中国柑橘黄龙病发生动态及其病原菌亚洲种群分化研究

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单位代码学号硕士学位论文中国柑橘黄龙病发生动态及其病原菌亚洲种群分化研究论文作者：柏自琴指导教师：周常勇研究员刘金香副研究员学科专业：植物病理学研究方向：分子植物病理学提交论文日期：年月日论文答辩日期：年月日学位授予单位：西南大学中国重庆年月 单位代码学号硕士学位论文中国柑橘黄龙病发生动态及其病原菌亚洲种群分化研究论文作者：柏自琴指导教师：周常勇研究员刘金香副研究员学科专业：植物病理学研究方向：分子植物病理学提交论文日期：年月日论文答辩日期：年月日学位授予单位：西南大学中国重庆年月 OccurrencedynamicsofCitrusHuanglongbinginP.R.Chinaandpopulationdifferentiationof'CandidatusLiberibacterasiaticus9AMasterDissertationSubmittedtotheCommitteeofSouthwestUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofPhilosophyinPlantPathologyByMasterCandidate:BaiZiqinSupervisor:Prof.ZhouChang-yongAssociateProf.LiuJinxiangMajor:PlantPathologyField:MolecularPlantPathologyChongqing,P.R.ChinaMay,2012 独创性声明学位论文题目：中国柑橘黄龙病发生动态及其病原菌亚洲种群分化研本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者签字曰期：年月曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至’年月止）。签字曰期：年月；曰签字曰期‘月广曰 目录目录缩略词与中英文对照表第一章文献综述柑橘黄龙病起源与分布黄龙病的起源黄龙病的分布胃柑橘黄龙病的危害典型症状危害严重性病原研究病原认识历程病原分离培养病原种内分化研究诊断与检测田间诊断指示植物鉴定实验室鉴定流行学研究传播途径发病特点柑橘黄龙病防控技术严格种苗调运，建立无病苗圃种植无病壮苗防治柑橘木虱挖除病树，消除病源，更新柑橘园加强栽培管理第二章引言 西南大学硕士学位论文第三章中国柑橘黄龙病发生动态及蔓延原因分析中国柑橘黄龙病各病区不同时期病情发生动态广东柑橘黄龙病发生动态福建柑橘黄龙病发生动态广西柑橘黄龙病发生动态台湾批橘黄龙病历史发生情况云南柑橘黄龙病发生动态四川柑橘黄龙病发生动态江西柑橘黄龙病发生动态浙江根橘黄龙病发生动态湖南粗橘黄龙病发生动态贵州柑橘黄龙病发生动态海南相橘黄龙病历史发生情况中国柑橘黄龙病不同时期发生动态柑橘黄龙病扩散原因讨论第四章基于两个噬菌体相关位点的黄龙病菌种群分化研究材料与方法供试材料主要试剂（盒）与仪器常用储备液及培养基配制总核酸提取弓反应产物纯化、克隆与测序序列分析结果与分析樹橘黄龙病疑似样品中韧皮部杆菌检测基于两个噬菌体相关蛋白位点的中国种群分析扩增位点序列分析扩增位点序列分析讨论第五章一个假定噬菌体转移酶基因的变异及流行学意义研究材料与方法 目录供试材料主要试剂（盒）与仪器常用储备液及培养基配置总核酸提取弓病原菌特征位点反应体系产物纯化、克隆与测序序列分析结果与分析中国株系扩增产物多态性扩增子序列分析第六章主要结论、创新点及研究展望主要结论明确了中国柑橘黄龙病各发病区病害发展动态及扩散原因利用两个嗟菌体相关位点评估了中国’种群分研究了一个假定噬菌体转移酶基因的变异并分析了其流行学意义创新点研究展望詩雄蘭在读期间发表论文及参加科研项目情况 摘要中国柑橘黄龙病发生动态及其病原菌亚洲种群分化研究植物病理学专业硕士研究生柏自琴指导教师周常勇研究员刘金香副研究员摘要相■橘黄龙病（，是一种严重威胁柑橘产业的毁灭性病害，目前已在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近个国家和地区发生，中国个柑橘主产省（市、自治区）中已有个遭受黄龙病为害，柑橘黄龙病已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一。近年来，随着全球气候变暖，黄龙病的媒介昆虫分布区域逐步扩大，同时种质资源的频繁调运，致使黄龙病危害日趋严重。柑橘黄龙病症状最早在世纪在印度中部地区有记录，其传播媒介柑橘木虱最早于年在印度尼西亚旁遮普地区被发现。我国最早于年在广东潮汕地区发现该病，并于上世纪年代确定柑橘木虱是其传播媒介。柑橘黄龙病病原属暂定的朝皮部杆菌属根据病原在及卢操纵子基因序列上的差异，将其分为个种：亚洲种（‘’）、非洲种和美洲种‘‘。其中，亚洲种和美洲种由亚洲柑橘木風传播，非洲种由非洲柑橘木風传播。柑橘黄龙病菌尚未获得纯培养。因此，对其生物学、生理生化特性知之甚少。对病害的治理也尚无特效药剂及抗（耐）病品种，因此田间主要通过使用无病苗木、及时挖除病树及防治柑橘木虱等方法对病害进行防控。对柑橘黄龙病发生、发展动态的研究，将有助于了解病害的起源、流行趋势以及病原菌种群特性等。因此，梳理中国柑橘黄龙病各病区病害的发生发展历史是十分必要的。在国内尚未对中国柑橘黄龙病发展史进行较为详尽统计的背景下，本学位论文在国家公益性行业（农业）科研专项（的资助下，通过广泛、系统地收集中国柑橘黄龙病从发生至今的病情报道、科研动态等历史文献，初步明确了柑橘黄龙病在中国个省（自治区）的发生发展动态及引起各地病害发生的可能原因；同时，通过在柑橘黄龙病菌亚洲种全基因组上报道的个紀标位点对中国不同来源的种群进行了多态性评 西南大学硕士学位论文估，在分子水平上进一步探索了病害的起源及流行。本研究旨在明确中国各地黄龙病的发生动态，并结合对各地病原菌亚洲种群特性的分析进一步探讨病害的起源及流行过程，以期为病害的科学认识及防控提供有力的证据。本研究主要取得了如下研究成果：、以中国柑橘黄龙病从发生至今的病情报道、科研动态等历史文献资料为研究材料，经整理分析，初步明确了中国柑橘黄龙病各发病省（自治区）病害发生发展动态及引起病害蔓延的原因，据此将各病区的进入途径大致分为两种类型：一类是由于苗木调运引起发生的病区，一类是本身就可能为的起源中心，并对这一分类的依据进行了阐释，提出了中国可能存在柑橘黄龙病多个起源中心的论点、选用两个已报道的具有种群多态性的噬菌体相关位点（、—对来自中国八个黄龙病区的份‘’阳性样品进行了种群分化评估。通过分析这两个位点的常规扩增结果表明，中国种群内高海拔地区（特别是云南、四川）与低海拔地区‘’扩增频率明显不同，通过这两个位点序列比对及构建进化树发现，高、低海拔地区种群分别与最近报道的两种噬菌体和存在相关性。此外还发现，各病区种群内部（特别在云南、四川）亦存在扩增结果多态性，高海拔地区‘’株系存在高度的多样性与特殊性。、运用已报道的一个原噬菌体区域高度嵌合位点推断的噬菌体转移酶基因）对来自中国个黄龙病病区的份‘’阳性样品进行了病原菌多态性研究。结果显示，样品共产生种大小不同的扩增子，序列分析表明所有扩增子享有同一序列骨架，其差异是由在非编码区内序列的插入和缺失所致。序列比对及扩增电泳类型分布分析表明，云南、四川等高海拔地区种群与其他低海拔地区种群相比，株系更为复杂，且原噬菌体活性更为丰富。综上所述，本研究结合历史文献追踪及分子生物学技术，表明中国‘’存在高度的多样性，中国柑橘黄龙病可能存在多个起源中心，或在扩散蔓延的过程中不同地区及不同生境的种群出现了分化。关键词：柑橘黄龙病柑橘木虱韧皮部杆菌发生动态种群分化 AbstractOccurrencedynamicsofCitrusHuanglonpbinginP.R.Chinaandpopulationdifferentiationof'CandidatusLiberibacterasiaticus9Major:PlantPathologyMasterCandidate:BaiZiqinSupervisor:Prof.ZhouChangyongAssociateProf.LiuJinxiangAbstractCitrusHuanglongbing(HLB)isahighlydestructivediseaseforcitrusindustiy,andhasbeenreportedinnearly50countriesorregionslocatedinAsia,Africa,Oceania,NorthAmericaandSouthAmerica.InChina,11provinceshavesuffereddamagefromHLBamongthe19citrusproducingm-eas.HLBhasbecomeoneofthekeyfactorstorestrictthesustainabledevelopmentofcitrusindustry.Inthepastdecade,thedistributionareaofHLBinsectvectorisgraduallyenlargedwithclimatechangeoftheglobalwarming.Meanwhile,alongwiththetrmisportationofnurserytreesorbudwoodwithoutrestrictiveguarantineprocedure，—，，’，‘，‘，， 内南人兮硕十学位论文‘’—‘‘’‘，，， AbstractInsummary,thisresearchwascombinedwiththeorderofhistoricaldocumentsandtechnologyofmolecularbiology,showedahighlydiversityofChinese‘，， 缩略词与中英文对照表縮略词与中英文对照表缩写词英文名中文名氣辛青霄素碱基对丨溴化十六焼基三甲基胺双蒸水脱氧核糖核酸四种脱氧核苷三憐酸溴化乙锭乙二胺四乙酸电泳类型克黄龙病国际柑橘病毒学家组织异丙基硫代半乳糖苷液体培养基千克单克隆抗体分钟毫升摩尔摩尔升核苷酸幵放阅读框聚合酶链式反应实时定量核糖体脱氧核糖核酸核糖体核糖核酸核糖核酸转每分钟十二焼基硫酸钠单核苷酸多态性简单序列重复硼酸电泳缓冲液缓冲液透射电镜串联重复数单位溴》氯丨噪夕半乳糖苦微克微升 第一章文献综述第一章文献综述世界柑橘主要分布在北讳°以南的区域，性喜温暖湿润，有大水体增温的地域可向北推进到北讳、世界上有个国家生产柑橘，产量及面积均居百果之首。中国樹橘栽培历史可追溯到多年前，年全国柑橘栽培面积及产量均跃居世界第一位，年栽培面积余万亩，产量万吨。中国适宜柑橘栽培的地域广阔，长江以南的湖北、湖南、福建、广东、广西、四川、江西等个省市、自治区均有批橘栽培，形成了籍南湘南桂北、长江上中游、浙闽粤、鄂西湘西等个柑橘优势区。中国品种资源丰富，批、橘、甜橙、柚、梓檬、金相、佛手等主要柑橘栽培类型在中国都有规模化生产基地。然而，柑橘黄龙病（，是一种严重威胁世界柑橘产业的毁灭性病害，目前己在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近个国家和地区发生，中国大陆个柑橘产区中已有个遭受黄龙病为害，并呈不断扩展趋势，该病已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素。本章主要就黄龙病的起源与分布、寄主、危害、病原研究、流行学研究及防控技术等方面进行综述。