacoronavirus[J].JVetMetSci,2016,78(4):601-606.（2）LiC,SuM,SunD,etal.PrevalenceandphylogeneticanalysisofcaninekobuvirusesindiarrhoeticdogsinnortheastChina[J].JVetMetSci,2016,78(1):7-11.（3）GuoD,SuM,SunD,etal.Epidemiologicalinvestigationrevealsgeneticdiversityandhighco-infectionrateofcaninebocavirusstrainscirculatinginHeilongjiangprovince,northeastChina[J].ResVetSci,106:7-11.（4）WangX,SuM,SunD,etal.Co-circulationofcaninecoronavirusIandIIa/bwithhighprevalenceandgeneticdiversityinHeilongjiangprovince,northeastChina[J].PLoSOne,62 2016,11(1):e0146975.（5）GengY,SuM,SunD,etal.Co-circulationoftherareCPV-2cwithuniqueGln370Argsubstitution,newCPV-2bwithuniqueThr440Alasubstitution,andnewCPV-2awithhighprevalenceandvariationinHeilongjiangprovince,northeastChina[J].PLoSOne,2016,10(9):e0137288.63