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《中华蜜蜂囊状幼虫病毒生物学特性分析及其在幼虫原代细胞中复制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
＼Ｉ：Ｖ单位代码：１０１６０分类号Ｓ８９５．１２０１３２０００６８，学号：：＠辟＾聲种乂豐硕±学位论文题目：中华蜜蜂囊状幼虫病毒生物学特性分析及＾－其在幼虫原代细施中复制研究．．趣閣读ｓｔｕｄｏｆＣｈｉｎｅｓｅｂｅｅＳａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｕｓｙ－＇－苗ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓａｎｄ户马参。＇护＿ｒｅｃａｔｉｏｎｉｎｒｉｍａｒｃｅｌｌｓｉｎｌａｒｖａｅｐｌｉｐｙ審讓！‘．．＊■？Ｉｉ＊、＊—＇ＴｉＹＶ．■研究生；李慧：导师；马鸿潇＿学科专业：微生物学一论文课题起止时间２０１６：：２０１４年４月年３月论文完成时间：２０１６年３月；言耻；一－＜＇’’．Ｖｖ斟，．．．一京．山Ｖ巧 锦州医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工＾，作及取得的研究成果。据我所知除了文中特别加！乂标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含一为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。一申请学位论论文与资料若有不实之处，本人承担切相关责任。文作者签省：，方若日期：Ｍｌ－＾锦州医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解锦州医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生证在攻读学位期间论文工作的知巧产权单位属锦州医科大学。本人保毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署若单位为锦州医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署違为锦州医科大学。学校论有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磕盘，允许文被查阅和借阅。学校可＾乂公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），ｋ乂采用影印、缩印或论其他手段保存论文。文作者签雀：（Ａｔ指导教师签雀： 目录一、摘要中文论著摘要..........................................................................................................1英文论著摘要..........................................................................................................3二、英文缩略语表·.........................................................................................................6三、论文前言..........................................................................................................................7实验材料与方法......................................................................................................8结果.......................................................................................................................16讨论........................................................................................................................27结论........................................................................................................................29四、本研究创新性的自我评价....................................................................................30五、参考文献................................................................................................................31六、附录文献综述...............................................................................................................33在学期间科研成绩...............................................................................................42致谢.......................................................................................................................43个人简介.................................................................................................................................44 ·中文论著摘要·中华蜜蜂囊状幼虫病毒生物学特性分析及其在幼虫原代细胞中复制研究目的对来自陕西榆林地区疑似感染中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinesesacbroodbeedisease,CSBV)的幼虫进行分离、纯化和鉴定，鉴定正确后命名为CSBV-SXYL，并对CSBV-SXYL株病毒进行生物学特性分析。同时筛选、建立一种适用于蜜蜂源的细胞培养方法，并将CSBV-SXYL株病毒接种蜜蜂源细胞，观察CSBV-SXYL复制情况，为蜂病毒的研究和培养奠定基础。方法采用差速离心法对CSBV-SXYL株病毒进行分离、纯化，并利用RT-PCR方法、电镜观察、琼脂扩散进行鉴定。在此基础上，对CSBV-SXYL进行脂溶剂敏感性、耐酸性及耐热性等理化特性研究。同时将CSBV-SXYL接种2~3日龄中华蜜蜂幼虫，进行本体动物感染试验，通过观察幼虫生长、临床症状及病理组织变化，研究CSBV-SXYL的致病特性。比较在Grace和WH2两种昆虫细胞培养基中培养的中华蜜蜂健康幼虫原代细胞状况，筛选出适用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的最佳培养基，并通过细胞活力比较，确定用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的适宜胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS)浓度。在此基础上，将CSBV-SXYL接种在制备的中华蜜蜂幼虫原代细胞，并通过实时定量RT-PCR方法对病毒复制情况进行检测。结果纯化后的CSBV-SXYL通过电镜负染观察，发现病毒粒子直径约为30nm，呈球状二十面体病毒等轴粒子。经免疫琼脂双扩散试验，发现CSBV-SXYL能与兔抗CSBV标准阳性血清发生特异性结合反应。进行RT-PCR扩增，可获得特异1 性目的条带，经测序和BLAST比较，结果与参考株CSBV-BJ核苷酸序列同源性最高，为97.2%。理化特性分析表明，CSBV-SXYL对乙醚和氯仿不敏感；在pH3.0的条件下仍能存活；温度达到75°C致病毒失活。将CSBV-SXYL与幼虫基本食物(Basiclarvaldiet,BLD)混合后饲喂2~3日龄幼虫，3d后幼虫停止取食，3~4d时排出胎粪，5d后发现病毒组幼虫出现头部透明，背部颜色逐渐变深，表皮坚韧等临床症状。在幼虫发育后期，健康组幼虫能够化蛹，而病毒组幼虫尸体变黑。病理组织HE染色切片中发现，感染幼虫组织表皮和真皮之间形成空洞，里面充满液体水状物；同时发现，感染幼虫的组织细胞形状和细胞核变得不规则，细胞发生病变严重时，发生解体，各种细胞器破碎。中华蜜蜂幼虫原代细胞培养基筛选表明，相对于WH2培养基，在Grace培养基中生长的细胞大而圆、透明、边缘整齐，细胞活力明显高于WH2培养；含15%FBSGrace培养基更适合于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养。CSBV-SXYL接种于中华蜜蜂幼虫原代细胞，经实时定量RT-PCR方法检测表明，CSBV-SXYL能够在原代细胞中复制增殖，同时伴随宿主细胞快速分裂。结论1、采用差速离心法成功分离到1株中华蜜蜂囊状幼虫病毒，并命名为CSBV-SXYL。2、CSBV-SXYL对乙醚和氯仿等有机溶剂具有极强抵抗力；对酸性条件具有很高的稳定性，在pH3.0的条件下仍能存活；温度达到75°C及以上时易失活。