相橘黄龙病起源与分布黄龙病的起源年，报道柑橘黄龙病症状可能在世纪印度中部地区就有发现，当时被称为梢枯病（。年，【在调查中国南方经济作物病害时发现此病，这是黄龙病在中国发生的最早记录，但据调查，发生渊源可追溯到更远年代】》年，和描述在印度旁遮普地区由于木虱取食致使树势衰弱的现象，而且病果味苦且酸，此为探讨相橘木虱可能与黄龙病有关的首次报道。年，林孔湘先生报道在广东潮汕地区有黄龙病发生，认为此病害由一种具侵染性的病原引起，在春季和秋季被侵染的病树枝梢褪绿变黄，遂称其为黄梢病，因广东地方方言中“黄梢病”读起来像“黄龙病”，故称黄龙病。黄龙病的分布世界分布柑橘黄龙病在南非被称作青果病（、菲律宾被称作叶斑驳病印度称为梢枯病（、印度尼西亚则称作叶脉初皮部退化病在年第届国际柑棺病毒学家组织会议期间，正式将该病学名定称为相橘黄龙病（目前，该病已在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近个国家和地区发生】（图。柑橘黄龙病菌亚洲种主要分布于中国、印度、巴基斯坦、不丹、尼泊尔、斯里兰卡、孟加拉国、緬甸、马来西亚、泰国、老捉、柬埔寨、越南、伊朗、日本南部（琉璃群岛和冲绳 w南人硕士位论文群岛）、印度尼两亚、菲律宾、东帝忟、巴布亚新儿内亚、美国、多米尼加共和国、古巴、伯利兹、墨两哥、牙买加、尼加拉瓜拼械黄龙病菌洲种主耍分布丁南非斯威十兰、律巴布节、马拉维、布隆地、尼亚、坦桑尼亚、索马里、暗走隆、埃塞俄比亚、尼日利亚、马达加斯加、中非共和国。在沙特阿拉伯的也门及法属的菌尼汪岛和毛里求斯等地同时存在拼橘黄龙病菌亚洲种及非洲种。巴两同时存在拼橘黄龙病菌亚洲种和美洲种。而美洲种仅限丁圣保罗州与米纳斯吉拉斯州，且近年来发生率愈来愈低，亚洲种位染能力更强。树《龙爲普界今崎‘衡慮图相橘黄龙病世界分布图国内分布我国是拼橘黄龙病的老病区，距文字记载广东第一例黄龙病发生己近白年历史。台湾在上世纪年代就有关于黄龙病的记载，当时被叫做立枯病】。福建、广两两竹区在抗战以前就存拼橘树势严重衰弱而人足砍伐的记录。上世纪年代末，四川攀两地、江两赣南地及云南南部也先后报道有该病危害，到上世纪年代中期，该病已在我国广东、福建、广两、台湾和海南的树橘产区广泛蔓延，并在浙江、湖南、贵州相继发生。至此，我国有枬橘栽培的个将区中已有个遭受黄龙病为害近年来，随着全球气候持续变暖，传病媒介虫一拼搞木虱越冬边界北移，同时种苗接穗不按检疫规程频繁调运，桥橘黄龙病 第一章文献述在我国不断扩散趋势。、‘、、■▲▲▲鄉▲▲▲代以前的黃尤為足行里代代以洽灰現的龄尤為图橘黄龙病中国分布图寄主范围柑橘黄龙病菌主耍为害芸香科植物中的柑橘属、、积属和金彬属包括宽皮橘类、橙类、宜吕橙类、柚类、拘機类、金彬类和积类等的品种和栽培种。等依据土栽拼橘品种对黄龙病的抗感反应将其分为高度感病别（如甜撥、桔柚），中度感病耶（如柚子、梓檬、酸橘）和耐病？？彳（如莱檬、积壳），尚未发现抗病品种。芸香科的酒饼筋、九里香】禾黄皮、】也是黄龙病菌的寄主。经摧病冤丝子还可将病菌传至长奍花丨？彳、烟草和播前二；上。此外，范国成等报道了黄龙病病原能感染■科植物壳叶猴耳环气 西南大学硕士学位论文表黄龙病主要寄主植物寄主拉丁学名）品种寄主拉丁学名）品种西非木梧沙柑■酒饼簕奥太橘香蕉橘葡萄袖开普板栗宽皮橘长春花甜澄枳检酸橘求罗克利樣温州蜜相莱橡细叶黄皮酸检黄皮扁平橘草地银丝子杣五用鬼丝了‘八朔柑金柑■属马蜂柑象果宜吕禮原果指枯印度野枯麻纹叶梓檬九毕香香橙办‘’烟草卡蒲橘枳甜梓檬乌相了朽檬菲律实木枯黎椽美拉尼亚火翼授香古果柑橘黄龙病的危害典型症状拼橘受黄龙病感染后在不同生育期可以表现不同的症状：叶片症状从典型斑驳到叶脉黄化，叶片变厚变小，以及呈现类似缺锌缺猛的缺素症；果实症状包括小果、红鼻果，种子变褐败育；整株矮化，生长缓慢，上部枝梢出现黄梢；下部根系须根少，新根生长受到抑制，支根腐烂。 第一章文献综述症状，各地病树也普遍见到斑驳症状，成为最常用的田间诊断依据。近年来各地黄龙病树上表现红鼻果症状明显，一些研究认为红鼻果症状亦可作为田间诊断的主要依据【。危害严重性组织病理学研究发现受黄龙病侵染的植株出现初皮部坏死、韧皮部过度形成、不正常的形成层活性以及淀粉累积等现象。还观察到从叶鞘原生质膜处形成细胞质膜、叶绿体类囊体的畸变以及线粒体的崩溃现象。这些变化说明植株中发生了可能是由毒素或激素引起的显著代谢紊乱。果园发生黄龙病后轻者影响产量和品质，重者造成柑橘树枯死，对于严重发病的产区只有将病树挖除烧毁。病区内新种植的幼龄树易感病，且一旦发病就很快衰老死亡，而成龄树感病较轻，发病后还可维持年时间，所以新果园比老果园更快受到摧毁，故有“先种后死，后种先死”的说法。由于各种柑橘类植物都能被柑橘黄龙病危害，所以黄龙病对相■橘种植资源的保护构成巨大威胁。据不完全统计，截止年，我国广东、广西和福建等地，累计有余万株病树因感染黄龙病被砍除】，广西从年间累计砍除黄龙病树约万株广西柳州市为黄龙病老病区，该市各国营园艺场上世纪年代扩种的蕉柑、棰柑及甜橙近万亩到年几乎全部受害，后来改建以温州蜜柑为主的柑园，上世纪年代后期病害再次严重，全市柑■橘产量由年的多万斤降至年的多万斤【。印度尼西亚年到年期间不少于万株樹橘被毁灭。巴西自年首次发现黄龙病到年为止，在圣保罗州共有万株黄龙病树被砍除。年在墨西哥尤卡坦州召开的“第届柑橘黄龙病和亚洲甜橘木風国际研讨会”上，与会专家提出墨西哥如对黄龙病防治不力，今后年将损失的果园，外贸收入减少亿美元丨】。病原研究病原认识历程批橘黄龙病最早的记载是在年对中国南方经济作物调査时对柑橘黄化及花叶症状的描述。涂治、何畏冷【、林孔湘等都相继报道了黄龙病的发生。涂治根据一般性的观察认为黄龙病是由水害引起；何畏冷】从病树根部分离到一种镰刀菌未经试验便认为镰刀菌是黄龙病的病原；润菲尔格在广东潮汕地区及广州市郊进行了两周一般性的观察，认为黄龙病是由于水位过高导致根部不能吸收矿质元素而使植株生长受到影响，并认为只要相橘上山就可以解决黄龙病问题，这一观点得到了当时一部分人的认同；陈其傣从年至年在潮汕区做了调查并进行病原接种试验，证实病害具有嫁接传染的特性，因此认为黄龙病病原可能为一种病毒；林孔湘从年到年对本病进行了水害、线虫、镰刀菌、病毒接种和带病苗木传染、自然蔓延等系统试验，证 西南人学硕士学位论文明该病能嫁接传染，并认为该病病原是病毒，同时对照和缓冲区的健康树随接种后也陆续发病，表明黄龙病在田间还可能存在某些自然传播介体。上世纪年代中期，一些学者常从黄龙病树上检测到柑■橘衰退病毒并通过指示植物测定的症状和濟伏期观察，都与美国加尼福利亚州袞退病中的苗黄病症状、台湾立枯病、印度梢枯病相同，即认为黄龙病属袞退病的强毐株系，頓虫为其传播介体，，。而林孔湘做了病状和寄主感病性差异比较试验赵学源等做了病皮接种指示植物，并用这些指示植物鉴定选择的无病树做母树，繁殖苗木定植后以防讶为主，结果黄龙病并未明显减轻，因而均否定了黄龙病病原是衰退病毒的推论。年，日本科学工作者卩和发现，过去认为黄化丛枝型病毒病害的病原不是病毒而是类菌原体（等】用电镜也观察到青果病病株蹄管组织内类菌原体的存在。至上世纪年代前期，已有多种黄化丛枝病毒病的病原被重新研究，他们被归于螺原体、类菌原体和类立克次氏体三种类型。前两者无细胞壁，对四环素敏感，而后者具细胞壁，对四环素和靑霉素都敏感。年等用四环素浸泡叶斑驳病病芽后嫁接的苗木不发病；等丨。用青果病树加压注射四环素发现病果率减少年到年间，广两柑橘黄龙病研究小组’采用四环素和土霉素分别浸泡接穗，树干灌注、叶片喷布和土壤饶灌，结果表明，通过浸泡接穗和树干灌注可抑制发病；后经上海生化所电镜观察到病原体，并青霉素浸泡接穗，发现病原亦对青霉素敏感，说明病原应属于类立克次氏体成称类立克次氏体细歯；年柯冲等【用电子显微镜也观察到在福建和广西的病株内发现类立克次氏体；等】及等还发现盘尼两林可有效抑制病情的发展。因此，根据以上研究结果，等认为黄龙病病原为革兰氏阴性细菌。等】利用电镜等手段确定了黄龙病歯的形态，它是有多？丨性的营养苟求细菌，寄生于维管束的蹄管细胞，可通过变形经蹄孔移动，人小约两层外膜，厚约新生的菌体较细长，约，衰老的曲体球形，直径约细胞质较稀薄。近年来，经分子生物宁鉴定，确定了黄龙病菌的分类地位，属变形门（，变形菌纲（，根瘤菌根瘤菌科（軔皮部杆菌属（。等在年克隆了亚洲型歯株印度）的一个片段（并测序，发现其与高度保守的细菌操纵子操纵子）一致。通过比较操纵子和细菌序列发现，黄龙病菌属真细菌中的一种。等在年克隆测定了亚洲菌株和非洲菌株的，与其他细菌的比较发现，两者均属于纲的亚纲，两个菌株最靠近亚群（，但与其在上同源性仅为，因此推断黄龙病菌属亚纲的一个新成员，并建议定名为‘ 第一章文献综述’。亚洲株和非洲株在上的同源性为，但在高度保守的￥操纵子上的同源性仅为。因此认定两者为同属不同种，前者定名为‘‘，后者定名为‘‘丨。年等丨根据国际命名规则将改为同时在南非发现一种与非洲菌株亲缘关系更近的菌株，并认为该种为黄龙病菌非洲种的一个亚种，命名为等年在巴西圣保罗发现疑似黄龙病样品，测得其序列与亚洲种、非洲种的同源性分别为和，根据国际分类原则定为一个新种，即柑橘黄龙病菌美洲种（‘’）。亚洲种和美洲种属耐热型，在°和°均可发病非洲种属热敏感型，在°病症严重°以上症状则减轻或消失，。病原分离培养上世纪年代起，国内外陆续冇成功培养根橘黄龙病菌的报道，但迄今仍未能有一个公认成功的案例。年】报道成功培养黄龙病菌；赵鸿燕等将病叶勾浆过滤液接种于培养批橘青果病病原的培养基上培养，用超薄切片验证培养物，并进行抗菌素敏感性实验及生物感染实验。然而，以上分离培养实验均未经柯赫氏法则（’验证。年胡勤学等采用感染黄龙病菌的长春花嫩叶作外植体，诱导形成愈伤组织，对愈伤组织进行切片观察，发现有典型的类细菌，其形态、大小及结构与从感病桥橘及感病长养花叶切片观察到的相一致，从而认为初步建立了长春花的组织培养方法和可以研究类细菌的离体培养系统，后亦无人重复其试验。近年等运用相■橘黄龙病菌的放线菌勾亚洲相橘黄龙病菌共培养，并进行电镜切片观察和验证，结果表明培养物为拼橘黄龙病菌，同时通过的特异引物护增显示，寄主橘和桥橘木風体内广泛存在放线菌。等】在制的培养基上加入根橘叶柄和中脉的提取物以及放线菌酮，成功培养出桥搞黄龙病亚洲种及美洲种病原菌，培养物的菌落呈多形、杆状，外有类似伞状的结构，同时进行了部分柯赫氏法则验证，并实时定量检测黄龙病菌的存在，然而该培养方法无人能重复验证。病原种内分化研究年孔维文等…克隆了中国桥橘黄龙病菌的一段长为的片段，通过比对，与亚洲种已知相应序列间同源性达，用方法分析得出，扩增的片段之间没有差异。该研究为制备相■橘黄龙病菌分子探针奠定了基础。随后廖晓兰等对采厦门的析橘黄龙病菌克隆测序比对；刘利华等】对来我国相橘主产区、泰国和法国留尼汪岛等个地方的拼橘黄龙病菌进行分析；单振菊、冯震等’对引起沙田柚斑驳症状的拼橘黄龙病菌广操纵子和；测序比对；等对引起文旦柚斑驳症状的相橘黄龙病菌、操纵子及外膜蛋白（基因克隆测序比对；彭军等对海南彬橘黄龙病菌序列分析；丁芳等对来 西南大学硕士学位论文自中国省区不同寄主上个黄龙病菌分离物的基因区进行分析；张利平等】对浙江柑橘黄龙病菌操纵子核糖体蛋白基因进行了序列对比。以上研究结果均显示，我国柑橘黄龙病菌为亚洲种，其上序列高度保守，操纵子及外膜蛋白基因均有明显变异。廖惠红等对柑橘黄龙病菌亚洲种内的序列进行比较，发现种内之间假定细胞壁水解酵假基因和的基因序列非常保守，但不同地理来源的相橘黄龙病样品碱基序列间确实存在差异，差异大小与地理的远近无关。胡文召等运用种不同的限制性内切酶对不同来源的黄龙病进行分析，结果表明黄龙病菌在基因水平上存在差异，但不同株系间差异仍不明显，一些酶切位点发生了突变，可能与不同的进化压力有关。