3、中华蜜蜂幼虫原代细胞在含15%FBS的Grace中能够良好生长，并且CSBV-SXYL可以在该原代细胞中进行复制。关键词中华蜜蜂囊状幼虫病毒；理化特性；致病性；细胞培养；复制2 ·英文论著摘要·StudyofChinesebeeSacbroodvirusbiologicalcharacteristicsanalysisandreplicationinprimarycellsinlarvaeObjectiveChinesebeesacbroodviruswasisolatedandcalledCSBV-SXYLinthelarvaesbeinginfectedwithCSBVfromYulin,ShanxiProvince,bytheseparation,purificationandidentification.Next,thebiologicalcharacteristicsofCSBV-SXYLwasanalyzed.Atthesametime,anapplicableculturemethodforhoneybeesourcedcellswasscreenedandestablished.Afterthat,theculturedprimarycellswereinoculatedwithCSBV-SXYL,whichlaysthefoundationfortheresearchandtrainingofbeevirus.MethodsByusingdifferentialcentrifugation,CSBV-SXYLareisolatedandpurifiedandidentifiedbyRT-PCRmethodandelectronmicroscope.Atthesametime,thespecificityofCSBV-SXYLwasverifiedbyimmuneagardoublediffusionusinganti-CSBVstandardpositiveserum.Onthebasisofthis,thephysicochemicalpropertiesofCSBV-SXYLwerestudied,suchassensitivity,acidresistance,heatresistanceandsoon.Ontologyanimalinfectiontestwillbeconductedonthe2~3daysoldlarvaesbyinoculatingCSBV-SXYL.Byobservingandtestingtheinfectedlarvaegrowth,clinicalsymptoms,pathologicaltissuesectionandHEstainingetc.,CSBV-SXYLpathogenicitywastobefound.3 ComparedtheChinesebeelarvaeprimarycellsculturedintwodifferentinsectscellculturemediumofgraceandWH2,wecanscreenfortheoptimummediumofChinesebeelarvaeprimarycellscultured,andbycellviabilitycomparison,wecanalsodeterminetheconcentrationoffetalbovineserum(FBS)usedfortheculturingofChinesebeelarvaeprimarycells.Then,theculturedprimarycellswereinoculatedwithCSBV-SXYL,andthevirusreplicationwasdetectedwithreal-timequantitativeRT-PCR.ResultsItisfoundthatthediameterofvirusparticalisabout30nmandlookslikeaballwithequalshafticosahedronvirusparticlesafterthepurificationofCSBV-SXYLbynegativestainingobservationthroughelectronmicroscopy.Bydoublediffusiontest,CSBV-SXYLwasabletoreactwithanti-CSBVstandardpositiveserum.RT-PCRamplificationwasperformedandobtainedthecharacteristicbands.BysequencingandBLAST,alignmentedwiththereferencestrains,CSBV-SXYLandCSBV-BJnucleotidesequencehomologyisupto97.2%.PhysicalandchemicalpropertiesanalysisshowedthatCSBV-SXYLcapsulemembraneisnotsensitivetoetherandchloroform,whichcanstillsurviveontheconditionofpH3.0butinactivetillthetemperaturereaches75°C.AftermixingCSBV-SXYLandbasiclarvaldiet(BLD)fedto2~3dayChinesebeelarvae,after3days,larvaestoppedingestion,at3-4day,larvaedischargedmeconium,after5day,larvaeappearedatthefrontbent,blackbodycolor,transparentheadofclinicalsymptoms,suchasinfectionafter7daysinsectbodyfilledwithparticlesofliquid,presentsthetypicalsymptomofcysticbag.Thepathologicaltissuesliceobservation,infectionlarvatissuebetweentheepidemisandthedemisholeformation,filleswithliquidwaterandaseriesofpathologicalchanges.ThebeelarvaeprimarycellculturemediumfiltershowedthatrelativetoWH2culturemedium,thegrowthofcellsintheGracemediumlarge,round,transparent,neat,noparticles,energyobviouslyhigherthanthat4 ofWH2cultivation,andthemediumcontaining15%FBSGraceismoresuitableforinbeelarvgeprimarycellculture,It’salsoobservedthattheinoculatedCSBVviruscouldreplicatebyreal-timequantitativeRT-PCRmethodprobedetectiondandproliferatebyreal-timequantitativeRT-PCRmethodprobedetectiondandproliferaterapidlyalongwiththedivisionofthehostcells.Conclusions1、SteainsChinsesbeeSacbroodviruswassuccessfullyisolatedandnamedforCSBV-SXYL.2、CSBV-SXYLhasastrongrtesistancetoether,chloroformandotherorganicsolventsandenjoyshighstabilityinacidcondition,itcanstillsurviveundertheconditionofpH3.0,butbecomesinactivewhenthetemperatureisabove75°C.3、TheChinsesbeelavaeprimarycellsgrewwellinMediumGracewith15%FBS,inwhichthereplicationofCSBVcouldproceed.KeywordsChinesesacbroodvirus;Physicalandchemicalproperties;Pathogenic;cellculture;fetalbovineserum5 ·英文缩略语表·英文缩写英文全称中文译名SBVSacbroodvirus囊状幼虫病毒CSBVChinesesacbroodvirus中华蜜蜂囊状幼虫病毒CSBDChineseSacbroodDisease中华蜜蜂囊状幼虫病BQCVBlackqueencellvirus蜜蜂黑蜂王台病毒DWVDeformedwingvirus残翅病毒ABPVAcutebeeparalysisvirus蜜蜂急性麻痹病毒PBSPhosphatebuffer磷酸盐缓冲液BLDBasiclarvaldiet幼虫基本食物RT-PCRReversetranscription-polymerase反转录酶-聚合酶链锁反chainreaction应PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应FBSFetalbovineserum胎牛血清KBVKashmirbeevirus蜜蜂克什米尔病毒CBPVChronicbeeparalysisvirus蜜蜂慢性麻痹病毒AGIDAgar-gelimmunodiffusion琼脂凝胶免疫扩散ELISAEnzymelinkedimmunosorbent酶联免疫吸附测定assayLAMPLoop-mediatedisothermalamplific环介导等温扩增ation6 ·论文·中华蜜蜂囊状幼虫病毒生物学特性分析及其在幼虫原代细胞中复制研究前言囊状幼虫病毒(Sacbroodvirus,SBV)为单股正链小RNA病毒，主要感染2~3日龄蜜蜂幼虫，西方蜜蜂ApismelliferaL对SBV有较强的抵抗能力，但中华蜜蜂Apisceranacerana对SBV的抵抗能力较弱，容易感染发病，把能够感染中华蜜蜂发病的这种SBV称之为中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinesesacbroodvirus,CSBV)[1]，而由CSBV所引起的中华蜜蜂病毒性疾病称之为中华蜜蜂囊状幼虫病(Chinesesacbrooddisease,CSBD)[2,3]。该病于1971年冬季首先在我国广东省佛岗、从化等地发生。1972年在南方暴发流行[4]。中华蜜蜂一旦感染，就会出现大量幼虫死亡，成蜂行为异常，寿命缩短等现象，最终可能会导致整个蜂群毁灭，至今仍在各地广泛流行[5,6]。CSBV不仅给中蜂养殖业带来了经济影响，而且破坏了生态系统平衡，且对依赖工蜂授粉的主要农作物的授粉工作造成了潜在的威胁，也不利于中蜂养殖业的发展[7~9]。然而目前还没有有关CSBV生物学特性较为全面的研究报道。同时由于没有适合于蜂病毒培养的细胞系，无法实现包括CSBV在内所有蜂病毒的细胞培养，极大限制了CSBV的深入研究，影响了其防治。近年来国内外学者试图通过对蜜蜂源细胞培养，来实现蜂病毒细胞培养，Wayne等[10]使用8~11日龄西蜂幼虫，首次成功培养了西蜂幼虫原代细胞，并接种了蜜蜂易感的黑王台病毒(Blackqueencellvirus,BQCV)、蜂残翅病毒(Deformedwingvirus,DWV)和急性麻痹病毒(Acutebeeparalysisvirus,ABPV)等，结果发现仅DWV在原代细胞培养进行复制，该研究成功的培养了蜜蜂原代细胞，并首次实现了蜂病毒在体外复制。鉴于此，本研究在对CSBV-SXYL成功分离鉴定后，系统地研究了其生物学特性，并根据CSBV对宿主及其组织的偏嗜性，选择2~3日龄中华蜜蜂幼虫作为研究对象，优选培养条件，制备中华蜜蜂幼虫原代细胞，并探7 讨CSBV在该原代细胞中复制情况，为CSBV的免疫机制和致病机理等研究奠定基础。实验材料与方法一、实验材料(一)病料样本与中华蜜蜂健康幼虫疑似感染中华蜜蜂幼虫由陕西榆林中华蜜蜂厂提供。中华蜜蜂幼虫实验蜂群购自宽甸良鑫中华蜜蜂养殖专业合作社，并在锦州医科大学实验动物养殖基地饲养，锦州医科大学实验动物养殖基地及其周边拥有丰富的蜜源，能够满足蜜蜂生长，实验索取材料均来自同一蜂群。（二）阳性血清兔抗CSBV标准阳性血清由锦州医科大学实验动物实验中心制备、保存。（三）主要试剂和试剂盒化学试剂厂家总RNA提取试剂盒美国Promega公司TrizolLSReagentInvitrogen公司BL21大连宝生物公司Grace昆虫组织培养基GIBCO公司Schneider’sInsectMediumSigma公司L-histidinesolutionSigma公司Sigma公司FetalBovineSerum(FBS)Sigma公司CMRL1066Sigma公司Hanks’SaltSigma公司Insectmediasupplement(×10)Sigma公司Gentamicin台盼蓝染液Sigma公司TransStartTMProbeqPCRSuperMix北京全式金生物技术有限公司8 (四)主要实验仪器PCR仪(HYBAID,英国)，TrizollSReagent、NanoDrop2000分光光度计购自芯起点基因科技(北京)有限公司，55P-7超速离心机(HITACHI,日本)，酶标测试仪、倒置显微镜PM-6型(OlYMPUS,日本)、单人双面净化工作台(Haier,中国)等。（五）主要溶液及培养基的配方1、磷酸盐缓冲溶液(Phosphatebuffer,PBS)140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，pH7.6。2、幼虫基本食物(Basiclarvaldiet,BLD)蜂王浆50%、葡萄糖6%、果糖6%、酵母抽出物1%，无菌水37%[11]。3、WH2培养基配方Schneider’sInsectMedium150mL,0.06ML-histidinesolution(pH6.35)200mL,FBS(hearinactivated)a50mL,CMRL106615mL,Hanks’Salts5mL,InsectMediaSupplement(×10)2mL,和Gentamicin1µL/mL。总体积为422mL；pH为6.3~6.5[10]。二、实验方法(一)中华蜜蜂囊状幼虫病毒生物学特性1、患病幼虫分离纯化及鉴定(1)病毒分离纯化：将患病幼虫放入含有少量液氮的研钵中充分研碎，分离虫体组织，加入等体积量pH7.6的PBS溶液后反复冻融2~4次，使更多虫体组织细胞裂解、病毒释放进入溶液中。将其溶液放入37°C匀浆机中充分混匀10min，取出后低速离心取上清液，加入等体积量的氯仿，37°C水浴振摇混匀10min，再次低速离心取上清液，如此重复操作3次后，与之前沉淀物的洗涤上清液混匀低速离心(低速离心为1000rpm×10min)。将这些上清液集中在5000rpm状态下离心30min，收取上清液继续15000rpm状态下离心30min，收集上清液通过0.22µm孔径的滤器过滤病毒液，储存于-80°C冰箱或液氮中。9 对健康中华蜜蜂幼虫采用上述相同操作规程，用于对照实验。(2)分子生物学鉴定①提取病毒RNA：将100µL病毒悬液与1mLTrizol混均冰浴，离心取上清液，加入200µL的氯仿混匀继续冰浴，离心取上清液加入等体积异丙醇混匀后冰浴、离心、弃上清液。往沉淀物中加入1mL75%冰乙醇离心漂洗2次，将沉淀物放于冰上自然风干。加入50µL的无RNA酶水溶解沉淀，并检测其RNA量及其浓度(以上“离心”均在4°C条件下，12000rpm离心10min)。②RT-PCR反转录及PCR扩增：病毒RNA反转录为cDNA：对所提取的RNA产物通过RNAPCRKit(AMV)Ver3.0试剂盒，进行反转录合成cDNA，引物为OligodT-AdaptorPrimer。按照反转录表1中提到的各个成分依次加入反应管中混匀瞬时离心。再以以下条件进行反转录：30°C10min,42°C30min,95°C5min,5°C5min,1个循环，-20°C保存。参照本实验建立的成熟的试验设计方法，对分离纯化病毒进行鉴定[12,13]，具体扩增反应体系见表2，PCR的循环参数为：94°C预变性2min，94°C变性45s，54°C退火45s，72°C延伸1min，30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。用TaKaRa公司生产的标准分子量DL2000DNAMarker作为标准，确定PCR产物目的条带的大小，保存图片。③PCR产物的克隆与测序：对PCR产物用DNA凝胶回收与纯化试剂盒进行回收纯化。按照PMD18-TVectorKit试剂盒说明书进行操作，将PCR产物进行连接、转化、提取质粒、双酶切鉴定、送检进行核苷酸序列测定。根据质粒测序结果，进行BLAST比较。10 表1RT-PCR反应体系组分体积(μL)mgCl2210×RTBuffer1dNTPMixture(10mM)1RNA(≤500ng/µL)1OligodT-AdaptorPrimer0.5AMVReverseTranscriptase0.5RnaseInhibitor0.3RnaseFreedH2O3.7TotalVolume10表2PCR反应体系组分体积(μL)10×PCRBuffer2.5dNTPMixture(10Mm)1.0ExTaqE0.25上游引物(10µM)0.25下游引物(10µM)0.25cDNA1.0ddH2O19.75TotalVolume25(3)特异性试验：配置含有1%琼脂糖和8%氯化钠琼脂糖板、并打成梅花七孔。在中央孔中加入兔抗CSBV免疫阳性血清，周边1、2、3孔分别加入待测纯化病毒液，4、5、6孔加健康幼虫分离液作对照，每孔添加200μL培养观察。(4)电镜负染观察：取病毒悬液5µL，垂直滴在有支持膜处理过的网上，停留数分钟后从一侧边缘吸走未吸收液体，略干后滴加2%的磷钨酸溶液染色数十秒，吸干染液电镜下观察组织中有无病毒及病毒形态等相关情况。11 2、CSBV-SXYL毒株理化特性(1)脂溶剂敏感性试验①乙醚敏感试验：将纯化CSBV-SXYL病毒液1.6mL(病毒粒子拷贝数2.14×106拷贝/µL)等体积量分装于两小瓶中，分成两组。试验组每组加入1/4量乙醚溶液，对照组只加病毒液作为对照。塞紧瓶塞后在4°C摇床中不时振荡24h。将用乙醚感作过的病毒液试验组及未经感作过的病毒对照组分别加入等量幼虫基本食物(basiclarvaldiet,BLD)中，饲喂健康幼虫，饲喂24h之后，将BLD换为不含病毒的新鲜BLD，观察幼虫生长及临床症状。②氯仿敏感性试验：将纯化CSBV-SXYL病毒液1.6mL(病毒粒子拷贝数2.14×106拷贝/µL)等体积量分装于两小瓶中，分成两组。试验组每组加入适量氯仿感作，使其病毒液最终浓度达到4.8%，对照组只加病毒液作为对照。两瓶均置4°C摇床中振荡混匀，10min后低速离心5min弃沉淀。将上清液和病毒液分别与BLD混合后，饲喂健康幼虫，饲喂24h之后，将BLD替换为不含病毒的新鲜BLD，观察幼虫生长及临床症状。(2)耐酸性试验：取纯化CSBV-SXYL病毒液1.6mL(病毒粒子拷贝数2.14×106拷贝/µL)等体积量分装于两小瓶中，分成两组。试验组每组先用0.1mol/L的HCl溶液将其病毒溶液的pH值调至到3.0左右感作2h，模拟胃酸环境。2h后再用NaHCO3溶液将处理过的病毒溶液的pH值调回至7.2，回归正常酸碱平衡环境。将pH值7.2的病毒液与未经调节的原病毒液分别与BLD混合后，饲喂健康幼虫，饲喂24h之后，将BLD换为不含病毒的新鲜BLD，观察幼虫生长及临床症状。(3)耐热性试验：将纯化CSBV-SXYL病毒液4.0mL(病毒粒子拷贝数2.14×106拷贝/µL)等体积量分装于5个小瓶中，试验组分为五组。