对釆自中国湖南的一个批橘黄龙病样品扩增克隆测序，通过比对序列，与亚洲种（、非洲种（及美洲种（的同源性分别为、及表明该样品病原有可能为柑橘黄龙病美洲种，但仍需进一步确认其可靠性。单振菊等对中国南方省区相橘黄龙病菌经序列分析和聚类分析，得出其序列与上述三个中登录的黄龙病菌同源性分别为：、、表明中国南方省区相橘黄龙病菌均属于亚洲种，但在亚洲种内部不同地区的黄龙病病原发生了微小变异，其中福建厦门和云南个旧的两个菌株变异较大。随着柑橘黄龙病菌亚洲株系全基因组序列测定的完成为其种内分化研究提供了更多可供选择的基因组位点。等【％对东南亚各国黄龙病亚洲种睡菌体型聚合酶基因遗传多态性分析的结果表明，不同菌株在该位点上多态性丰富。随后等对一个具有串联重复的基因位点分析发现广东和佛罗里达两地亚洲种菌株的差异明显，同时认为佛罗里达黄龙病的基因型与其地理分布有关。等利用原唆菌体末端酶基因对云南和广东的病原菌多态性进行评估，表明这两个不同地理来源的病菌种群在该基因上的检测频率显著不同。近日，王雪峰从亚洲种基因组中筛选出个具有株系差异特性的位点，丰富了当前用于亚洲种遗传多样性研究的基因组位点。另外，年月在第届国际黄龙病学术研讨会上获悉，黄龙病美洲种的测序工作已基本完成，与亚洲种序列比对分析表明两者在诸多位点上存在序列差异。柑橘黄龙病病菌种群分化研究将为黄龙病起源、流行等研究提供更多证据。诊断与检測相橘黄龙病的诊断及检测方法较多，主要采用田间症状观察及指示植物鉴定、电镜切片观察、血清学检测和分子生物学技术等检测方法鉴定。田间诊断采用田间目测症状的方法诊断树体是否发病的特异性不强，但在生产上仍是常用的病害鉴定方法。柑橘黄龙病症状复杂多变，在不同生长季节拼橘黄龙病可以在叶片、果实和植株 第一章文献综述上表现不同的症状，增加了症状鉴定的不确定性。典型的柑橘黄龙病症状主要包括斑驳型黄化叶、红鼻果、黄梢等。指示植物鉴定指示植物鉴定需要的设备和技术简单、方法简易可行，是早期相橘黄龙病主要的鉴定方法。现有的栽培品种对黄龙病均较敏感，而不同株系及不同品种发病症状具有多样性和不稳定性，因此可用指示植物对可疑树加以鉴定。在指示植物的选择上，印度釆用甜橙或，南非采用伏令夏橙或奥兰多梧柚于°下进行鉴定，我国一般采用棰柑进行鉴定。鉴定用的指示植物必须釆用实生苗，整个鉴定过程在防虫设备中进行。实验室鉴定电镜观察电镜检测的原理是在电镜下可以直接观察到菌体的形态、大小及壁膜结构等，检测的关键环节是制作超薄切片。由于柑橘黄龙病菌在树体内菌量较低，且分布不均勾，同时电镜制样采用的样品很小，致使电镜检出率偏低，可能影响病害的诊断。对柑橘黄龙病菌进行电镜观察时，以柑橘叶片的中脉和侧脉为材料，固定前对材料真空处理，可使植物材料的固定和包埋的效果更好。国内外学者运用电镜检测技术在黄龙病菌的鉴定上均做了不少工作。年等用电镜观察到批橘黄龙病病原；等丨根据黄龙病菌局限于筛管细胞中且具有细胞壁，而其它桥橘细菌性病害的病原菌均不具备这两个特征的事实，从而利用电镜观察来诊断柑橘黄龙病。由于使用电镜检测易受取样部位、取样时期和制样方法的限制，故在实际生产中较少采用，此外，电镜观察法在形态上尚不能区分黄龙病菌不同地理株系的差异。组织化学检测上世纪年代中期国内采用突光显微镜检测，病株韧皮部呈现黄色焚光，而健株中则未发现，同时可用蕃红染料将病株初皮部染成红色。吴世盘等使用透射式焚光显微镜观察黄龙病病原，该方法采样时必须取充分成熟的叶片，同一株病树仅秋梢叶可能观察到病原；林尤剑等利用染色法首次成功利用光学显微镜观察到黄龙病菌，并建议选取的材料以各梢期的新梢幼叶或嫩莲为好，样品切片厚度以为宜。组织化学检测法其准确性受取样时间、取样部位及制样方法的影响，容易造成漏检，实际生产中少有采用。血清学检测柯穗等从长春花病株的叶脉中提取出黄龙病病原作为抗原，按常规方法免疫普通小白鼠，制备了小鼠腹水抗体。由于黄龙病病原在植株体内含量低，且分布不均勾，所以提取的病原浓度和纯度均较低，血清学测定结果表明该腹水抗体效价较低，并伴随有非特异性免疫反应干扰。年等制备了黄龙病抗血清，但检测的特异性不强；随后利用免疫生物反应法纯化了黄龙病抗原，制备了中国福建和印度黄龙病病菌的单克隆抗体，特异性得到 w南大学硕士学位论文一定提高；截止年，等共制备了中国、印度、南非黄龙病病菌的种单克隆抗体；等袖黄龙病病原菌单抗与黄龙病菌印度株系反应，后运免疫亲和色谱法纯化出黄龙病抗原蛋内，用脾细胞体外免疫，共制备山的三种单抗均不勾非洲种病歯反应，可识别除两个中国株系外的所有待测亚洲种株系，其余两个单抗可中国株系以外的大多数亚洲种株系反应，通过制得的种抗体可将印度尼两亚、菲律宾、泰国等地的个株系分为种不同的血清型。李德望等】用与柯穗类似的方法制备了小鼠抗腹水，其效价得到较大提高，能较准确地检测出长春花中的病原菌，但对初显症或未显症的拼橘植株及部分具典型症状的病叶进行检测时无血清学反应。田亚南等以黄龙病齒初提纯物为抗原蹄选到的两个杂交瘤细胞株能分泌黄龙病菌单克隆抗体，并釆用免疫焚光法检测，该抗体能区别长春花和相橘病株，而健康株则不产生炎光反应。单克隆抗体由于专一性过强，难以适应不同地域的黄龙病菌变异菌株，可能会造成漏检，综合使用不同单抗的组合也许可以克服。而它易造成假阴性且必须用炎光显微镜进行检测，同时抗体制备复杂、检测范围亦窄，因此限制了单抗免疫学检测技术在生产上的应用。生化指标诊断上世纪七八十年代，人们采用感病植株树皮或病果皮屋中存在而健康植株不存在的劳光物质龙胆葡糖廿作为黄龙病株的生化指标丨，经纸层析或薄层层析来鉴别黄龙病及裂皮病，运用此方法，黄龙病株在下可以观察到亮蓝紫色斑点，但该法仅在发病初期检测有效，同时在加州的拼橘顽病病组织中也检测到该生化物质，表明其检测特异性不足。陈肇春等用聚两稀醜胺凝胶电泳法（分析得山，在拼橘病株中存在一种健株所没有的特异性蛋内质，且该蛋内质与供试品种及症状差异无关。吉前华等指出贡相的黄龙病病株果实同酶缺少的主酶带，可作为贡拼感病的早期检测指标。不同拼橘品种以及受不同季影响，感病组织中指示物浓度不同，因此用生化指标的方法在精确诊断中运用较少。核酸分子杂交等和等分别制得了检测黄龙病菌亚洲株系和非洲株系的和探针，两探针之间有的同源序列，均能与同源菌株染交，可检测所有黄龙病菌亚洲株系，而在高度严格洗脱条件下，不能与非洲菌株染交或染交信号很弱，在不严格的洗脱条件下有杂交信号。等用探针检测印度黄龙病样品，其检测结果与电镜检测结果基本相符。等。用探针来检测相橘木風体内黄龙病菌，其灵敏度可达到单头木風的检测水平，同时还利用探针杂交技术发现，在毛里求斯存在黄龙病菌亚洲和非洲株系，也调査了非洲及亚洲个国家的黄龙病分布情况。等〗运用上述两种探针同时检测南非黄龙病样品，结果显示的检测结果均为性，而的检测结果均为阴性，表明该方法具有较强的特异性。丨等蹄选出对引物，利用技术区 第一章文献综述分黄龙病不同株系，获得的特异性片段与亚洲种的五个株系进行杂交，结果表明与来印度株系相似性最高，与泰国的株系相似性最低，等。也制备了不含放射性元素的地高辛探针。然而，探针技术检测耗时长，动化程度低，检测结果稳定性差，实验条件极难掌握。检测检测技术灵敏、快速、便捷，是实验室检测最常规的技术。根据检测要求的不同，又分为常规、巢式或半巢式、实时突光定量及竞争性定量、多重等。对具有症状典型的黄龙病病株用常规检测就能确认。等丨丨“】根据黄龙病菌亚洲种和非洲种的序列设计引物对，产物必须经限制性酶恐酶切，从而区分亚洲种和非洲种，其中亚洲种产物被酶切为和的两个片段，而非洲种产物被酶切为、和的三个片段。随后等°根据亚洲种和非洲种核蛋白的操纵子设计的引物对，可特异性区分亚洲种和非洲种。黄龙病美洲种发现后，等根据美洲种的序列设计的引物对可特异检测黄龙病菌美洲种。由于黄龙病菌在相橘病株中含量低、分布不均勾，导致常规检测灵敏度不高而出现漏检，甚至在同样的反应体系下，因所用引物的差异，检测灵敏度也有很大差别。因此应按照不同目的选抒合适的检测引物，特别是当待检样品浓度较低时，应选择高灵敏度的小片段特异性引物巢式或半巢式的检测灵敏度就远高于常规其原理与常规相似，所不同的是它需要进行两轮扩增，第二对引物所跨越的目的片段包含在第一对引物跨越的目的片段之内，在第二轮扩增中，只有目的产物被继续扩增，因此提高了其检测灵敏度。等率先运用巢式技术检测黄龙病菌亚洲种和非洲种，结果表明，其灵敏度高于常规李韬等发现，常规只能检测最低头带菌批橘木風，而巢式能检测到单头樹橘木風及尚未显症植株中的黄龙病菌；丁芳等运用巢式和常规检测感染黄龙病的不同品种，结果也显示前者可更早地检测到接毒植株中的黄龙病菌。技术的原理是将已知浓度的竞争物和等量病原在同一体系内进行，彼此竞争引物和其他反应底物，竞争物与病原的产物比值与竞争物初始浓度反向线性相关，通过反向线性相关曲线即可推算出相对病原的浓度，但方法相对复杂。实时突光定量技术具有快速、特异、敏感、重复性好等优点，己被广泛应用，。等丨“运用定量技术进行了不同姑木对黄龙病的抗性研究。等和等运用定量技术研究病原菌在病株和果实中的含量发现，病树体内病原含量中脉、叶柄最高，树皮次之，树根最低；果实中橘络、果柄含量最高，中柱次之，果皮最低；胚和胚乳中没有检测到病原菌的存在。 西南大学硕士学位论文多重技术用于检测受复合侵染的柑橘植株，可大大提高检测速度，由于反应的特殊性，多重应优先考虑退火温度高的引物，其使用浓度需大于退火温度相对较低的引物。流行学研究传播途径林孔湘先生于上世纪年代首先证明柑橘黄龙病能通过病树接穗嫁接和带病苗木进行传播。此外，柑橘木虱和宽丝子是目前已知的可以传播相橘黄龙病菌的媒介。土壤、流水、大风、修剪、其它昆虫及动物传病的可能性很小。研究表明，不同时期不同组织嫁接传病的成功率不同，其中月嫁接的苗木发病率最低，不同组织嫁接传病效率的顺序依次为多芽枝段】、单芽枝段、无芽枝段、枝皮。除郁皮部外，也有木质部传播亚洲柑橘黄龙病病菌的报道，但传病率极低，潜育期很长美洲种的嫁接传毒率明显低于亚洲种柑橘木風是黄龙病最重要的自然传播媒介。其中亚洲相橘木虱属耐热型，传播黄龙病菌亚洲种和美洲种，非洲柑橘木風概：属热敏感型，只传播黄龙病菌非洲种。而在试验条件下，两种相橘木虱可互传亚洲种和非洲种拼橘木風的口器吸取病叶的汁液时，病原体随汁液流经消化道、体液再循回到唾液腺内丨丨属于持久性传播的机制。病原体在体内分布广泛，在主唾腺和消化道滤室及唾液腺周围的脂肪体、中肠及后肠内均能观察到，尤以中肠内皮层细胞及唾液腺的外皮层细胞中含量最髙，推测病原有可能在这些地方增殖。病原在虫体内循回期的长短及其持续传染时间是柑橘木虱传病效率高低的重要标志。循回期的长短不一，短的最多天，长的可达天，成虫一旦获毒可终身带毒，樹橘木虱龄若虫及成虫可传播病原菌龄若虫及卵则不能传播黄龙病菌。等证实柑橘木虱从感病植株上获毒后，需经天左右的潜伏期才具有传播能力。柑橘木虱获毒需分钟，非洲木虱需小时单只柑橘木風即可造成感染，但传播效率低，带毒相橘木虱传毒成功机率仅，需有大量的柑橘木風才可能造成感染。拼橘木風带毒虫率率会随季节而变动，月和月是一年当中柑橘木虱带毒虫率较高的时期，其变动的原因受到温度、新芽数量及植株内病原浓度的影响实验条件下，经草地冤丝子及五角冤丝子还可以将黄龙病菌传播至长春花、烟草和番瓶上。一般认为黄龙病菌不能经种子传播，病果实种子大多败育。最近等〗的研究也认为感病果实种子传病不能得到证实；的研究表明，在感染过黄龙病菌的种子、种皮及花梗中检测到黄龙病菌，但种子传病仍不能得到充分的证明》发病特点病害潜育期 第一章文献综述影响黄龙病潜育期的因素较多，其变化范围可由几个月到几年。在佛罗里达年的果园，要想使防除柑橘木虱和砍除病树等措施表现出明显效果，期间至少需要年来砍除之前因未表现症状而累积的病树。这表明该地的潜育期应为年。幼龄果园在定植后个月内就可显症，表明长势旺、树冠体积较小的幼树，潜育期较短。谢钟深等应用滑动相关分析也推测出黄龙病的潜育期为个月。