先取出四瓶病毒液，同时将其放在四种不同温度(60°C、70°C、75°C和80°C)的水浴锅中感作1h。取出后和未经调节温度感作过的病毒原液分别与BLD混合后，饲喂健康幼虫，饲喂24h之后，将BLD换为不含病毒的新鲜BLD，观察幼虫生长及临床症状。3、中华蜜蜂幼虫人工接种感染CSBV(1)病毒接种：①试验巢脾和用具处理：试验前一星期需将试验巢脾进行冷冻12 处理，以确保此巢脾内没有活的虫卵或幼虫；而移虫针和24孔幼虫培养板则在酒精中浸泡2h，待酒精挥发后以无菌水进行冲洗即可。②食物处理：按照中华蜜蜂幼虫BLD配方，配制100mL新鲜BLD，饲喂前需35°C预热BLD使食物温度恢复至室温。③幼虫选取：试验前四天，密切观察人为插入的试验巢脾在放入24h后产卵情况，选取试验虫卵区域，并用网框线做好标记。三天后卵壳破裂进入幼虫期，选取试验区域内的1~2日龄中华蜜蜂幼虫200只移至24孔反应板中。④人工室内感染：将幼虫等分成两份，一份用于正常幼虫饲养，即健康试验组；另一份幼虫先人工饲喂含有病毒液的BLD。将培养板移入恒温恒湿(T=34.5±1°C,RH=90%)培养箱中暗室野培养。每日不断补充新鲜BLD和更换培养板，饲喂24h之后，将BLD换为不含病毒的新鲜BLD，直至幼虫停止进食，开始排便之日，用湿润滤纸轻轻将幼虫体表或残留的BLD轻轻擦拭干净，移至新的培养板中观察幼虫生长及临床症状。(2)病理组织切片病理切片制备：每天随机在病毒组和空白组中各选取3~5只幼虫，放入已含有4%多聚甲醛溶液的EP管中做好标记，浸泡固定8h后取出虫体放入包埋盒中流水冲洗多余甲醛溶液，然后选取不同浓度的乙醇溶液进行脱水处理，选取时从低浓度开始，然后再到高浓度，这样可以有效防止组织急皱收缩而出现的人工损伤，每种浓度各浸泡2h。取出包埋盒进入到二甲苯溶液中进行虫体透明处理，溶化石蜡块，将处理后的虫体放入石蜡中包埋，带冷却后进行蜡块修整，切除边缘多余石蜡并将其放入已预冷过的冰冻石蜡切片机中，石蜡切片厚度选取5µm(刚开始时可以选将切片厚度选取略大一些，但是当虫体出现后，需将其调回切片厚度5µm)，并将每个虫体切面制片3~5张，以备HE染色观察。取出固定好的组织切片进行HE染色，具体步骤为：二甲苯Ⅰ脱蜡10min；二甲苯Ⅱ脱蜡5min；无水乙醇洗去二甲苯1min×2次；不同乙醇浓度各1min；自来水洗2min;苏木精染色1min至5min；自来水洗1min；伊红染色20s至5min；自来水洗1min；85%酒精脱水20s，90%酒精1min，95%酒精1min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各2min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2min，然后将其自然风干，用中性树胶进行封片处理，于普通光学显微镜下即可观察结果。13 （二）中华蜜蜂幼虫原代细胞培养1、中华蜜蜂幼虫原代细胞制备取2~3日龄健康中华蜜蜂幼虫，放入含有75%乙醇的平皿内进行5-10min的幼虫虫体体表漂洗。取出放入以终浓度为100µ/mL双抗的PBS缓冲液中漂洗2~3次，每次要充分洗涤虫体体表外物质，但是动作要轻柔，防止虫体体表破裂。再将幼虫移入不含有血清的培养基中一层层撕碎幼虫，使其虫体组织完全暴露，此时加入胰蛋白酶-EDTA溶液进行组织消化，不时顺时针摇晃加速组织分解消化速度，观察培养基澄清度和虫体之间粘连程度，5~10min后移入倒置显微镜中观察细胞消化情况，滴加血清终止消化、1000rpm×10min离心洗涤细胞，再将其放入10%FBS-Grace[14]和WH2[10]昆虫细胞培养基中重新悬浮细胞(取出1mL细胞计数)分瓶培养，每47d根据细胞生长情况更换一次培养基，观察记录拍照。2、细胞活力检测按照胰酶消化法培养中华蜜蜂幼虫原代细胞，并分别用WH2和Grace两种不同培养基调至细胞密度为2×105个/mL入24孔细胞培养板，28°C条件下恒温培养观察；每隔4~7d半量更换新鲜细胞培养基；每隔7d收集3孔细胞，观察细胞形态，台盼兰计数，根据公式计算细胞活力。根据细胞存活率=(总细胞数-死细胞数)/总细胞数×100%，取平均值，观察细胞存活情况，在相同培养条件下，比较两种培养基培养的细胞活力，以选择更为适宜的培养基。3、Grace培养基血清浓度筛选按照胰酶消化法培养中华蜜蜂幼虫原代细胞，试验组每孔添加5%,10%,15%和20%4种不同浓度的灭活的FBS的Grace培养液进行培养[15,16]，同时设只加Grace培养基空白组和细胞加Grace培养基对照组，细胞密度调整到2.5×104个/mL，在4块96孔培养板上培养，100μL/孔，每组3个重复孔，培养时间为28d，每隔7d取出1板细胞，向每孔加入10μLCCK8溶液，将培养板在28°C培养箱内培养2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。以空白组调零，对照组细胞活力设定为100%，其他处理组吸光度值与对照组相比较计算各试验组的细胞活力。进而考察相同天数培养条件下不同胎牛血清浓度对细胞生长14 的影响，从中筛选出适宜的FBS浓度。4、统计学方法采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计分析，各组间的方差分析采用One-wayANOVA方法，多重比较采用LSD法。（三）CSBV在中华蜜蜂幼虫原代细胞中的复制1、CSBV感染中华蜜蜂幼虫原代细胞待中华蜜蜂幼虫原代细胞生长汇合度达到约80%时，用PBS液清洗2次，每瓶中华蜜蜂幼虫原代细胞接种1mLCSBV纯化病毒吸附60min。孵育后倾去病毒，用无血清Grace培养基清洗2次，加入维持液继续培养，于接毒后12,24,36,48,60,72,84,96,108和120h各收集2瓶病毒液。2、病毒液的RNA提取、反转录和荧光定量RT-PCR检测将每个时间点收集的细胞培养瓶反复冻融，12000r/min离心10min收集上清液，按照Trizol试剂盒说明书操作提取总RNA，并按反转录试剂盒说明书操作合成cDNA后，参照Ma等[17]建立的TaqManMGB探针实时荧光定量PCR方法对CSBV进行实时定量检测，该实时荧光定量PCR反应体系为25μL，包括500nmol/L正、反向引物(CSBVTMPF:5-CCTGGGAAGTTTGCTAGTATTTACG-3;CSBVTMPR:5-CCTATCACATCCATCTGGGTCAG-3)2μL、250nmol/LTaqManMGB探针(CSBVTMP:5-CGACATACCCGCAAATTCAGCACGC-3)1μL、2×PCRBuffer12.5μL、Reference0.5L、模板1μL，补水至25μL。PCR反应条件为95°C30s；1个循环；95°C5s；60°C60s；40个循环。15 结果一、患病幼虫病毒提取液纯化及鉴定（一）普通RT-PCR鉴定收集出现明显CSBD病症的疑似患病中华蜜蜂幼虫(图1)进行分离、纯化，得到待测病毒原液。对待测纯化病毒液提取总RNA并反转录为cDNA，参考CSBV(HM237361.1)基因序列设计一对PCR引物进行扩增，大小为945bp(图2)。并克隆到PMD18-T中，酶切鉴定正确(图3)。送样上海生工生物公司测序成功，测序结果经BLAST比较，与CSBV-BJ核苷酸序列同源性最高，为97.2%，将分离到的毒株命名为CSBV-SXYL。图1出现典型CSBD“囊状袋”的患病中华蜜蜂幼虫及多块巢脾16 图2目的基因扩增图3重组质粒酶切鉴定注：M为2000bpMakerA为待测病毒液片断注：Maker;ApMD18-T-vp1（二）琼脂扩散试验在免疫琼脂双扩散试验中，将加入纯化CSBV-SXYL病毒液1、2、3孔与兔抗CSBV免疫血清孔之间，均有明显沉淀线，加入健康幼虫提取液4、5、6孔与兔抗CSBV免疫血清孔之间，均没有明显沉淀线(图4)，说明待测病毒液中含有CSBV。（三）电镜观察将纯化后的病毒原液通过悬滴法进行电镜负染，结果在四万倍电镜下见到病毒粒子直径为30nm，球状二十面体病毒等轴粒子(图5)。图4免疫琼脂双扩散试验图5电镜下的病毒提取图片（×40000）注：1、2、3孔为待检测病毒液；注：标尺=200nm4、5、6孔为健康幼虫提取液17 二、理化特性（一）乙醚敏感性试验2日龄幼虫(图6A,E)饲喂含有乙醚处理过的CSBV-SXYL的BLD组和未经乙醚处理过的CSBV-SXYL的BLD组室内人工饲养3d时，幼虫均表现为停止取食，3~4d时排出胎粪(图6B,F)，将其移入垫有干燥擦镜纸的新培养板中，继续培养观察，发现幼虫体表颜色开始变深，由背部颜色开始逐渐变深，表皮坚韧(图6C,G)，室内培养10d时，体色明显变黑或深棕色(图6D,H)。表明CSBV-SXYL对乙醚有抵抗力。图6乙醚处理组与病毒对照组，幼虫临床症状注：A,E：2日龄幼虫；B,F：5日龄幼虫；C,G：7日龄幼虫；D,H：12日龄幼虫（二）氯仿敏感性试验2日龄幼虫(图7A,E)饲喂含有氯仿处理过的CSBV-SXYL的BLD组和未经氯仿处理过的CSBV-SXYL的BLD组室内人工饲养3d时，幼虫均表现为停止取食，3~4d时排出胎粪(图7B,F)，将其移入垫有干燥擦镜纸的新培养板中，继续培养观察，发现幼虫体表颜色开始变深，由背部颜色开始逐渐变深，表皮坚韧(图7C,G)，室内培养10d时，体色明显变黑或深棕色(图7D,H)。表明CSBV-SXYL对氯仿有抵抗力。18 图7氯仿处理组与病毒对照组，幼虫临床症状注：A,E：2日龄幼虫；B,F：5日龄幼虫；C,G：7日龄幼虫；D,H：12日龄幼虫（三）耐酸敏感性试验2日龄幼虫(图8A,E)饲喂含有酸处理过的CSBV-SXYL的BLD组和未经氯仿处理过的CSBV-SXYL的BLD组室内人工饲养3d时，幼虫均表现为停止取食，3~4d时排出胎粪(图8B,F)，将其移入垫有干燥擦镜纸的新培养板中，继续培养观察，发现幼虫体色开始变黄，由背部颜色开始逐渐变深，表皮坚韧(图8C,G)，幼虫后期幼虫体色变黑或深棕色(图8D,H)。表明CSBV-SXYL病毒在酸性条件具有很高的稳定性，在pH3.0的条件下仍能存活。病毒酸处理组病毒组图8酸处理组与病毒对照组，幼虫临床症状注：A,E：2日龄幼虫；B,F：5日龄幼虫；C,G：7日龄幼虫；D,H：12日龄幼虫19 （四）耐热敏感性试验2日龄幼虫(图9A~D,M)饲喂经四种温度条件下感作过的CSBV-SXYL混合BLD，室内人工饲养3d时，幼虫均表现为停止取食，3~4d时排出胎粪(图9E~H,N)，将其移入垫有干燥擦镜纸的新培养板中，继续培养观察，发现60°C、70°C和病毒未处理组的幼虫幼虫体色开始变黄，由背部颜色开始逐渐变深，表皮坚韧(图9I,J,O)，幼虫后期幼虫体色变黑或深棕色。75°C、80°C处理组的幼虫化蛹(图9K,L)，出现复眼等蛹期明显标志。表明CSBV-SXYL在温度达到75°C及以上时病毒失活。图9：CSBV与在不同温度条件下作用后饲喂幼虫，中华蜜蜂幼虫临床症状注：A~D,M：均为2日龄幼虫；E~H,N：均为5日龄幼虫；I~L,O：均为12日龄蛹20 三、本体动物感染CSBV-SXYL毒株试验（一）中华蜜蜂幼虫感染状况及临床症状2日龄中华蜜蜂幼虫(图10A,E)，经饲喂含有CSBV-SXYL的BLD组和不含病毒液的BLD组室内人工饲养3d时，幼虫均表现为停止取食，3~4d时排出胎粪(图10B,F)，将其移入垫有干燥擦镜纸的新培养板中，继续培养观察，发现接毒组幼虫体色开始变黄，由背部颜色开始逐渐变深，头部变得透明，躯体分节清楚表皮坚韧(图10C)，幼虫开始死亡，病死幼虫头上翘，幼虫后期幼虫体色变黑或深棕色(图10D)。健康组幼虫进入蛹期，出现复眼等蛹期特征(图10H)。图10健康组和接毒组，幼虫临床变化注：A,E：2日龄幼虫；B,F：5日龄幼虫；C,G：7日龄幼虫；D,H：12日龄幼虫（二）幼虫病理切片HE染色健康组中华蜜蜂幼虫病理组织切片中可以观察到，组织细胞完整，细胞核明显，HE染色为粉红色，表皮与真皮层之间有空隙且都完整，但无大量水状液体出现(图11A,C,E)。病毒组幼虫病理组织切片中，病毒组幼虫组织内细胞形状和细胞核随着时间推移，逐渐变得不规则；病幼虫的表皮和真皮之间形成空洞，里面充满液体水状物(图11B,D)；当细胞发生病变严重时，发生解体，各种细胞器破碎现象(图11F)。21 ABCDEF图11健康幼虫和患病幼虫典型时期病理变化(标尺=100μm)注：A为健康组5日龄幼虫；B为病毒组5日龄幼虫；C为健康组7日龄幼虫；D为病毒组7日龄幼虫；E为健康组12日龄幼虫；F为病毒组12日龄幼虫.22 四、中华蜜蜂幼虫原代细胞培养（一）中华蜜蜂幼虫原代细胞生长特点WH2培养基培养中华蜜蜂幼虫原代细胞：细胞在培养初期悬浮于细胞培养板中，多数为圆形或椭圆形，但多数细胞贴于底板(图13A)。培养7d时发现细胞抱团生长，且周围有新生细胞出现(图13B)。培养14d时细胞培养板底部被80%细胞覆盖(图13C)。培养35d时很多细胞离开培养板底部，悬浮于培养基中，且细胞发暗不透明，无新生细胞出现，更换新鲜培养基，状况没有得到改善(图13D)。Grace培养基培养中华蜜蜂幼虫原代细胞：细胞在培养初期悬浮于细胞培养板中，在倒置显微镜中观察到细胞为圆形或椭圆形，但多数细胞贴于底板(图13E)。培养7d时发现细胞密集生长，在倒置显微镜中可以看到许多新生细胞(图13F)。培养14d后新生细胞长满瓶底，进行第一次传代(图13G)。细胞传代时用吸管在培养板底部吹打就可将其分散，以一分为二方式进行传代培养。在Grace培养基中，在这样环境条件下，35d时细胞保持大而圆(图13H)，并且活跃增殖了85d。AEBF23 CGDH图14不同时期细胞形态注：A为用WH2培养基培养原代细胞1；B为用WH2培养基培养原代细胞7d；C为用WH2培养基培养原代细胞14d；D为用WH2培养基培养原代细胞35d；E为用Grace培养基培养原代细胞1d；F为用Grace培养基培养原代细胞7d；G为用Grace培养基培养原代细胞14d；H为用Grace培养基培养原代细胞35d.（二）细胞活力检测用WH2和Grace培养基培养的中华蜜蜂幼虫原代细胞，在培养到7d和14d时细胞活力分别为94.52%和94.44%、94.13%和95.11%，表明两组在同一天细胞活力之间差异均不显著(P>0.05)；当细胞培养到21d、28d和35d时，细胞活力分别80.53%和90.03%、60.30%和89.87%、48.00%和85.60%，表明两组在同一天细胞活力之间差异均显著(P<0.05)。并且Grace培养基培养细胞存活时间更长，表明Grace培养基优于WH2培养基(图15)。24 图15两种不同培养基对细胞活力影响（三）Grace培养基血清浓度筛选不同胎牛血清浓度对细胞存活的影响：由图16可知，在培养7、14、21d时中华蜜蜂幼虫原代细胞活力，Grace培养基15%FBS组和20%FBS组与无血清组、5%FBS组、10%FBS组相比，均差异极显著(P<0.01)，而15%FBS组和20%FBS组组间差异不显著(P>0.05)；28d时的中华蜜蜂幼虫原代细胞活力Grace培养基15%FBS组和20%FBS组与无血清组、5%FBS组、10%FBS组相比，亦均差异极显著(P<0.01)，但15%FBS组和20%FBS组组间差异显著(P<0.05)。说明无血清不利于中华蜜蜂幼虫原代细胞的生长，必须添加血清培养细胞，且添加15%FBS较为适宜。图16不同浓度胎牛血清对细胞活力影响注:图中数据为平均数±标准差;柱上不同字母表示不同处理浓度间的差异显著性(P<0.05,LSD法)。25 五、中华蜜蜂囊状幼虫病毒在细胞中的复制CSBV感染中华蜜蜂幼虫原代细胞后分别于第12、24、36、48、60、72、84、96、108、120h收集病毒液，经荧光定量PCR检测，病毒浓度分别为1.138×104拷贝/μL、7.543×104拷贝/μL、3.859×105拷贝/μL、3.391×106拷贝/μL、3.647×106拷贝/μL、3.540×106拷贝/μL、8.876×105拷贝/μL、1.591×104拷贝/μL、1.339×104拷贝/μL、1.290×104拷贝/μL(图18)。在病毒感染细胞12h即可检测到荧光信号，表明其子代病毒粒子产生，随后逐渐增多，当感染60h时达到高峰，随后逐渐降低。图18不同时间点病毒拷贝数变化注：1.2：制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染12h时；3.4：制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染24h时；5.6制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染36h时；7.8制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染48h时；9.10：制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染60h时；11.12：制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染72h时；13.14：制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染84h时；15.16制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染96h时；17.18制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染108h时；19.20制备中蜂幼虫原代细胞接毒感染120h时.26 讨论中华蜜蜂在我国分布广泛，工作勤奋、敏捷、嗅觉更灵敏，善于寻找零星蜜粉源，但是对CSBD的抵抗力较差。CSBD是由CSBV引起的一种分布广、发病率高和传染快的病毒性传染病，目前已在我国内各地广泛的存在和流行，使得我国中蜂养殖量锐减，严重威胁着养蜂业的发展。对CSBV进行深入系统研究[17~20]，将有助于对CSBV采取有效的防控措施。病毒的理化学特性是病毒鉴定及其生物制剂研制的基础，病毒的理化学特性除用电子显微镜观察病毒粒子的大小和形态结构外，通常还将进行病毒有机溶剂敏感性、耐酸性和耐碱性试验等。本试验对从陕西榆林分离到的CSBV-SXYL毒株进行了理化因素抵抗力研究，研究结果显示，CSBV-SXYL为直径约30nm的球形病毒，对乙醚和氯仿有机溶剂具有极强抵抗力。对酸性条件具有很高的稳定性，在pH3.0的条件下仍能存活。CSBV-SXYL株病毒在低温下稳定，在高温下病毒的蛋白质变性，病毒易失活，因此在较高的温度条件不利于CSBV-SXYL的存活，实验室保存CSBV-SXYL纯化液时应在低温环境中。相关研究为CSBV生物制剂研制，新药证书申请奠定了基础。早在1924年，就有研究者对蜜蜂幼虫进行人工室内培养，通过人为调控温、湿度和BLD，在室内恒温恒湿培养内，Rhein[21]成功培育出工蜂幼虫。蜜蜂卵的选取直接关系着人工饲养蜜蜂幼虫的成功率，所以要选择群势较强，产卵较多的蜂群，且对于试验巢脾提前一周冷冻处理，去除巢脾中活的虫卵或虫体，以保证获得相同日龄的幼虫。从卵发育后三天，蜜蜂幼虫进入未封盖幼虫期，经历5次蜕皮，每隔24h蜕皮1次，当幼虫发育4d后，幼虫由发育前期进入到幼虫老熟时，幼虫体内中肠、马氏管与后肠的隔膜破裂，中肠中的食物残渣也随之进入后肠，从肛门排出。当幼虫5日龄蜕去第5次皮后，幼虫进入到蛹期发育，健康幼虫进入蛹期，最后发育成虫。但是感染CSBV的幼虫，隔膜破裂后，第5次幼虫蜕皮液中含有大量病毒粒子，幼虫无法蜕皮，停留在幼虫成熟期，无法化蛹。在病理组织切片HE染色的涂片中，我们发现此时的幼虫表皮和真皮之间空隙变大，里面充满液体，随着时间的推移，表皮下液体一直存在，细胞发生病变严重时，发生解体，各种细胞器破碎。27 实现CSBV体外培养，是对CSBV深入研究的前提和基础。本研究根据CSBV对宿主及其组织的偏嗜性，选用2-3日龄中华蜜蜂幼虫，培养中华蜜蜂幼虫原代细胞，通过对两种不同的昆虫细胞液体培养基，4种不同浓度FBS对比实验，筛选出适合中华蜜蜂幼虫原代细胞培养条件，并发现了CSBV能够在中华蜜蜂幼虫原代细胞中复制。在原代细胞培养中细胞培养基的选择至关重要，本次研究分别选择Grace培养基和WH2培养基。