病害潜育期影响着病情的调查，摸清潜育期范围，有助于病害发展趋势预测及控制措施的及时实施。病害流行的时间动态柑橘黄龙病为积年流行病害，与其他多年生果树病害相比，黄龙病发生率的增长速度相当迅速。在生产上，人为病害控制措施的介入使得病情往往较难到达渐近线水平，故指数增长模型、逻辑斯蒂模型和龚拍兹模型都可以用来描述病情发展。黄龙病的增长速率受到寄主、病源量、介体种群数量、果园发病史和环境条件等诸多因素影响，初期传播速率极为缓慢，当超过某一临界点后病害会快速增加而造成流行。病害发展至渐近线水平的时间范围变化较大，有报道称可由年变化到年等丨丨；开究发现，当对病区病株和虫媒不采取任何控制措施时，年以上幼龄果园发病率可在到年内达到甚至超过；而在老龄果园内增长较缓，一般在年甚至更长的时间里也达不到的发病率。黄龙病的感染与柑橘木虱种群密度、迁飞数量及带毒虫率高低有关，主要发生于月春芽期。病树（病苗）的存在及数量的多少是黄龙病发生流行的首要因素。在有樹橘木風发生的条件下，苗木带病率越高，病害扩展蔓延及至毁灭的速度就越快。如一个新植柑橘园的苗木发病率超过，或者一个成年樹拮园发病率超过根橘木風数量又较多，往往可在年内使整个柑橘园严重发病而丧失经济栽培价值。不同种类和品种的相橘树在发病后的衰退速度有差异。棰相、蕉柑、大红梧和福橘等品种较感病，幼龄树感病后一般在当年或下次梢期就会全株发黄，成年树感病后也往往在年内迅速黄化衰退，基本丧失结果能力；在肥水管理较好的情况下，在年内还可维持一定的结果量。病害空间分布通过绘制汕头地区果园内黄龙病树分布图发现，病树在田间趋向于朝同一方向聚集，南北方向的病株率为，远高于东西方向的，且分布方向与果园的朝向及园内交通要道走向一致该现象说明，病树在田间存在一种边缘分布效应，此效应在留尼汪岛、巴西和佛罗里达等病区中也得到了验证，黄龙病果园中，公路、池塘、灌溉用河道等地貌特征使植株的分布存在不连续性，它们起到一种分界面作用使边缘效应成为可能。等研究还发现，果园中距离起分界面作用的未种植区越远，病树密度骤减，病害梯度符合反向幂次函数（，模型。虫媒传病特点农作物种植区在田间往往不是大片连续种植的，这种不连续性影响着病原菌的成功侵染 w南大学硕士学位论文或传病媒介的扩散，从而影响病害空间分布。在黄龙病的例子中，即表现为制约传毒媒介拼橘木風的活动。批橘木風从未种植区飞向种植区寻找寄主时，显然优先停靠在果边缘或是分界面上的植株。由于虫媒的群集性，使得边缘累积更多病树。当然，这并不代表桥橘木虱不会向果闻中间扩散，而是指边缘聚集的概率更大。当食物充足时，它们往往定点取食，而当食源不足时，则被迫飞向果阔中间取食，从而使病害的再次传播得以发生。等【】计算出拼橘木風活动的范围通常在之间；同时用马尔可夫链蒙特卡尔理论（证实相橘木風首次侵染对再次俊染的重耍性；开用离散傅里叶变换（，证实柑■橘木風存在多种远距离传播的可能，如台风，热带风暴等。研究者提出，传统种植方式并未考虑边缘效应的存在，果园常存在高度不连续性。因此，在规划果同时应尽量保证大片种植，使阔内留存的未种植区面积最小化。按此方法种植，相橘木風则不断入侵外缘植株，便可通过不断地移除病树并补种的方法来保持外缘的缓冲区。柑橘木風主要在嫩梢取食繁殖，故嫩梢老熟快的果园病害传染机会少，发展速度慢。通过肥、水及农事操作管理控制抽梢次数和梢期长短，同时增强植株抗病性，可影响病害发展。相橘木風的数量及活动受生态条件的影响。若虫生活适温为，适宜湿度为，雌成虫产卵量与日照强度和时间正相关。春旱气候有助丁拼橘木風种群建立，因春季为抽梢、开花和结果的定式季节，备提供稳定食源与繁殖气候的双重有利因素。高海拔与高缂度生态环境限制柑橘木風生存，讳度对黄龙病影响较海拔显著此外，相橘木風的发生还受相橘新芽数量的影响，一年有二个高峰期，春芽期最高，夏芽期次之，秋芽期最低。桥橘木風的迁飞现象发生于月，与成虫羽化后种群密度的高低有关。相橘黄龙病防控技术根橘黄龙病号称桥橘癌症，前还没有直接防、冶的有效药剂，在发生区对该病的防控应采取以严格苗木的调运植物检疫制度、建立无病苗圃、培育无病毋壮苗、加强对传病虫媒桥橘木風的防治、及时挖出病株为中心的综合防治措施。黄龙病的管理可由减少感染源及降低传播速率着手，管理原则为控制病势的发展在人发生的临界点之下，然后配合各种防、冶措施使病害数量逐渐减少来维持拼橘产能严格种苗调运，建立无病苗圃严禁病区的接穗和苗木流入无病区和新区，从发生区调出种苗时应向当地植物检疫部门中请检疫，经检疫部门检疫合格，确保无黄龙病后，凭植物检疫证书调运。未经检疫的桥橘种苗不得外调。在市场销的柑橘苗木必须具有合格的植物检疫证书。苗木繁育的检疫防控应从以下儿方面出发。一是建立无病良种母本园和苗圃，培育无病壮苗。母本园、苗圃最好选择在无拼橘木虱发生的无病区，并用目防虫网全封闭隔离。 第一章文献综述二是建立母本园或苗圃之前，要彻底清理圃内（园内）及附近的零星柑橘类植物及九里香和黄皮等柑橘木風的寄主植物。三是，苗圃的站木种子和接穗等繁殖材料应采自无病母本园品质优良，生长健壮而丰产的柑橘树，需从外地调入的必须具有植物检疫证书四是，加强苗圃及周围地区柑橘木風的监测，一旦发现有柑橘木風，应及时喷药彻底扑灭，如有生长异常的苗木要及时挖除烧毁五是，苗圃定期开展产地检疫检査，由植物检疫部门会同有关技术人员在苗木夏梢转绿后、秋梢转绿后和出圃前进行检查，检疫检查合格的由植物检疫部门出具产地检疫合格证，苗木出圃外调时必须具有调运植物检疫证书。种植无病壮苗新建柑橘园应种植经过检疫合格的健康苗木，防治黄龙病随有病苗木传播扩散至无病区或新区。新柑橘园距离病柑橘园越远越好，在平原区至少要公里以上，也可种植非芸香科植物作自然隔离屏障，阻隔樹橘木風的迁移。防治批橘木風柑橘木虱是柑橘黄龙病重要的传病虫媒，因此防治柑橘木虱是预防樹橘黄龙病发生的重要环节。加强柑橘木風的调查监测，准确发布虫情预报，及时防治粗橘木風在果园内悬挂黄色诱虫板和焚光灯诱杀成虫，并抓好两个用药防治时期：一是每年春芽萌动前，结合冬季清园，喷施杀虫剂防除；二是每次新梢抽发斯，尽早抹除零星新梢，加强肥水，促进新梢整齐萌发，并喷两次杀虫剂防除。可选用高效低毒、低残留的农药，如批虫啉可湿性粉剂倍、虫螨藉乳油倍、农敌乐倍、奥杀躺倍、甲氰丙溴倍等药剂，与拟除虫菊酷类、阿维菌素等轮换交替使用。挖除病树，消除病源，更新相橘园柑橘园内一旦发现病株要立即整株挖除并烧毁，挖除前全园喷施一次杀虫剂防治柑橘木風起飞。发病率为低发病率，挖除病株后的空穴可在次年春补种无病大苗，发病率为高发病率，实际感染率临界值，依据流行病学发病率进入迅速增长阶段；发病率则需改种其它作物或经年后重新种植无病苗。加强栽培管理在做好防止病害蔓延的前提下，加强栽培管理，创造相橘生长的优良农业生态环境。控制冬（芽）梢的萌发，对夏、秋梢要通过尽早抹梢控梢，统一放梢，控制虫源，加强肥水管理，增强树势。 第二章引言第二章引言相橘是世界第一大水果，中国是柑橘第一生产大国，相橘产地分布在北讳°°之间，海拔最高达米，南起海南省的三亚市，北至陕、甘、豫，东起台湾省，西到西藏的雅鲁藏布江河谷都有柑梧的分布。但经济栽培区主要集中在北讳°°之间，海拔米以下。全国包括台湾省在内有个省区栽培柑橘，其中主产区主要是浙江、福建、湖南、四川、广西、湖北、广东、江西、重庆和台湾等个省（自治区、直辖市，其次，上海、贵州、云南、江苏等省（直辖市，陕西、河南、海南、安徽和甘肃等省也有种植。入世以来，我国柑橘产业快速发展，种植规模、单产水平和出口量均有较大增长，产业布局向优势区域集中，生产技术不断提高，品种和熟期结构得到优化，相橘产业已成为柑橘主产区农民增收致富的重要途径。由初皮部难培养菌‘￡’’引起的柑橘黄龙病是一种毁灭性柑橘病害。目前该病已蔓延至五大洲的近个柑橘生产国，成为制约根橘产业健康发展的关键因素之一。自年在我国南方调查经济作物病害时首次发现黄龙病以来，该病在广东、广西、福建、台湾等柑橘产区造成巨大经济损失。上世纪年代，台湾记载有黄龙病的发生，当时被称作立枯病。抗战以前，福建和广西两省区就有因相橘树势严重衰弱而大量砍伐柑橘的记录。上世纪年代中后期，云南西双版纳、四川攀西地区及江西籍南地区也先后报道有粗橘黄龙病危害。上世纪年代初期，该病又在浙江平阳、湖南宜章及贵州罗甸等地发生，到上世纪年代中期，已在我国广东、福建、广西、台湾和海南的相橘产区广泛蔓延。柑橘黄龙病的流行受到寄主感病性、病源量、昆虫介体种群数量和生态环境等诸多因素影响，病原菌可通过嫁接及昆虫介体根橘木虱传播。早些年代，由于相橘苗木市场监管力度不够，且上世纪年代中期才认识到相橘木虱为黄龙病的田间自然传播介体，累计了大量虫源，同时品种布局不够合理，果园管理松散，造成病害的迅速流行。近年来随着全球气候变暖，媒介昆虫分布区域北移，同时种苗、接德等的不规范调运，致使病害呈不断蔓延趋势。根橘黄龙病在中国的记载已有近百年的历史但国内至今尚未对中国根橘黄龙病发展史进行较为详尽的研究分析，而对病害发展动态的梳理将有助于了解病害的起源及流行。鉴于此，本论文通过广泛、系统地收集整理分析中国柑橘黄龙病从发生蔓延至今的病情报道、科研动态等历史文献资料，以明确黄龙病在中国各病区的发生动态；同时探讨全球气候变暖、栽培模式变更、农业体制改革、桥橘产品贸易全球化等因素对病害蔓延的影响。此外，对中国‘种群出现明显分化的研究报道不多，迫切需要对已获得的结果进行进一步验证，因此本论文还通过在柑橘黄龙病菌全基因组上选择的个标位点对中国不同地区采集的病原菌株进行多态性评估，旨在分子水平上进一步探讨病害的起源、流行及病原菌种群特性等。 第三章中国相橘黄龙病发生动态及蔓延原因分析第三章中国相橘黄龙病发生动态及蔓延原因分析中国彬橘黄龙病各病区不同时期病情发生动态年间，通过与各根橘种植省区植保植检站、科研单位等相关部门了解情况，并从中国农业科学院樹梧研究所柑橘黄龙病研究资深专家赵学源先生处获得大量柑橘黄龙病发生发展及研究的一手资料，同时从樹梧产业技术体系、农作物有害生物调查系统、各大数字资源数据库中广泛收集关于病害发生蔓延的相关报道，得到了柑橘黄龙病发生区病害发展的动态，现将分类整理结果及病害蔓延原因分析如下：广东批橘黄龙病发生动态广东省属南亚热带季风气候区，气候温和、雨量充沛、四季宜农、水热同期，具有良好的适宜作物生长所需要的丰富气候资源。广东农作物品种资源丰富，其中水果种质资源尤为丰富，发展水果产业有着得天独厚的优越条件。柑橘是广东大宗种植的水果之一，广东栽培相橘历史悠久，也是我国樹橘优势产区及特色柑橘生产基地，进入世纪以来，广东省柑橘产业迅猛发展，在全国柑橘生产中占有重要地位，年广东相橘种植面积万亩，产量万吨。广东是中国柑橘产区中第一个报道有相橘黄龙病发生的地区，但林孔湘先生上世纪年代在潮安县调查时当地老农就介绍在此年前黄龙病已有发生，年为害最为严重，后因潮汕地区抗战期间缺乏粮食，砍除柑橘种植水稻，抗战胜利后，最初几年黄龙病在新种植区鲜有发生，但自年起，病害再一次开始蔓延此后，广东才对柑橘黄龙病的危害引起重视。在此期间，涂治（】、何畏冷（、黄亮（林孔湘（等均报道了该病的危害。广东从潮州相开始到阳江植、红江棱、砂糖橘产业的发展均先后遭遇了黄龙病的制约和影响，每十年出现一个周期。年报道，潮汕地区育苗时对母树的选择不严格，常从感病的甚至已发病的母树上取芽嫁接或压条繁殖，所育的苗木在省内外都有调运栽培。据统计，到年止，广东省内已有如下地区发生柑橘黄龙病：潮安、潮阳、普宁、饶平、澄海、新会、番禹、英德、中山、从化、博罗、兴宁等。据不完全统计，潮阳、普宁、潮安等地区柑橘园病株率一般为，重病园达新会县年较年减产倍汕头专区年万株受害，年增至万株。这些地区先前主要采用实生繁殖和高空压条繁殖，到上世纪年代陆续使用嫁接繁殖。据此推断，带毒繁殖苗木是病害在这一时期迅速蔓延的原因之一。文化大革命期间’广东大部分柑橘产区柑桔园严重失管，病虫害蔓延严重’产业受到重创。