Grace培养基是模仿家蚕血淋巴的化学成分设计而成，它是一个基础培养基，用前需要添加不同量的胎牛血清、水解乳白蛋白和酵母自溶液等特殊成分成为完全培养基，以达到培养不同种昆虫细胞的目的[22]；而WH2培养基刚开始是为培养半翅目昆虫，如叶蝉和Homalodiscavitripennis细胞培养等，后来发现它同样适用于其他很多不同种昆虫，比如蜜蜂[10]。在本研究比较了Grace培养基和WH2培养基对中华蜜蜂幼虫原代细胞培养，研究发现用WH2培养液培养的细胞内有少量颗粒物，随着培养时间延长，细胞质融合，单层细胞开始聚拢，虽有少量细胞贴壁现象，但贴壁不牢，用吸管轻微吹打，很容易脱落，传代35d时细胞内又出现颗粒物，细胞透明度降低，细胞边缘发暗，细胞质内出现暗的颗粒样结构和空泡结构，这些颗粒首先出现在核周围，然后在数量上有所增加[22]。而在用Grace培养基培养35d时细胞大而圆，透明，边缘整齐，无颗粒物，在此培养条件下培养85d时细胞陆续死亡。采用细胞计数法对两种培养液培养细胞进行活力检验，结果发现WH2培养基和Grace培养基在7和14d时细胞活力组间差异不显著(P>0.05)，21、28和35d时Grace培养基上细胞活力明显的高于WH2培养基，且WH2培养基培养的原代细胞35d后相继死亡，而Grace培养基培养的原代细胞35d时细胞活力为85.60%，且存活85d后才逐渐死亡，说明Grace培养基明显优于WH2培养基。这可能与Grace培养基中含有谷氨酰胺、非必需氨基酸、水解乳白蛋白、酵母自溶液等营养成分有关，这些营养成分可能有利于昆虫细胞的生长。FBS作为一种特殊物质添加到基础培养基中，为细胞的生存、生长和增生提供了所必须的生长调节因子，补充了基础培养液中没有或量不足的营养成分；但由于FBS成分不明确，不同动物、不同批次的FBS成分和活性差别较大，存在28 影响细胞生长和繁殖的补体、免疫球蛋白和生长抑制因子等物质，往往会导致细胞培养不稳定。鉴于此，本研究在Grace基础培养基中添加4种不同浓度的灭活[14、15]的FBS，检测细胞在不同浓度FBS中细胞活力。结果表明，7、14、21和28d时，Grace培养基15%FBS组和20%FBS组与无血清组、5%FBS组、10%FBS组相比，差异均极显著(P<0.01)，且28d时15%FBS组和20%FBS组差异显著(P<0.05)。说明在Grace培养基中添加血清能极显著提高中华蜜蜂幼虫原代细胞活力，且添加15%FBS更为适宜。在15%FBS的Grace培养基中，中华蜜蜂幼细胞贴壁生长，大而圆，生长状态好，有明显的对数生长期，并可传代培养85d，也进一步验证了该培养基选择的合理性。同时本研究也对其他培养条件温度、湿度和是否需要CO2等条件进行了探讨，研究表明在Grace培养基中添加15%FBS，无需CO2，28°C恒温培养条件下，中华蜜蜂幼虫原代细胞就可以生长。在此基础，用纯化后的CSBV感染该原代细胞，经TapManMGB探针实时定量PCR检测后，结果表明当病毒感染细胞12h时即可检测到CSBV病毒，随着时间的增加，病毒含量逐渐增加，60h时增殖病毒含量达到峰值，随后病毒含量出现减少趋势，直到病毒感染细胞96h后，病毒含量不再出现明显幅度变化，但复制后的病毒是否具有感染性，毒力是否发生变化，感染后细胞本身发生哪些变化等问题，还有待进一步研究。结论1、成功分离到1株中华蜜蜂囊状幼虫病毒，并命名为CSBV-SXYL。2、CSBV-SXYL对乙醚和氯仿等有机溶剂具有极强抵抗力；对酸性条件具有很高的稳定性，在pH3.0的条件下仍能存活；温度达到75°C及以上时易失活。3、中华蜜蜂幼虫原代细胞在含15%FBS的Grace中能够良好生长，并且CSBV可以在该原代细胞中进行复制。29 ·本研究创新性的自我评价·本研究创新性表现为首次成功分离到CSBV-SXYL毒株；对CSBV-SXYL毒株进行生物学特性分析；并根据CSBV对宿主及其组织的偏嗜性，用2~3日中华蜜蜂幼虫制备蜜蜂源原代细胞；对中华蜜蜂幼虫原代细胞的培养条件及细胞生长状态进行筛选和研究。30 ·参考文献·1董秉义,方月珍,郭振泉,等.中蜂囊状幼虫病病毒的研究.中国养蜂,1986,(2):3-8.2YanX,HanRC.DiagnostictechnologiesofcommonpathogensofhoneybeesinChina.ChinBullEntomol,2008,45:483-488.3LiuX,ZhangY,YanX.PreventionofChinesesacbroodvirusinfectioninApisceranausingRNAinterference.Currentmicrobiology,2010,61(5):422-428(7).4MaMX,LiM,ChengJ,etal.MolecularandBiologicalCharacterizationofChinsesSacbroodVirusLNIsolate.Comparative&FunctionalGenomics,2011,(3):409386.5LiJL,QinHR,WuJ,etal.TheprevalenceofparasitesandpathogensinAsianhoneybeesApiseranainChina.PlosOne,2012,7(11):e47955.6李薇,薛菲,WubieAJ,等.蜜蜂囊状幼虫病研究进展.动物医学进展,2014,35(6):117-122.7GallaiN,SallesJM,SetteleJ,etal.Economicvaluationofthevulnerabilityofworldagricultureconfrontedwithpollinatordecline.EcologicalEconomics,2009,68(3):810-821.8FengM,FangY,HanB,etal.Novelaspectsofunderstandingmolecularworkingmechanismsofsalivaryglandsofworkerhoneybees(Apismellifera)investigatedbyproteomicsandphosphoproteomics.JouRNAlofproteomics,2013,78(7):1-15.9BerenyiO,BakonyiT,DerakhshifarI,KoglbergerH,NowotnyN,OccurrenceofsixhoneybeevirusesindiseasedAustrianapiaries.Appl.Environ.Microbiol,2006,72(4):2414-2420.10HunterWB.Mediumfordevelopmentofbeecellcultures(Apismellifera:Hymenoptera:Apidae).InVitroCell.Dev.Biol.Anim,2010,46:83-86.11颜伟玉,潘柯,李琳,等.培育雄蜂和工蜂所需能量值的研究,经济动物学报,2004,8(3):146-147.12MaMX,LiM,YuanCY,etal.DevelopmentofaRT-PCRmethodfordeterminationofChinesesacbroodvirus.ChineseJournalofBiologicals,2010,23(4):425-427.31 13马鸣潇,李明,袁春颖,等.中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立.中国生物制品学杂志,2010,23(4):425-427.14Marutani-HertM,HunterWB,HallDG.EstablishmentofAsiancitruspsyllid(Diaphorinacitri)primarycultures.InVitroCell.Dev.Biol.Anim,2009,5:317-320.15HunterWB,HsuHT.Formulationofaninsectmediumforthripsmonolayercellcultures(Thysanoptera:Thripidae:Frankliniellaoccidentalis).JournalofInvertebratePathology,1996,67(2):125–128.16BergemM,NorbergK,AamodtRM.Long-termmaintenanceofinvitroculturedhoneybee(Apismellifera)embryoniccells.BmcDevelopmentalBiology,2006,6(1):87-92.17MaMX,LiuJH,SongYJ,etal.TaqManMGBprobefluorescencereal-timequantitativePCRforrapiddetectionofChinesesacbroodvirus.PLosOne,2013,8(2):e52670-e52670.18XiaX,MaoQ,WangH,etal.ReplicationofChinesesacbroodvirusinprimarycellculturesofAsianhoneybee(Apiscerana).ArchivesofVirology,2014,159(12):3435-8.19ChoeSE,NguyenLT,JinHN,etal.AnalysisofthecompletegenomesequenceoftwoKoreansacbroodvirusesintheHoneybee,Apismellifera.Virology,2012,432(1):155-161.20HanB,Zhangl,FengM,etal.Anintegratedproteomicsrevealspathologicalmechanismofhoneybee(Apiscerena)sacbrooddisease.JournalofProteomeResearch,2013,12(4):1881-1897.21RheinWV.UberdieEntsteungdesweiblichenDimorphismusimBienenstaate.DevelopmentGenesandEvolution,1933,129(4):601-665.22薛庆善,肖渝平,林娟,等·体外培养的原理与技术·北京:科学出版社,2003·847-850.32 ·附录·一、文献综述中华蜜蜂囊状幼虫病的发展现状（一）中华蜜蜂囊状幼虫病的背景“蚕吐丝，蜂酿蜜”，谈起养蜂，人们常把它称为“甜蜜的试验”。蜜蜂依赖植物的花粉作为自己的主要食物，成为供给人类食用农作物的主要授粉工作者，蜜蜂与人类的生活相互依赖，密不可分[1~4]。目前中国境内大约有870万蜂群，其中中华蜜蜂Apisceranacerana超过300万[5,6]。中华蜜蜂在我国有着悠久的养蜂历史，它不仅为改善人类的生态环境做出了贡献，而且蜂产品和蜜蜂本身也深受中国消费者欢迎。如在中国医疗中，蜜蜂的鳌针被用来治疗人类风湿等疾病；工蜂吐的蜂蜜和蜂王浆等产品，被人类直接口服或者作为一种饮料添加剂，成为提高人体免疫力和缓解胃疼的最佳食品。如在中国人的饭桌上，蜜蜂幼虫期的幼虫被用作各种不同功能的大补美食食材等等用途。总之，中华蜜蜂以成为我们生活中的一部分。但不幸的是，自1972年南方地区大面积爆发了一种蜜蜂疾病，给中华蜜蜂业造成了极大的伤害，甚至严重威胁着养蜂业的发展，给养蜂业的经济造成了重大损失。中华蜜蜂勤劳，善于发现零星蜜源，能够在耐寒和耐热地区生活，但是产蜜量和分泌王浆的能力都要略低于欧洲其它蜜蜂，抗中华蜜蜂囊状幼虫病(Chinesesacbrooddisease,CSBD)的能力也较差。中华蜜蜂囊状幼虫病是由中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinesesacbroodvirus,CSBV)引起的蜜蜂幼虫至前蛹期阶段疾病的一种急性传染性病毒病。一旦发生感染事件，就会大面积流行。早在1913年就有关于囊状幼虫病(Sacbrooddisease,SBD)的报道[7~10]，并被美国首次鉴定[11]。随后在许多国家，包括英国[12]、澳大利亚[13]、奥地利、德国、尼泊尔、印度、南非[14]、法国[15]、美国[16]、乌拉圭[17]、丹麦[18]、西班牙[19]等地均有相关报道。中国[20]是在1972年南方地区，发生大面积爆发流行CSBD，感染中华蜜蜂的囊状幼虫病毒(Sacbroodvirus,SBV)被称为CSBV，由CSBV引起的33 疾病称为CSBD。中华蜜蜂幼虫在这次疾病中出现幼虫无法进入蛹期，停留在蜜蜂前蛹期状态；成蜂出现行为异常，寿命缩短等现象，最终导致整个蜂群毁灭。这次疾病的爆发流行迅速蔓延至全国乃至东南亚，至今仍在各地广泛流行中[21,22]。数年间，我国饲养中华蜜蜂的数量也在剧减，发病率也在逐年增高。CSBV在各地的流行株不同，甚至在同一个地方可能有多个毒株存在。已有研究表明，一旦中华蜜蜂灭亡，中国将有30%特有的珍稀植物濒临灭绝。辽宁地区自2008年首次报道中华蜜蜂囊状幼虫病发生以来，连年发生，使得辽宁地区中华蜜蜂濒临灭绝，影响了中华蜜蜂业的发展和保种工作。（二）中华蜜蜂囊状幼虫病的病原CSBV是小RNA病毒，直径26-30nm的二十面体，其基因组长8.8kb。与西方蜜蜂囊状幼虫病毒有紧密亲缘联系，但无交叉感染[23,24]。CSBV主要感染工蜂2~3日龄幼虫，预蛹期表现明显症状。蜂群一旦感染，保育蜂能辨别并打开每个患病幼虫封闭盖。幼虫感染最明显的表现是由于蜕皮液积聚在预蛹和蛹皮之间，所以不能化蛹而保持囊样外观。此外，感染的幼虫从颜色由珍珠白变成淡黄色、淡棕色，最后变成暗褐色。幼虫死后不久变皱，形成一个船形。另外，CSBV可以使成年蜜蜂减少寿命。CSBV的最初传染始于清理患病幼虫的工蜂，工蜂沾染病毒后，病毒在其下颚腺处积累，通过饲喂幼虫或与其它成蜂在进行食物交换时得以扩大传播。被感染的采集蜂在除外采集花粉时将下颚腺处积累的病毒渗入花粉中，使得其他幼虫通过食用被污染的食物而得到此病毒，随后病毒在幼虫体内增殖。患病幼虫在发病初期症状不明显，也无臭味。幼虫自排便后，体色逐渐变黄，随着时间推移，病虫头部变得透明，表皮坚韧，表皮下有水状渗出液体流动，由于蜕皮液被病毒侵染，使得患病幼虫最终因不能蜕皮进而出现死亡。发病后的巢脾会出现“插花子脾”的现象，因为巢脾中不仅有健康蛹还有病蛹和死蛹，工蜂将病蛹和死蛹不断地清理出巢房，将健康蛹仍然留在此巢脾上面。我国北方5~6月份，为中囊状幼虫病高发季节，尤其是2~3日龄中华蜜蜂幼虫最易感染。在春夏季节，采集蜂出去采蜜后哺育出大量的幼蜂，由于体质较弱，极易受到CSBV攻击而患病。感染囊状幼虫病的中华蜜蜂幼虫，在发病初期不表现出症状，几乎一直到封盖期前后，34 随宿主细胞发生病变，不能进行最后一次蜕皮，组织出现液化、残留下来形成一个小囊袋。对其进行提取纯化，发现组织和囊袋中含有大量病毒颗粒，用CSBV人工感染中华蜜蜂幼虫，对其病毒液进行电镜观察，发现这些液体中含有呈晶格排列的球状病毒，其大小为30nm左右。在人工感染幼虫病理组织切片中发现，CSBV能引起幼虫内部器官和组织的病理变化。病幼虫的表皮下充满水状液体。感染后期幼虫细胞病变严重，细胞核皱缩，甚至发生解体，各种细胞器严重破碎。在理化特性分析实验中，用乙醚和氯仿分别与病毒感作一段时间后，健康幼虫能够进入蛹期，而病毒组幼虫停留在前蛹期，表明乙醚或氯仿对病毒的致病性没有影响，CSBV对乙醚和氯仿有抵抗力。在耐酸性试验中，人为改变病毒的生存环境，使它处在pH3.0的一个胃酸pH的同等环境中感作1h，然后又用碱溶液将其调回正常pH值7.2的一个环境中，饲喂健康幼虫，发现健康幼虫可以进入蛹期，而病毒组幼虫无法进入到下一个时期，而停留在蜜蜂前蛹期这个时期，说明病毒在这个环境中存活不受影响。以上这些理化特性和临床本体动物感染试验，都将为我们今后的疾病防控和疫苗研发等试验奠定基础。（三）CSBV国内流行动态蜜蜂是生态系统中最重要的传粉昆虫之一。供给人类食用的主要农作物70%依赖蜜蜂授粉，授粉率的下降将会对粮食安全带来严重的后果。目前中国境内大约有800多万蜂群，中华蜜蜂占到了1/3左右。中华蜜蜂在我国有悠久的养蜂历史，并且有优秀的生物学特性，对抗蜂螨以及极端气候和不利环境。因此，中华蜜蜂在植物授粉以及植被覆盖度和生物多样性的维护方面起着至关重要的作用。此外，在亚洲市场，中华蜜蜂生产的蜂蜜也很受欢迎。但是在1972年，我国南部地区多处蜂群中出现CSBD，并迅速蔓延至全国大部分地区[22]。其中辽宁地区在2006年，有养蜂户从南方某省引入了中华蜜蜂，并将中华蜜蜂销售给了多个养蜂户，在2007年若干了蜂场开始发生CSBD，到2008年清原全县多个乡镇爆发了CSBD。2009年辽宁省多个地区出现大面积流行，多处爆发CSBD。2010年此病危害有所减少，但是在辽宁省内多处地区还是时有发生[20,25]。中国境内其它地区也依然不定期的发生和流行。35 （四）中华蜜蜂囊状幼虫病的诊断技术中华蜜蜂幼虫感染CSBV后，有一定潜伏期，尤其是工蜂带毒不表现出临诊特征，为此仅仅根据临床症状和流行病学特点，很难对CSBV作出及时检测，直接影响了CSBV防治。传统CSBV检测方法有症状诊断、电镜观察和血清学检测等，伴随着分子生物学的发展，基于RT-PCR技术是近几年发展起来的一种现代分子生物学基因诊断技术，具有特异、敏感、简便快捷等特点，也被应用于CSBV检测和研究[26]。1、传统CSBV检测方法(1)电子显微镜负染观察：在电子显微镜日益普及的今天，取感染培养物做成电镜标本后染色检查，是一个比较快速可靠的方法。在电子显微镜中可以观察到有无病毒粒子存在以及存在的病毒粒子形态、大小。在病毒培养和病毒鉴定工作中会经常应用电镜手段，特别是对某些特征性形态结构和排列方式的病毒，都取得了良好的效果。负染色技术这种方法在病毒学研究中广泛应用，分辨率高，所谓负染色，实际上不是染色，而是“包埋”。它是使负染色染液(重金属盐类)在研究材料周围形成一层无定形的膜，把病毒颗粒埋藏在这层膜所产生的浓密的背景里面。凡是密度比生物标本大四倍以上的重金属盐溶液，均可作为负染色液，而负染色法中的染液的pH对染色效果有较大的影响，一般宜偏酸(pH6~7)，碱性染液往往造成生物标本的凝聚变形。然而由于电镜检测操作繁琐，成本较高、结果重复性不好等问题，限制了其在CSBV上的应用。(2)免疫琼脂双扩散试验免疫琼脂双扩散试验是指在同一块凝胶平皿内，用已知标准阳性血清(标准抗原)对待测溶液中的抗原(抗体)成分进行检测的一种方法。利用的是免疫学中相对应的抗体能与相对应的抗原发生特异性结合反应，生成一条清晰可见的白色沉淀线。未含有这种特异性抗原的溶液，及时在凝胶中也发生了扩散现象，但是不会与特异性抗体发生结合反应，即不会形成清晰可见的沉淀线。这是一种广泛用于检测病毒抗原成分或抗体水平滴度的免疫学技术。此方法不需要特殊设备和技术条件，具有简单操作的可行性。本实验室所建立的CSBV免疫琼脂双扩散方法，可以实现对CSBV定性诊断或抗CSBV抗体的检测。36 (3)酶联免疫吸附法(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)ELISA试验是指在抗原抗体在酶的高效催化作用下发生的一种抗原抗体结合反应。利用的是先将具有免疫活性的抗原抗体结合到某种固相载体表面，再与酶标抗体或抗原产生抗原抗体结合物，加入终止溶液终止结合反应，洗去未结合物质，加入酶反应底物溶液显色、在指定波长中检测OD值。但是它本身对结构类似的化合物容易发生交叉反应。本课题组在进行抗CSBV卵黄抗体研发过程中，由于卵黄抗体的定性和效价检测方法还未建立，无法对卵黄抗体进行定性和效价评价。因此，将纯化后病毒作为包被抗原、卵黄抗体作为一抗和过氧化物酶标记兔抗鸡IgG作为二抗，建立起来间接ELISA检测法，主要为抗CSBV卵黄抗体定性、效价水平检测和质量控制提供参考依据。2、分子生物检测技术(1)逆转录聚合酶链反应(Reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)PCR是基于细胞内的DNA复制过程而设计的DNA体外扩增技术。此方法敏感、能快速检测，操作简单，可用于PCR强毒感染疾病的快速检测方法，再结合临床症状，对患病幼虫进行诊断。