年，在广东个柑橘生产县中调查，其中有个县都已发生黄龙病，一般发病率有的高达。据统计，著名产区四会县产量曾达吨，因黄龙病流行，此时产量已不足吨；汕头地区澄海县是生产新区，年因黄龙病流行挖除尚未投产的万多株；普宁县宝 内南人学硕十学位论文镜院一个人队每年即育五、六百万株苗，有的年份上千万株，不经检疫就运销全国。上世纪年代初期是广东柑橘种植面积高峰时期，年种植面积万亩，总产万吨。到上世纪年代中后期，黄龙病再次席卷广东拼橘业，导致全将相■橘面积（不含柚类）直线卜滑至年的万亩。本世纪初，广丨拼橘产业重新起步，由丁砂糖橘产的不足和市场的红火，广东迎来了砂糖橘抢种潮，桥橘产业进入快速发展时期。到年达到顶峰，橘面积达万亩，其中砂糖梧种植面积接近万亩。广东柑橘产业在近十年得到快速发展，但随之而来的仍是黄龙病的人面积危害。据年上半年全、拼橘黄龙病专项调汽，黄龙病发生面积万亩，发生及危害日趋严重。全货种植拼橘市县均有发生，主耍分布在肇庆、云浮、淸远、揭卩、潮州、梅州、惠州、河源、韶关、湛江等地的柑橘土产区。至年，肇庆市的树橘种植面积达万亩，年仅剩约万亩。同时整体发病率高，据统计发病面积约山种植面积的拼橘老产区尤其严重；更令人担心的娃由丁种苗的问题及黄龙病病区新植果问，发病树低龄化趋势越来越明显，一些年生果丨元丨发病率达到主栽品种、片：遍感病，主耍有沙糖桔、贡拼、蕉拼、摊拼、年拮、马水桔、甜僚、洪江僚、沙田柚、杆檬前除貯檬外都严童发病。广东桥橘黄龙病发生动态如閱。細「■响义上世纪年代后行区图广东柑橘黄龙病发生动态（白色区域代表未査到相关病情） 第三章中国柑橘黄龙病发生动态及蔓延原因分析福建相橘黄龙病发生动态福建地处我国东南沿海，地跨南亚、中亚两个气候区，背山面海，气候温和，雨量充沛。年均气温在°沿海全年高于冬季温暖，月沿海平均气温，山区°。福建省在发展水果产业上具有不可多得的气候条件。近年来，福建果业以发展区域特色和增加农民收入为目标，进一步调整结构，优化布局，加快无公害生产和体质增效步伐，实施名牌战略，大力推进产业化经营，福建柑橘产品综合优势得到更加充分体现。年，全省柑橘种植面积万亩，产量万吨，福建省正发挥着在闽东南南亚热带地区发展优质晚熟柑橘、闽西北地区发展优质特早熟柑橘的“早与晚”的气候优势，使柑橘业得以快速发展，竞争能力不断增强。福建在年间，随着潮州相橘苗木的引进，将黄龙病传入当时福州地区的柑橘育苗基地闽侯县上街镇，之后潮州柑上的病原被传播到该地培育的福梧和雪柑苗木上，在苗木推销至各产区的过程中使得病害逐渐蔓延至福州周围果区。而黄邦侃认为，福建黄龙病最早是在龙溪专区（现龙海市辖区内）发生，以后再蔓延至闽侯、福州及晋江，并在年在福州近郊发现相橘木風为害。年福建柑橘病虫研究组】对省内柑橘黄龙病进行调查，结果发现：闽南地区发病严重，龙溪地区年前仅个别地区发病，年全区发病率达，年达，淳州市为，长泰县为，漳浦、云霄、诏安、海澄、华安、南靖、平和、东山及福州市郊外都已发病；而闽北地区的邵武、建阳、沙县、南平市农科所等地均有向龙溪、闽侯等病区大量引进苗木的记录，但当时调查尚未发病。到上世纪年代前期，福建黄龙病主要在闽南地区为害，其他地区较少或未见发生。但是由于福建在发展过程中苗木调运监管不严，导致带病苗木销售至各栽种区，甚至省外柑橘产区，加上柑橘木虱的大量发生，致使病情不断蔓延扩展。年调查，莆田、泉州、永春、龙岩和闽侯等县部分果园亦有发现，并有逐步扩大的趋势。据年调查柑橘黄龙病及柑橘木風几乎遍布福建省各地根橘园表现为南重北轻、低海拔重高海拔轻、老区重新区轻。年全省根橘种植面积万亩，产量为吨，但因黄龙病感染，到年统计，全省种植面积已达万亩，但产量只有吨，并且全省的主产品种在这十年内发病率都在以上。年福建省相梧黄龙病危害及流行规律研究表明福建省各县及柑橘主产乡镇均可查到桥橘木虱和黄龙病病株，黄龙病发病率的占，的占平均发病率闽东南地区发病率闽西北地区为主栽品种间发病率为宽皮梧类甜授类柚类。福建柑橘黄龙病发生动态如图。 w南人硕十学位论文垣建。▲南平市丫广人■契狀市纖巧々‘。、上世纪响代行区□□上世纪响代断区上世纪年代汝行区图福建彬橘黄龙病发生动态广西相橘黄龙病发生动态广壮族治区地处中国华南，位丁东经°°、北讳°°‘之间。从北（桂林）至南（北海）年平均温度°，》丨°：有效积温：巧温线基本上讳向分布，气温由南向北递减，由河谷平原向陵山区递减，属亚热带季风气候，为种植拼橘提供充足的温度、光照、雨水条件。广栽培柑■橘历史悠久，是种植拼橘最适宜或适宜区，桥橘是广内主耍经济作物之一，在全国拼橘生产中有重耍地位。农业部年确立广两为全国重耍拼橘生产基地后，年月乂把广两“桂北”列入全国拼橘优势区域发展规划，极人地推动了广两柑橘生产发展。桥橘产业已成为广两农村经济的支柱产业和广人农脱贫致富的骨干项。年，广两拼橘种植面积万亩，产万吨。桥橘黄龙病在广两蔓延危害已有多年历史，给农造成的经济损失巨人，仅十年就将桂南柑橘基本摧毁，桂南拼搞毁灭后乂进一步北位，一直制约广两拼橘产业健康发展。近年来，广两人力开展柑橘黄龙病综合防控治理丨：作，取得了显著的成效。广两柑橘黄龙病的发展人致可分为年代前和年代后两个阶段。上世纪年代以前，经广两拼橘黄龙病研究小组的多次调汽证实黄龙病的分布北限是落浦和永福两县，此两县以南的县市都有黄龙病发生，其中柳州、钦州和卫林为重病区，荡浦、永福等县为轻病区，其 第三章中国柑橘黄龙病发生动态及蔓延原因分析余为较重病区，而桂北地区，包括偏南的平乐、恭城、阳朔和临桂等县以及桂林市和灵川、兴安、灌阳、全州、资源、龙胜、三江、富川、南丹、天峨等县属于无病区。上世纪年代后，经广西相橘研究所调查证实黄龙病在广西的分布发生了很大变化。年开始在桂林、临桂和阳朔发现，年又在更北的兴安、灌阳和全州等县发现。至此，广西全境都已有黄龙病发生。年黄亮报导玉林、柳城、融县、兴叶发生相橘黄枯病，这是广西樹橘黄龙病发生最早的文字记载；但在年的资料中显示，年广西农业试验站园艺组调查报道，因树势衰退，玉林拼仅存约，因此推测如此严重的树势衰退很可能是黄龙病引起的。年，广西柑梧黄龙病研究小组在调査中看到几个相当隔离的、种植当地实生繁殖和空中压条繁殖的老果园发病严重，并据老农介绍，他们的祖辈种植的果园也是这样，从而推测黄龙病在广西发生已经很长历史，不一定所有的黄龙病都是从广东传播来的。上世纪年代广西柑橘生产大面积发展，年前后开始察觉黄龙病对柳州、南宁、玉林等地柑橘生产的严重危害才引起重视。年对广西黄龙病进行调查，结果显示桂南病重，而桂北病害极轻或尚未发病，但在桂南亦有部分地区轻度发病或尚未发病。具体情况如下重病区：博白、陆川、玉林、鬯宁、南宁、專溪、贵港、藤县、桂平、苍梧、梧州、田东、柳州、鹿寨、宜州；轻病区或中度病区：融水、贺县、隆林、宁明、平南；无病区或极轻病区：德保、南丹、桂林、灌阳、全县、阳朔、平果、容县、百色、蔡浦、三江。而位于北缂°以北的桂林、兴安、龙胜、三江等桂北各县，自年先后批从潮汕、广西南宁、玉林、柳州等地引进苗木万多株，此次调查却没有发现典型症状。上世纪年代起，人们开始意识到黄龙病的发生与柑橘木虱有密切关系，并认为相橘木虱就是田间传播黄龙病的媒介昆虫。年广西柑橘黄龙病研究小组先后到个县市调查，结果如下病虫兼有区有：贺县、梧州、落浦、鹿寨、象州、柳城、柳州、宜州、河池、玉林、灵山、南宁、合浦、百色、隆林；有虫轻病区有融安；无虫无病区有：富川、钟山、恭城、桂林、兴安、临桂、阳朔、三江、南丹。上世纪年代后期’柑橘木虱在柳州、蒸浦等地大量发生，年后发现柑橘木虱大规模北移桂林、临桂、阳朔、恭城、富川、灵川等地。年对兴安等年普查时未发现柑橘木虱的个县进行调查，结果都有相橘木風发生，其中兴安、全州、灌阳和三江县分布广泛，龙胜、资源和天峨三县都发现了相橘木虱的三种虫态，这表明，樹橘木虱在广西的分布已到了最北地区，即广西全境都已有柑橘木虱发生【。与相橘木風发生情况基本同步’年以前，黄龙病仅在北缂°以南的蒸浦、永福等地发生，年则在更北的桂林、临屯灵川等地发现，年又在北讳°以北的兴安、全州、灌阳发现。至此，报橘黄龙病基本已分布于广西全境，桂中、桂南上世纪年代发展起来的柑橘园基本毁灭，到年代中后期黄龙病继续为害桂北地区’ I坤南人学硕士学位论文到本世纪，各级政府把重振柑橘产业提上议事日程，使病情得到一定控制。广两柑橘黄龙病及柑■橘木風发生动态如图及图广西柑橘黄龙病发生动态’—■图广西樹橘黄龙病发生动态（白色区域代表未查到相关病情）广西柏橘木发生动态■‘““■靈‘：施衅纖行图广西柑橘木发生动态 第三章中国拼橘黄龙病发生动态及蔓延原因分析台湾相橘黄龙病历史发生情况台湾地处东经。°，北讳°°之间。台湾北部为亚热带气候，南部属热带气候，年平均气温（高山除外）为°气候冬季温暖，夏季炎热，雨量充沛，适宜相橘生长。台湾省的柑橘栽培大约始于世纪初，当时闽粤沿海居民迁居台湾便将柑橘种苗引入，包括蜜柑、雪根、红柑、柚类等。年台湾的根橘栽培面积约为亩，年后面积已上升到了万亩，随后栽培面积及产量起伏波动，直到上世纪年代又呈猛增态势。上世纪年代台湾樹橘向山地发展，到年栽培面积达到万亩，成为台湾省第一大宗水果。年台湾省柑橘产业达到历史最高峰，面积万余亩，年产量万余吨。目前台湾相橘栽培已遍布全岛，栽培面积上世纪年代末达到顶峰后就开始逐步回落，见基本维持在万吨，年产量也维持在万吨左右。这期间，台湾将产业重点较多地放到了面积、产量上，忽略了品种、质量等问题，使台湾相橘业再次遭遇滑坡。相橘黄龙病在台湾称为立枯病或青果病，日本昆虫学者素木得一在年报告时提出黄龙病在台湾普遍发生，且台南相当严重，年开始，相橘黄龙病在台湾各柑橘产地开始娼獗这个时期正是台湾樹橘产业大力发展时期，所以带病苗木的传入是传播扩散的主要原因之一。年月，陈延熙先生在广州召开的黄龙病会议上指出台湾的柑橘苗木很早就是从病区普宁县宝镜院引入。目前，柑橘黄龙病及其传播介体柑橘木虱仍在台湾各柑橘产地蔓延危害。云南根橘黄龙病发生动态云南地处低玮度高原，地理位置特殊，地形地貌复杂，所以气候也很复杂，生态条件复杂多样性也造就了生物多样性，是一个巨大的生物种质资源库。云南也是柑橘起源地之一，柑橘栽培历史悠久，地方品种资源较丰富，但种植较分散，主要分布在金沙江、南盘江、元江、怒江、澜沧江流域的地热河谷。历史上，建水和宾川等县就有比较集中的产区，所栽品种主要是红梧、棰柑、甜撥。上世纪年代，峨山和富民等县从四川引进甜橙和红拮实生苗，元江从广东引进新会橙和从四川引进锦澄、挤澄，上世纪年代，富民、宾川等县从浙江、湖南和四川等省引进温州蜜柑等。云南过去大多采用实生繁殖，上世纪年代后逐步改用嫁接繁殖年月全国第一次柑桔黄龙病防治研究情况调查座谈会在广西召开，与会代表曾广权同志提出，在西双版纳已发生严重的相橘黄龙病，这是云南发生相橘黄龙病的首次报道。年，云南组织调査了宾川县、建水县、保山县、富民县、元江县、峨山县七个柑橘种植县，除在哦山县（化念农场）仅见个别植株黄化死亡外，其余六个县都有黄龙病及柑橘木虱严重为害。年，化念农场柑橘树大量黄化死亡，相橘木風危害严重，年平均年产吨左右，到年总产仅吨】。此后，年及年全国农牧渔业部两次组织专家到云南省考察，证实有黄龙病发生。 w南人学硕十学位论文年云南将组织黄龙病為：汽，共汽红河、文山、曲靖、楚雄、玉溪、丽江、临沧、保山、思茅、东川、人理、昭通个地州市，个县市共万株桥橘树（明、怒江未汽），结果如下确定了永胜、师宗、罗平、建水、石屏、个旧、舞良、东川、宾川、鹤庆、元谋、武定、元江、易门、峨山、新平、云县、风庆、永德、临沧、耿马、沧源、保山、吕十、腾冲个县有黄龙病发生，其中耿马、沧源、建水、元江、峨山，县危宙较重，其余个县均为零觅发生。从发病品种上看，绝人多数是上世纪年代以来从外、及宾川、建水地引进的外地品种，而地方品种多为实生树，耐病性相对较强，同时病区管理差，拼橘木風发生严重，主耍分布丁玉溪、人理、红河和双版纳自治州等地州（市）。云南翁相■橘黄龙病发生动态如图。云南柑橘黄龙病发生动态：，训。图云南祖橘黄龙病发生动态（白色区域代表未查到相关病情）四川根橘黄龙病发生动态四川沾、位丁南地区、长江上游，在东经°°北绅°°之间。四川气候总的特点是区域表现差异显类型多，有利丁农、林、牧综合发展。四川是拼橘的原产之一，也娃我国树橘栽培历史较早的将。树橘产业在四川果业中居各类果品之宵，年以前，四川柑橘年产全国总产的面积及产量均届全国宵位。年，重庆成立为直辖市后，使原川朱拼橘优质基地的一部分及江拼橘基地人部分从四川划出，年 第三章中国柑橘黄龙病发生动态及蔓延原因分析四川省柑橘种植面积万亩，产量万吨。四川省柑橘黄龙病是年在柑橘品种资源调查中发现的，当时初步诊断西昌、宁南和德昌发病，年展开调查，确认了西昌、宁南、德昌和攀枝花市疫情，且拼橘木虱发生严重〗。在调查时，据当地农业局一技术员介绍，在年和年縛点时就发现当时有与黄龙病症状类似的黄化植株，且情况严重。攀枝花市凉山州位于四川的西南部，部分县与云南接壤，市内最高海拔米，最低海拔米，市区海拔米。一月平均温度在°，年均温为°。金沙江下游，西昌、德昌、宁南等地沿安宁河流均属亚热带高原型季风型气候，昼夜温差大，适宜柑橘栽培。攀枝花市、凉山州年柑橘定植亩，共计万株，总产量达万公斤，而西昌、德昌、宁南、盐源、普格、金阳、仁和、米易、盐边种植面积占总面积，产量占。年和年两次调査确认了攀西地区相橘黄龙病和传病媒介柑橘木虱。年调查，发病株率为。年，四川省开展了攀西柑橘黄龙病发生和综合防除技术研究，并推广应用。年发病株率为，年为，年为年仅发现病株株，发病率低于年年间，攀枝花市、凉山州累计挖除桥橘黄龙病病树株，占应挖除病树的。此时，攀枝花市境内四季均可见到柑橘木風，可安全越冬，仁和区、盐边、米易、普格、盐源、金阳、宁南、德昌、西昌均有柑橘木風分布；黄龙病亦分布于以上个县（市、区）个乡镇，个村，个农场发病品种主要有：锦授、挤橙、黄果、红桔、温州蜜桥等。柑橘黄龙病及柑橘木虱一直在攀枝花市凉山州地区为害，当地也釆取一些防治措施使病害得到一定控制。年农业部公布的疫情分布，仅凉山州的德昌、宁南，攀枝花的盐边、仁和有病情，但年本实验室采集了盐源样品检测，结果仍有樹橘黄龙病菌。此外，通过主要农作物有害生物调查数字化系统（统计，近几年在宜宾市、达州市、资阳市的雁江区等地有见相橘木風轻微危害现象。四川省柑橘黄龙病及柑橘木虱发生动态如图及图。 两南人学硕七学位论文四川柑橘黄龙病发生动态爾至今图四川相福黄龙病发生动态（白色区域代表未查到相关病情）四川柏橘木发生动态：：：：、摩丨】舰图四川柑橘木虱发生动态（白色区域代表未查到相关虫情） 第三章中国柑橘黄龙病发生动态及蔓延原因分析江西相橘黄龙病发生动态江西省位于东经°°、北讳°°，全省气候温暖，日照充足，雨量充沛。年平均气温°左右，赣东北、赣西北和长江沿岸年均气温略低，约°滨湖、赣江中下游、抚河、袁水区域和籍西南山区约在°之间；抚州、吉安地区南部和信江中游约°赣南盆地气温最高，约为。极端最高气温南北差异不大，略呈北高南低现象，但几乎都接近或超过个别县区日最高气温曾经达°极端最低气温则南北差异较大，九江大部分地区在°之间，个别县区还曾出现日最低气温°的极端最低值；赣南则在°左右，全省其他地区一般在°之间。柑橘产业是江西省的优势主导产业，赣州已成为世界脐橙种植面积最大、年产量世界第三、全国第一的胼授主产区。年江西省柑橘种植面积有万亩，产量万吨。先后有万农村贫困人口通过种果摆脱贫困，南丰县财政收入的三分之一，农民人均纯收入的三分之二来自南丰蜜梧。果业已成为江西省农民收入增长的重要来源。据史料显示，从病区引入苗木是江西省发生柑橘黄龙病的根本原因，江西省柑橘黄龙病的发生可追溯到上世纪年代。年籍州地区园艺场、会昌、安远、南康、崇义、龙南等县先后从广东普宁、新会、揭阳、江门等黄龙病区调入温州蜜柑、甜橙苗木年普查时也查明，当时发病的品种都是直接或间接从广东、福建、广西、湖南、浙江、四川等省病区调进的苗木和接德有关。大余池江园艺场柑橘园在年就有柑橘木風为害但也未釆取任何防控措施。直至年广东农科院陈之潭先生到江西省考察相橘生产，在赣南地区不少地方发现根橘木虱，并确诊有较多的黄龙病株时才开始引起重视。年月、月及月组织调查了个县市个点，其中个县市个单位有株左右的疑似黄龙病树，除广昌外，有个县市个点有柑橘木虱分布。年调查结果如下柑橘木虱分布概况：赣州市、赣县、南康、信丰、大余、上犹、崇义、安远、龙南、全南、宁都、于都、兴国、瑞金、会昌、寻乌、石城，广昌调查三次未发现；柑橘黄龙病分布情况：赣州市、南康、信丰、大余、上犹、崇义、安远、龙南、定南、全南、宁都、瑞金、会昌、寻乌、石城、广昌，有待进一步确认的地区有籍县、于都、兴国。至年，江西省共有个拼橘种植县发生黄龙病，赣州地区一直是黄龙病发生的重病区，年调查，赣南个县市均有黄龙病分布，此时柑橘木風分布在赣州地区个县市以及吉安地区境内接近北讳°以南的吉水、永新、太和、遂川、万安一些地方。据统计，赣州年至年间新增病树株，增长倍，在分布上年有个乡镇发生，比年新增个乡镇，年冬至年处理病树株年又在赣南地区的南康、大余、信丰、安远、瑞金、于都等县个柑橘场调查，病情担忧，年至年挖毁病树余株。主栽品种脐橙、锦澄、夏澄、兴国柚树、 内南人学硕十学位论文温州蜜黄龙病株率最低，最高达。柑搞黄龙病疫甲己从南华一带越过南岭山脉向北推移。至年蒋军喜对江两占安和抚州两地「拼搞货龙病发生现状进行了田间实地调汽，根据调杏和检测结果，初步认为全部抚州地区及部分古安地区（吉安、永新、新干、峡江、安福、吉水、永丰县）尚无黄龙病发生，而吉安地区的遂川、万安、泰和等县则已发生黄龙病。江两将柑橘黄龙病及柑橘木发生动态如图及图。江西祖橘黄龙病发生动态，、十崎今：，‘‘图江西橘黄龙病发生动态（白色区域代表未查到相关病情） 第二草丨描黄龙病发生动态及蔓延段闪分析江西柏橘木发生动态着°—鬥■““至今：图江西柑橘木发生动态（白色区域代表未查到相关虫情）浙江根橘黄龙病发生动态浙江资■位丁东经°°、北讳°°之间，年平均温度在丨°左心，极端最高气温；，极端最低气温—常年温暖湿润。浙江是我国桥橘主要产区，拼橘栽培历史悠久，品种多样，是浙江将水果产业的支柱产业，也是农民增收致富的重耍途径。年浙江将桥橘生产基本稳定，种植面积万亩，产约万吨。前，浙江拼橘品种结构更趋合理，各地积极实施水果产业提升项，有效改善拼橘基地生产设施条件，深入推广无公害优质栽培技术，高品质甲熟、特早熟温州蜜柑等优质果比例增加，这使得柑橘品质整体有所提尚。浙江竹拼橘黄龙病足广东农科院陈之潭先生年冬在温州市平阳县宵次发现。近年来气候变暖使得拼橘木虱越冬边界逐年北移，黄龙病也随之扩散蔓延，这一现象在浙江非常明显。由丁有关部门及农对该病害的危害性认识不足，闪此给防控作带来极人的困难，导致病害严重发生。年林孔湘先生写到，温州柑农报告广东的蜜桥在温州地区栽培，结果二四年后树势就衰落枯黄。并且汽阅历史资料显示，温州地区柑橘引种途径是多方面多渠道的，而且冇相当多的社队农户成部门符直接从广东、广两及福建等疫区引入种苗闪此，推测浙江相橘黄龙病的发生主耍是从病区引入苗木造成。 西南大学硕士学位论文年冬，根橘黄龙病在温州市平阳县首次报道据调查，当时温州地区种植柑橘历史悠久，但发现黄龙病严重危害的历史并不长。从上世纪年代中后期陆续开始，到年代逐渐蔓延和严重起来，当地群众反映上世纪年代柑橘好种，年代不好种，年代更难。平阳县树贤公社江景大队，上世纪年代有橘园约亩，因黄龙病危害先后挖去余亩。年春秋两季对全省个地（市）个种植县进行调查，调查面积万亩，占总面积的成株万株，苗木万株。其中温州市普查面积达以上，台州地区达金华、丽水地区分别达和。调查结果如下柑橘黄龙病和柑橘木風并发区主要分布在浙南的平阳、瑞安、苍南、文成、温州近郊区瓶海、鹿城等个县个区，发病占调查面积的相橘木虱虫株率为。仅柑橘木風发生区主要分布在丽水地区的青田、云和、永嘉以南的个县个区，包括云和、青田、永嘉、瑞安、平阳、苍南、文成、泰顺、瓶海、乐清等，发生面积亩，平均虫株率为瑞安县分布最广，其次是平阳、苍南等县，而江以北的云和、青田、永嘉尚处于初发生阶段。但据此时相橘木風的发生来看，其地理分布已越过瓶江、北缘已扩展到風江以北的上游地区，在这范围内有柑橘木虱发生的地区海拔在之间，北讳“°之间，一月平均温度在°最低气温在°而青田、永嘉的西北和东北部的丽水、乐清、黄岩、温岭、玉环等橘区具有近似的地理环境和小气候条件，因此这些地区正处在黄龙病的威胁之中但此时尚未发病。年浙江省划定缻江以南的平阳等个县为柑橘黄龙病疫区。至年柑橘木風调查，浙江省有一市两地区共个县有木風分布受害面积达亩，发生普遍的有平阳、苍南、文成、瑞安、乐清、瓶海、青田，受害面积达亩，占总受害面积的局部发生的有温州市近郊、永嘉、泰顺、云和、丽水、温岭；个别地点发生的有庆元、缙云，最北分布点为北讳°历经年的防除工作，至年浙江省共挖除病树万多株，扑灭了瓶海、鹿城、文成三县区拼橘黄龙病疫情。省政府调整疫区划定界限，苍南、平阳和瑞安市飞云江以南仍为黄龙病疫区，丽；海、鹿城、文成和瑞安飞云江以北地区病株少、集中，将不再作疫区。至年，以上县（市、区）为病虫兼有区，有虫无病区有永嘉、乐清、泰顺、温岭、玉环、路桥、椒江、黄岩、临海、青田、丽水、云和、景宁、庆元、绪云等县，最北分布点为北玮。刚。年，苍南、平阳、瑞安等市（县、区）通过专家验收，达到基本扑灭标准，撤销疫区。同年，在乐清市又确诊发生相橘黄龙病，并逐步向北妒散，至年底，全省乐清、松阳、莲都、青田、温岭、黄岩、路桥、玉环、永嘉、、龙湾、云和、景宁、龙泉、庆元、椒江、仙居、临海、天台、三门、绪云、象山、宁海、永康、武义等个县（市、区）， 第二草屮摘黄龙病发生动态及蔓延应闪分析即温州市瓶江以北、台州市黄十岭以南及丽水市人部分橘区发生黄龙病。年短短年时间内，疫情发生从温州、台州、丽水等市县（市、区）个乡镇增加到县（市、个乡镇（农、材场），发生面积由亩扩人到亩，病株数从万株上升到万株。全将个名桥橘区中，已有乐清、玉环、温岭、黄岩、椒江、临海、二门、松和莲都等个主产区发生疫情，玉环文口、温岭高模、乐淸温州蜜彬等产最遭受严重损火。相橘木虱分布范已扩散至温州、丽水、台州、金华、十波、衢州等市县（市、桥橘产区，结果表明全、约柑■橘产有桥橘木風分布，从年至此，地理分布北移“。前，除杭州、衢州外，全符各主耍拼橘产区均有黄龙病发生。浙江将拼橘黄龙病及柑“橘木虱发生动态如图及图。浙江柑橘黄龙病发生动态户：！丨：仙石图浙江柑橘黄龙病发生动态（白色区域代表未查到相关病情） w南人学硕十学位论文浙江柑橘木发生动态「■胡鄉妙勸？宁肩口零图浙江柑橘木虱发生动态（白色区域代表未查到相关虫情）湖南柑橘黄龙病发生动态湖南符属南亚热带和温带气候的过渡区域，境内陵山地多，适合多种水果种植。冬季处在冬季风控制下，而东南两二面环山，向北敞开的地貌特性，有利丁冷空气的：驱直入，一月平均温度多在：之间。湖南水果产业以拼橘为主，上世纪七八十年代是湖南水果人发展时期，拼橘面积猛增，形成了树橘一树独人的屈面。“十一五”期间，湖南将先后实施了“百万亩拼洁品改程”、“拼桔新品种引进勾选育推广”和“柑洁优势区域建设”等重人项。年，湖南拼橘在种植面积万宙，产万吨，均名列全国第一。湖南拼橘黄龙病弓丨起原因可以初步确定为弓种带病苗木，湘南地区靠近’东，资料显示，湖南先后从广东汕头、将十等地流入的苗木较多。年月，中国农业科学院柑梧研究所蒋元阵先生到湖南调汽，在郴州、宜章发现黄龙病，并在郴州、临武、宜章发现了拼械木虱。调汽的地方位丁湖南南部广东交界的郴州地区个县市，约有柑橘万亩，人部分为上世纪年代建立的新果闲，主栽品种为温州蜜桥。此后，湖南将植检站开展了对黄龙病的调汽，年月调汽了个地（市）个县（市）个人队、元艺场，共万亩，山全将拼橘面积的，共杏万株，其中郴州地区所有的县市均幵展了调汽。