马鸣潇等[27,28]建立了用于RT-PCR检测方法，具有高度的特异性和敏感性，能够用于CSBV快速诊断。对检测方法的特异性、敏感性进行进一步验证，为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的构建等奠定了基础。此外，许益鹏[29]等建立的CSBV套式PCR法也在应用于的实验室研究和临床检测中。（2）环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)常规PCR检测技术虽然已广泛的应用疫病的临床检测，但由于PCR扩增需要配套的控温精密的仪器和复杂的实验程序，大大提高了检测成本。LAMP由于快无需控温精密的实验仪器和复杂的实验程序，且具有LAMP技术由于具有快速、高效、灵敏度高、特异性高和可定量分析等优点已经广泛用于临床和微生物分子诊断领域。2011年，MingxiaoMa[30]报道，以CSBV结构蛋白基因为靶基因，根据体外等温扩增(LAMP)引物设计的原则设计了4条针对CSBV的特异性引物，建立了CSBVLAMP检测方法，与RT-PCR检测方法进行了比较，其敏感性和特异37 性均没有明显差异，但该方法操作时间短不需要特殊设备，可在基层推广应用。(3)荧光定量RT-PCR检测荧光定量RT-PCR检测检测方法可以实现对病毒定量研究和检测，马鸣潇[31]和宋战昀等[32]分别建立了CSBVTaqMan探针和MGB探针荧光PCR检测法，均具有更高的敏感性和特异性，在对CSBV早期感染、环境监测、流行病学调查、临床检测、致病机理以及感染摸型制备等研究提供了特异可靠的评价手段和检测方法，但成本比较高。38 参考文献1CharlesR,FlemnikenML,EngelJC,etal.Temporalanalysisofthehoneybeemicrobiomerevealsfournovelvirusesandseasonalprevalenceofknownviruses,Nosema,andCrithidia.PLosOne,2011,6:e20656.2ZhangY,HuangX,XuZF,atal.DifferentialGeneTranscriptioninHoneybee(Apiscerana)LarvaeChallengedbyChinnesesacbroodvirus(CSBV).Sociobiology,2013,60(4).3CharlesR,FlennikenML,EngelJC,atal.Temporalanalysisofthehoneybeemicrobiomerevealsfournovelvirusesandseasonalprevalenceofknownviruses,Nosema,andCrithidia.PLosOne,2011,6(6):e20656.4AIHX,YanX,HanR.OccurrenceandprevalenceofsevenbeevirusesinApismelliferaandApisceranaapiariesinChina.JournalofInvertebratePathology,2012,109(1):160-164.5LiuX,ZhangY,YanX.PreventionofChinesesacbroodvirusinfectioninApisceranausingRNAinterference.Currentmicrobiology,2010,61(5):422-428(7).6HanB,ZhangL,FengM,etal.Anintegratedproteomicsrevealspathologicalmechanismofhoneybee(Apiscerena)sacbrooddisease.JournalofProteomeResearch,2013,12(4):1881-1897.7BradbearN.Worlddistributionofmajorhoneybeediseasesandpests.BeeWorld,2015,69(1):15-39.8BlanchardP,GuillotS,AntunezK,atal.Developmentandvalidationofareal-timetwo-stepRT-qPCRTaqMan®assayforquantitationofSacbroodvirusanditsapplicationtoafieldsurveyofsymptomatichoneybeecolonies.JournalofVirologicalMethods,2014,197:7-13.9RobertsJM,AndersonDL.Anovelstrainofsacbroodvirusofinteresttoworldapiculture.JInvertebrPathol,2014,118:71-74.10CharlesR,FlemnikenML,EngelJC,etal.Temporalanalysisofthehoneybeemicrobiomerevealsfournovelvirusesandseasonalprevalenceofknownviruses,39 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22LiJL,QinHR,WuJ,etal.TheprevalenceofparasitesandpathogensinAsianhoneybeesApiseranainChina.PlosOne,2012,7(11):e47955.23FeiDL,ZhangHC,DiaoQY,etal.CodonOptimization,ExpressioninEscherichiacoli,andImmunogenicityofRecombinantChinsesSacbroodVirus(CSBV)StructuralProteinsSacbroodVirus(CSBV)StructuralProteinsVP1,VP2,andVP3.PLosOne,2015,10(6):e0128486.24ZhangY,ZhangGZ,HuangX,etal.ProteomicAnalysisofApisceranaandmelliferaLarvarFedwithHeterospecificRoyalJellyandbyCSBVChallenge.PLosOne,2014,8:e102663.25张大利.辽宁中蜂囊状幼虫病发生情况的调查分析.中国蜂业,2012,2(63):19.26任勤,戴荣国,郭军,等.蜜蜂传染性疾病的实验室诊断技术.四川畜牧兽医,2011,(8)：30-32.27MaMX,LiM,YuanCY,etal.DevelopmentofaRT-PCRmethodfordeterminationofChinesesacbroodvirus.ChineseJournalofBiologicals,2010,23(4):425-427.28马鸣潇,李明,袁春颖,等.中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立.中国生物制品学杂志,2010,23(4):425-427.29许益鹏,章奕卿.蜜蜂囊状幼虫病毒病的Nest-PCR检测.科技通报,2007,23(6)：824-827.30MaMX,MaC,LiM,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationforrapiddetectionofChinesesacbroodvirus.Journalofvirologicalmethods,2011,176(1-2):115-119.31MaMX,LiuJH,SongYJ,etal.TaqManMGBprobefluorescencereal-timequantitativePCRforrapiddetectionofChinesesacbroodvirus.PLosOne,2013,8(2):e52670-e52670.32宋战昀,王振国,冯新,等.基于TaqMan探针的蜜蜂囊状幼虫病病毒荧光PCR检测方法的建立和应用.昆虫学报,2010,53(8):920-925.41 二、在学期间科研成绩李慧，费东亮，胡影.中华蜜蜂幼虫原代细胞培养及中华蜜蜂囊状幼虫病毒在培养的细胞中的复制[J].昆虫学报2015年第58卷第12期：1362-1367.42 三、致谢本论文在导师马鸣潇教授的悉心指导和大力支持下完成的。感谢导师在毕业论文撰写过程中的细致指导，从论文选题、研究设计到最后论文撰写中，导师倾注了大量的心血。感谢老师在三年的研究生生活中，对我学习和科研方面的帮助，感激老师对我生活上的关心，正是有了老师的这种帮助和关心，让我在这三年中，学习上有了很大进步，使我能够顺利毕业。同时，我也要感谢费东亮和姜莉莉老师的大力技术指导，是你们的帮助，让我的实验能够更加顺利完成。真心感谢实验过程中帮助过我的各位老师，以及在实验室共同奋战三年的钟义、胡影、魏东等兄弟姐妹，和你们在一起做实验的这三年，给我的生活中留下了一段精彩的记忆。对一直关心和帮助我的家人和朋友们，真心说一声谢谢你们！43 四、个人简介姓名：李慧性别：女出生年月：1984年5月民族：汉族教育背景：2003.9-2006.7河南郑州牧业高等专科职业学校动植物检疫专业2013.9-2016.7锦州医科大学微生物学专业44 ＼＇（厚德了Ｉ爹身精术；齐世＇Ａ革＇邏＾ｎ：ｈ－？．二ｓｒ—．＿．：■：．，哥？它？於．．．、＾＇－■．．Ｉ＂＇＇占？ｒ￣ｙ？＇占．，‘．？．．Ｖ１九Ｉ■．＇；－＊Ｉ■产■．巧－．．？巧Ｖ—普■－．…—二，．．．＇＾－．＇？．—＇－一－．．Ｖ：ｖ，＇ｆｅ．．．．心■，■－．＼．．．．．．？一－ｋ＊■■Ｉ‘’．：－町：；＇ｒ盛軒。■＇＇．－．Ｖ…二：ｉ叫Ｉ：斗；、？．．－Ｉ二‘’．？？－｛７＇＇■：＇（）＂＇＇辟－ｖｆ－：刮－．．．．．＼占＊—？－厚３．—ｉｓ１．．．．？．－迁４＞．＇？ｊ．奇！．＇ｊ－．．：／．．－ｊ．．，，，＇．．ｊ＾二．主？？，斯＾’一－■‘－．．．－１一－ｉ、’．．＿ｉ’ｊ１．？？Ｉ，？Ｉ：—．，，：；．＇■．■：：Ｖ．