结果如下黄龙病和木風并发区：宜章县、汝城县、桂东县、郴县、桃州市；木風发生区：嘉禾、永兴、临武、桂卩丨丨、资兴、安仁、江华、道县；仅黄龙病发生区：汝城县热水地热站（从浙江温州地引进的温州蜜拼）。 第二草机摘黄此病发生动态及曼延原闪分析年及年对拼橘木进行调汽，分别在宜章及道县有零觅发生，其余各县未见危害，究其原闪可能是因为湘南是拼橘木虱分布的弹性地带】。永州地区从年幵始发现有树橘木風为宙。年干养梅对湘南、湘中及湘」个相■橘种植县（市）进行调杏及检测，发现拼橘木虱主耍在湘南产区的宜章、永州、道县、祁卩？地为害，且在湘北的岳、华容、桃源等地检测出拼橘黄龙病菌，湘北地区发病品种均为从福建引进的祖溪蜜柚，并未发现拼橘木風危害。此外，王雪峰检测出安化、江永亦存在拼橘黄龙病菌；通过主耍农作物冇害生物调汽数字化系统（统计，禮县亦有拼橘木風轻微为害，而令人担忧的足禮县与湖北、接壤，而勾其相邻的宜吕市称归县及更往上的丹江口市近年来都有拼橘木風危害，湖北尚属无黄龙病区，因此应加强控制力度，将彬橘木風种群数试控制在阈值内。湖南符柑橘种植面积人，以上对拼橘黄龙病及桥橘木風的调齐历史仅限一部分地区，所以考虑到柑橘木風在湖南的危害特点及苗木弓进不规范等因素，湖南的拼橘黄龙病的分布范可能并不仅限丁以上地区，而柑橘木風的分布可能多数在湘南地区。湖南将拼橘黄龙病及树橘木虱发生动态如图及图。湖南柑搞黄龙病发生动态—、年止；：‘图湖南相橘黄龙病发生动态（白色区域代表未查到相关病情） w南人硕十位论文湖南柏橘木发生动态咖咖坤‘年止图湖南柑橘木发生动态（白色区域代表未查到相关虫情）贵州柑橘黄龙病发生动态贵州资位丁东经°°、北绅°°之间，地貌属丁中国两南部高原山地，平均海拔在米左右，从全将春，通常最冷月（月）平均气温多在°比同讳度其它地区高。贵州符气候温暖湿润，属亚热带湿润季风气候，立体气候明显，随复的地形变化而小气候区域众多；独特的气候及十壤条件为多种果树生长提供了条件。贵州符的拼橘生产带主耍分布在都柳江、清水江、南北盘江等低海拔河谷区，年总面积近万亩，产：万吨。年陈之潭先生在贵州符柑橘产区调杏时发现相橘黄龙病，其中罗甸为黄龙病及拼橘木虱并发区，虫口数量人，望谟、兴义、册亨二县仅发现黄龙病，未见拼橘木風，分析原闪可能由于调杏时正值霜冻随后，符植物检疫站纽织调汽，发现黄龙病在贵州发生尚属零质分布，损火尚不严童，罗甸、望漠、兴义、‘汽安、安龙、册亨、贞丰、关岭、镇十等县市）有黄龙病的分布，其中罗甸、望谟、兴义县（市）为黄龙病与拼橘木虱的并发区上世纪年代后，贵州将相橘生产发展较快，先后引进拼搞新品种（系）多个。但由己发生的彬橘黄龙病未得到有效控制，拼橘木風在贵州的危害扩散，加上引进的种苗脱毒苗比重少，苗木流通不规范。闪此，在上世纪卯年代中后期，乂对贵州竹个县（市）桥橘黄龙病进行调汽，结果表明主耍有个拼橘品种感病，主耍分布在北盘江、南盘江及其支 第二草摘黄龙病发生动态及曼延原闪分析流，卜游的红水谷地带，齡东南州的都柳江流域，调汽结果表明黄龙病的危害己基本覆盖了贵州贫土耍的拼橘生产带。发生拼橘黄龙病的县市个，较年代的报道新增个，包括紫云、格江、从江；拼橘黄龙病及彬橘木虱并发区新增个，包括册亨、贞丰、关岭、镇十、安龙、格江、从江、贵州将拼橘黄龙病及拼橘木風发生动态如图及图。贵州柑橘黄龙病发生动态广、至今：‘图贵州柑橘黄龙病发生动态（白色区域代表未查到相关病情） w南人学硕十学位论文贵州柑橘木虱发生动态十一；咖丨丨至今图贵州橘木发生动态（白色区域代表未查到相关虫情）海南柑橘黄龙病历史发生情况海南竹位丁东经°北讳°°’。海南岛地处热带北缘，属热带季风气候，年平均气温°，最冷的月平均。海南柑橘种植历史悠久，年海南相■橘种植面积万亩，产万吨。由丁年以前海南属丁广东符管辖，后设立为海南竹，所以一直有从广东调运苗木种植，据资料记载，到上世纪年代中期，桥橘黄龙病就已在海南广泛蔓延。前，海南将仍有拼橘黄龙病及树橘木風的危害，主耍分布在琼中及燈迈巧地。中国柑橘黄龙病不同时期发生动态综合以上对中国拼橘黄龙病各发病区（包括广东、福建、广两、台湾、云南、四川、江两、浙江、湖南、贵州、海南）的病情发展蔓延历史的整理分析，绘制了中国彬橘黄龙病在不同年代的流行民域图，如图。从图中可以看出，桥橘黄龙病上世纪年代以前在广东、福建、广内、台湾已齊遍发生，在四川攀两地区、江赣南地及云南部分地区也已开始为宙；到上世纪年代中期，该病已在广东（含海南）、福建、广两、台湾、云南广泛蔓延，并在浙江、湖南、贵州相继发生；本世纪以来，黄龙病向北扩散的态势仍在继续，特别表现在浙江、江两及湖南橘区。 第二草丨搞黄此病发生动态及兹延原闪分析不同年代中国柑橘黄龙病流行区、■年—年代一■署代—一」■■年代年代年代世纪—：年代图不同年代中国根橘黄龙病流行区（不完全统计〉相橘黄龙病扩散原因讨论本章通过对历史文献及官方信息的梳理分析，基本明确中国各病区黄龙病病情发生、发展情况。按病害引起原因的不同，在此粗略地将各发病区分为两类，一类是由于苗木调运引起病害发生的病区，包括：福建、台湾、海南、江两、湖南、浙江；二类娃本身就可能为病害起源中心的病区，包括：广东、云南、四川。拼橘黄龙病病区各佑、宵次报道地点如图。对一类地区苗木引种的历史上文已存介绍，在此不再赘述。下面对可能为病害起源中心的地作一一解释。广东是拼橘种植人将，栽培历史悠久，广东的苗木一直以来都运销全国各人拼橘种植区，由丁苗木检疫的不规范，造成黄龙病的广泛蔓延，并且广东也是中国最早报道发病的地区，所以广东是中国相橘黄龙病的起源中心之一，这是公认的》云南拼橘黄龙病足年在两双版纳开始报道，但据资料显示，年？？勉教授就提出云南南部地区可能有黄龙病发生闪此推测黄龙病在云南的发病时间可以追溯到更远年代。云南先前也是一直采实生繁殖的方式，苗木多来符内，外符调运的苗木主要来自当时的非病区四川，从广东等病区调运苗木的记录较少。四川拼橘黄龙病足年在攀两地区开始报道，但据十南农业一技术员谈到，年和年就发现存与黄龙病症状类似的黄化植株，所以四川黄龙病的发病时间亦可迫溯。四川上世纪年代以前也是利用地种子实生繁殖，也有从云南引进过苗木，从病区引苗的记录较少。一直以来，四川发病的地区都是在靠近云南的攀两高海拔地区，生态条件与云南亦有类似。后文（见第四、五章）中还对拼橘黄龙病菌云南及四川种群进行了多态性评估，结果显示云南种群多态性丰富，勾广东等地 内南人学硕十学位论文种群显不同，四川种群也存在丰富的多态性。此，综合上述原因，本文人胞提出云南与四川亦可能为中国桥橘黄龙病发病中心的论点。值得一提的广两也是黄龙病老病区，对广两黄龙病发生历史的估计也足一直探讨的话题。广两与广东相邻，先后冇多个地从广丨病丨引入苗木，造成病害在这些地区蔓延。柳州市问艺场的黄龙病一宵被认为足由年广」潮汕的技术员携带去的接穗传入的，但当时广两农科院的同志提出，在那些技术员去之前就己断定柳州市元艺场己有黄龙病发生。此夕卜，资料发现，有些重山阻隔且完全是本地品种实生繁殖的彬橘栽培地区，如广两内北部地区的隆林、平果，东南部的界县，两南部的十明等地也没有从病区引进苗木，结合黄龙病在广两发生历史的估计来分析，有可能是：在广两这些地区有适宜拼橘柑橘木風的生境，使得黄龙病得到扩散蔓延。贵州是上世纪年代初期在靠近广两的龄东南地区发现黄龙病，并且发病时拼橘木風危害严重。这一时期广两拼橘木虱蔓延迅速，所以很有可能是广两的拼橘木風扩散到贵州东南部使病害得以传播。此外，据资料显示，贵州将农学院郭振中教授杏谈到年在赤水见过桥橘木風，而四川的黄龙病及拼橘木風发现时间早于贵州，当时四川南部拼橘木風危害亦非常严重，若四川有充分的虫源，远距离扩散并跨越赤水一带至贵州的可能性也是存在的。网此推测贵州黄龙病的发生主要是由丁桥橘木的扩散引起。收—纳■■上世年代流行区；，《科流行；无瓶图柑橘黄龙病病区各省首发点蓝色箭头指向文献记载有从广东引进苗木的地区） 第四章基于两个唆菌体相关位点的黄龙病菌种群分化研究第四章基于两个睡菌体相关位点的黄龙病菌种群分化研究对柑橘黄龙病菌种群分化研究先前主要集中在’、内部转录间隔区【。、基因“等区域，但未发现存在显著的分化情况。自年‘’株系全基因组序列测定完成后〗⑶，对病原菌遗传多态性研究起到了重要的推动作用，当前的研究热点主要集中在原睡菌体区域和串联重复位点。本研究以来自中国个省（自治区）的份黄龙病阳性样品为研究对象，采用已报道的具有遗传多态性特征的两个睡菌体相关位点具体对病原菌种群分化进行研究。材料与方法供试材料本研究中从中国个省（自治区）收集有黄龙病症状的叶片样品，每个样品取自于一株根橘树，假定其代表一个株系。样品中的大部分由本课题组调查采样获得，少量样品由现代柑橘产业技术体系综合试验站或各地楦保植检系统工作人员采集后快递至中国农业科学院桥梧研究所国家樹橘苗木脱毒中心，所有样品°保存备用。主要试剂（盒）与仪器主要试剂（盒：四甲基乙二胺二钠盐（上海生工）三经甲基氨基甲烧（产品）玻璃珠（标准分子量（、鼎国）酶和相关试剂（、感受态细胞（溴化乙键（漠氯』引噪半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷氨节青霉素（琼脂糖（、鼎国） 西南大学硕士学位论文本章研究所用引物分别由上海生工生物工程有限公司合成。主要仪器：电泳系统（水平电泳槽（凝胶成像仪（台式冷冻离心机高通量台式离心机（生物安全柜（恒温水浴锅（纯水系统（高压灭菌锅（，中国贵阳）制冰机（旋转振荡器（，电子天平（磁力搅拌器（，移液枪系列（超净工作台（安泰公司，中国江苏）常用储备液及培养基配制；称量用二甲基甲醜胺定容至滤膜过滤，分装为份后避光保存于冰箱；：称量用灭菌水定容至，用滤膜过滤，分装为份后避光保存于冰箱；氧节青番素：称量氧节青霄素，用灭菌水定容至后，分装为份后保存于冰箱；缓冲液：，用水定容至，高温灭菌后保存；缓冲液：用水定容至高温灭菌后保存；饱和粉：固体酌在°中溶解于的中，并用将调整到以上，用定容到，加入经基喹啉，°避光保存；上样染料：溴酌蓝，二甲苯蓝，甘油， 第四章基于两个唆菌体相关位点的黄龙病菌种群分化研究无菌超纯水；：称取〗漠化乙徒，用灭菌水定容至，充分混合均勾，转移至棕色瓶中，室温避光保存；缓冲液：硼酸，用超纯水定容至，保存备用；琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，混合于电泳缓冲液中，置于微波炉中煮沸后’倒入制胶工具中；液体培养基：称取加入去离子水定容至高压灭菌后于°保存；固体培养基：称取加入去离子水定容至，高压灭菌后于；保存。总核酸提取所有样品按照和两种方法提取。微量快速抽提法按周常勇等的方法提取总核酸，具体操作步骤如下称取植株皮或叶装入无菌离心管中，用研棒在液氮中研磨；依次加入缓冲液、饱和紛：氯仿：异戊醇（混勾，°中水浴，离心在管底用加热的针头开一个小孔，用少许浸入缓冲液的玻璃珠覆盖小孔，再加入平衡好的将其置入离心管，离心即微柱制备完成；取经第（步离心的上清液加入由制成的微柱中，离心，收集的液体即为核酸抽提液，保存。法利用法提取柑橘叶脉基因组，提取方法参照和方法并加以改进，具体操作如下：在离心管中依次加入、广巯基乙醇、止（体积、，°水浴备用；称取叶脉，置于研钵内，液氮充分研磨成细粉，用药勺迅速将粉末转入上述水浴离心管中，盖严后迅速摇勻；于°水浴中途每隔轻轻颠倒混匀一次；离心，用去尖的枪头吸取上清，加入等体积酹：氯仿：异戊醇（ 西南大学硕士学位论文：，轻轻颠倒混勾使使呈乳池状，静置，再混勾一次，静置，°离心；用去尖的枪头吸取上清至新的离心管中，加入等体积氣仿异戊醇（轻轻颠倒混勾，静置分层，再混勻一次，静置，°离心取上清，加入体积、倍体积异丙醇，混勾，出现絮状沉淀，室温竖直静置待沉淀沉至管底；室温离心弃上清，用乙醇颠倒洗绦沉淀，使沉淀悬浮，室温离心收集沉淀，重复洗漆次，室温下风干；用溶解，用手指轻弹离心管使沉淀充分悬浮，分装成两管，°保存备用。引物利用引物对提取的样品进行扩增，共获得阳性样品份，对其做进一步分析。按照已报道的方法，选择引物组及扩增中国黄龙病病原菌种群。所用引物信息见表表用于种群分化研究的引物引物名称引物序列（、上游下游〉基因组位点，，）王雪峰【“王雪峰反应病原菌检测体系应用反应体系对所有样品进行扩增，反应体系如下：试剂体积聚合酶上游引物下游引物 第四章基于两个睡菌体相关位点的黄龙病菌种群分化研究超纯水反应条件为°预变性然后：变性°退火，°延伸循环次，最后°延伸。所有反应均在仪上进行。取产物在琼脂糖凝胶中电泳，经染色后，使用凝胶成像系统观察结果。病原菌特征位点反应体系应用反应体系对所有阳性样品进行扩增，反应体系如下：试剂体积聚合酶上游引物下游引物模板超纯水反应条件为：°预变性，然后°变性，°退火，°延伸，循环次，最后°延伸。所有反应均在仪上进行。取产物在琼脂糖凝胶中电泳，经染色后，使用凝胶成像系统观察结果。产物纯化、克隆与測序产物纯化、回收釆用对产物进行纯化、回收，具体如下：取离心管，在管壁上进行标记后，称其重量，将含目的条带胶带切下，放入离心管，再次称重，求得琼脂糖凝胶的重量；按比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入提取缓冲液，恒温水浴，每颠倒混匀一次，直至凝胶融化；将混合液全部转入离心柱内，离心，弃去接液管内液体；向内加离心，并弃去接液管内液体；向内加离心弃去接液管内液体；重复第步；再次离心将转移到无菌的离心管； 西南大学硕士学位论文向加双蒸水，室温下静置，再次离心，离心管内液体即为回收的溶液，置于储存备用。产物与载体连接用公司）将回收的产物直接与载体连接，连接体系如下：回收产物含连接酶）反应体系轻轻混勾后°过夜。重组载体转化大肠杆菌连接产物稍许离心，取连接反应产物加到置于冰上的离心管中；取出感受态细胞，放置在冰水浴中直至融化，轻轻振动离心管使之混勾；在准备的每个转化管中加入感受态细胞；轻轻振动小管混勾，冰水浴在°水浴中热击迅速冰水浴向转化细胞中加平衡至室温的液体培养基，在°摇床中复苏培养；室温离心，倒去上清液，余下上清重悬菌体，将重悬菌体涂到、加入到预先加入了氨节的固体培养平板上，将平板于：倒置过夜培养，至蓝、白斑区分明显为止。重组质粒转化子检測及测序菌落平均直径左右时，取出平板正置于°使蓝白斑清晰；用火焰灭菌的镊子夹取灭菌枪头挑取白色单克隆菌斑涂抹至管底，再接种至培养基按液体培养基加配制终浓度为的液体培养基，°振荡培养选菌落也可进行菌液阳性样品个送华大基因进行双向测序（每管取菌液，剩余菌液加灭菌甘油使其终浓度为，保存。序列分析用查看所有测序结果，用进行多序列比对分析，适当进行手工调整。利用分子进化遗传分析软件进行系统演化分析，演化分析采用邻近法（做验证（重复次）的系统进化树。结果与分析祖橘黄龙病疑似样品中朝皮部杆菌检測从广西、广东、江西、福建、云南等个省（自治区）收集到的黄龙病疑似样品中，利用引物对所有样品进行检测，结果表明有份样品感染了黄龙病（图， 第四章基于两个啦歯体相关位点的黄龙病菌种群分化研究表。图引物丨丨检测结果表黄龙病阳性样品来源、采样点海拔及寄主品种统计表‘来源纖驻艘种：云南文山丨丨温州蜜析栊馆溪蜜杣建水碰柑温州蜜村贵州册亨甜橙栊柑四川西昌碰柑盐源甜禮德昌甜检宁南肪橙雷波挤检广西鹿寨甜检栊相南丰蜜梧燕浦甜橙甜橙桂林贡柑恭城甜橙 西南大学硕士学位论文栊柑平乐温州蜜柑温州蜜柑阳朔甜橙砂糖橘广东佛闪砂糖橘清远砂糖橘四会贡相砂糖橘高要砂糖橘贡相潮州梓檬福建厦门璃溪蜜柚福州璃溪蜜柚永春戸柑长泰岩溪晚戶江西全南温州蜜相定南温州蜜柑龙南挤橙信丰挤澄綠州脐澄浙江黄岩温州蜜相临海温州蜜柑共计基于两个噬菌体相关蛋白位点的中国种群分析利用引物对中国个柑橘黄龙病阳性样品进行扩增，结果表明云南、贵州和四川的大部分样品、广西的少部分样品均有扩增条带，而广东、福建、江西、浙江、广西的大部分样品检测率均为图，表。利用引物对同样个靭皮部杆菌阳性样品进行扩增结果显示云南、贵州和四川样品检测率从而其它省份检测率为图，表。 第四章基丁两个唆歯体相关位点的黄龙病种群分化研究—―图引物的扩增结果广东样品；福建样江西样见；广西样品；云南样品；贵州样品；四川样品；水对照标准分子；；；；；；；——图引物〗扩增结果南样品；广东样品；福建样品；广西样品；江西样品；■丨四川样品；浙江样品；水对照；标准分子量）；；表两个噬菌体相关位点在中国样品中的检测统计表检测来源样品数均有条带均无条带总计云南贵州 西南大学硕士学位论文四川广西广东福建江西浙江注：括号内数字代表检测百分率。办扩増位点序列分析根据引物￡扩增结果，分别选择云南（、、贵州（、四川（、广西（阳性样品各个进行克隆测序，所有样品送至少个克隆子进行测序，测序结果与株系及进行比对（图。序列分析结果表明云南株系（、四川株系（与其它株系在该位点上存在很大差异。其中云南株系（相对于其他株系缺失了个核苦酸，即使与来源相同的云南株系（也存在这样的结果，此外还存在个，位于与两个位点之间的非编码区；而四川株系（相对于其他株系不仅存在个，还插入了一段串联重复序列。运用中方法绘制系统发育进化树，分析结果亦显示云南株系（与四川株系（分别独立为一簇，且两云南株系亦分别在各自簇上，表明云南株系、四川株系与其它株系间有较大差异，且云南株系内部亦有差异（图。 第四章基丁两个哩歯体相关位点的黄龙病菌种群分化研究图个中国株系在扩增位点上的序列变异 w南人学硕士学位论文图不同株系在位点的系统发育树扩增位点序列分析根据引物的扩增结果，分别选抒云南（、浙江、广东（、江西（、福建、广‘内—性样品各个进行克隆测序，所有样品均送至少个克隆子进行测序，测序结果与株系、及进行比对。序列分析结果显示，株系与各株系存在多个，差异显著；各地样品勾、之间亦存在多个，且冇一处缺失及多处序列描入；各地样品之间在该位点上序列无差异（图运用中方法绘制系统发育进化树，分析结果亦显示株系独立一簇，各地样品聚为一族，与及距离较近，比对结果同源性为比对结果同源性为图。 第四章基丁两个啦歯体相关位点的黄龙病种群分化研究……』………图个中国株系在扩增位点序列变异 西南大学硕士学位论文图不同株系在位点的系统发育树讨论本章运用基因组上个位点、对中国个省（自治区）黄龙病菌进行种群分化研究，结果表明中国高海拔和低海拔地区的‘种群在这两个基因组位点上扩增频率明显不同，此结果与王雪峰的结果是相符的，因此，可以得出中国‘’种群内部存在分化的结论。同时各省份种群内部亦存在扩增结果差异，同一来源的样品有的能够获得扩增条带，有的却不能；云南的两个样品在位点上都有扩增条带，但序列存在差异；四川样品在系统发育树上显示与其它样品差异较大；此外共有个样品（贵州个、广西个）在这两个位点上均能获得条带见表，由于贵州样品基数过小，故需增加样品量并做进一步研究分析。以上结果表明各省份黄龙病菌种群内部在这两个位点上存在差异。等报道了在佛罗里达株系中存在两种环状噬菌体及，经过序列比对及进化树分析得知，本章研究的两个位点及分别与及存在很大的同源性。因此，初步推测来源于云、贵、川等高海拔地区的株系主要包含相关的嗟菌体或原哩菌体，而低海拔地区‘’株系则可能主要存在相关的隨菌体或原隨菌体。对于不能获得目的条带的样品，在此结合王雪峰对这两个位点侧翼序列进行扩增的结果进行解释。对侧翼位点设计引物扩增结果显示，云南样品多产生两条带，而广东样品仅能扩出云南样品两条带中较小的一条带，推测云南株系可能在染色体（或外染色体）上存在两个扩增位点，或者多个’株系共存；对侧翼位点设计引物扩增结果发现，云南株系又能获得扩增条带。以上结果说明云南株系在原唾菌体区域与广东株系间存在明显差异。此外，等】利用原噻菌体末端酶基因对云南和广东的病原菌多态性进行评估，也表明这两个不同地理来源的病菌种群在该基因上的检测频率显著不同。在今后的工作中，可以利用更多基因位点对更广泛地理来源的病原菌进行分析，以 第四章基于两个菌体相关位点的黄龙病菌种群分化研究及获得病原菌中睡菌体全基因组序列并进行比较基因组学分析，将有助于进一步解析中国黄龙病菌种群分化。 第五章一个假定唆菌体转移酶基因的变异及流行学意义研究第五章一个假定睡菌体转移酶基因的变异及流行学意义研究原睡菌体（基因序列也常被用于细菌基因组多态性研究，其往往在细菌水平基因转移、致病性、环境适应及株系间遗传变异上充当重要角色。等对东南亚各国黄龙病亚洲种嗟菌体型聚合酶基因遗传多态性分析的结果表明，东南亚的‘株系分为三簇，所有印度尼西亚株系聚为一簇，而其它两簇与地理起源不相关，包括越南、泰国、台湾和日本。等【利用原唾菌体末端酶基因对云南和广东的病原菌多态性进行评估，表明这两个不同地理来源的病菌种群在该基因上的检测频率显著不同。本章运用基因组上已报道的一个假定啦菌体转移酶基因位点对来自中国个省（自治区）的份柑橘黄龙病阳性样品进行研究，在这个位点上不同种群产生不同的电泳扩增类型，序列分析显示在非编码区内序列的插入和缺失是导致变异的主要原因。本章还讨论了这个基因组位点在中国‘’种群分化研究上的流行学意义。材料与方法供试材料参见第章主要试剂（盒）与仪器参见第章。常用储备液及培养基配置参见第章。总核酸提取参见第章。引物利用引物对提取的样品进行检测结果参见第章，得到份黄龙病阳性样品用做进一步分析。按照报道的方法，选择引物组扩增中国黄龙病病原菌种群。所用引物信息见表。表用于种群多态性位点研究的引物引物名称引物序列（，）（上游下游基因组位点，）一王雪峰一 西南大学硕士学位论文病原菌特征位点反应体系应用反应体系对所有阳性样品进行扩增，反应体系如下：试剂体积；聚合酸上游引物下游引物模板超纯水反应条件为：°预变性，然后°变性°退火，延伸，循环次，最后°延伸所有反应均在仪上进行。取产物在琼脂糖凝胶中电泳经染色后使用凝胶成像系统观察结果。产物纯化、克隆与測序参见第章。序列分析用查看所有测序结果，用进行多序列比对分析，适当进行手工调整。结果与分析中国株系扩增产物多态性利用引物扩增个中国样品，结果显示不同种群和株系间出现明显的电泳图谱多态性。参照王雪峰的分析方法，将电泳类型称为。在本章所用样品的结果中，共出现与王雪峰结果中相符的种，分别由种扩增子（、组成（图。其中最多的有种，包括、主要分布在云南、四川的样品中；广西、福建的小部分样品亦有与云南、四川类似的电泳类型，其余的大部分样品与广东、浙江、江西样品相同，均只有贵州样品出现了种类型，由于样品基数过小，需分析更多样品进而做出科学评价。此外，江西有一样品出现先前未报道过的另一扩增子，在此称其为，称其电泳类型为表序列特征在后文进行分析。 第五章一个假定菌体转移酶基因的变异及流行学意义研究图引物扩增子电泳图谱表中国种群样品的电泳类型（分布来源无条带样品数云南贵州四川广西广东福建江西浙江总计注：括号内数字代表检测百分率。扩増子序列分析在本章所出现的种中共有种扩增子类型（、、，序列大小分别为、和。结果表明在株系基因组中仅存在扩增子，相似性为。对种扩增子进行序列比对，从差异区域图（图中可以看出差异主要由序列的插入和缺失引起。同样采用王雪峰等的分析方法，用框架图来表达种扩增子的差异（图。和的差异在于在的核酸位置插入了的片段，而则只插入了与同是源于江西的样品产生的扩增子在核哲酸位置缺失了。 两南人学硕学位论文？￡—图彳广增子（、、间序列比对卜■■：；■■丄：—图扩増子（、、的序列变异第一行为参照基因组位点序列，核苷酸插入位置标注在参照基因组位点上）、、讨论本章应用引物对扩增中国个黄龙病卩丨丨性样品，结果产生了种大小不同的扩增子（、、序列分析表明所有扩增子享有同一序列骨架且差异是由在非编码区内序列的插入和缺失所致。根据已报道的结果中国样品共产生种扩增本研究中的、与其相符，其他类型的扩增子？、及在本章所研究的样品中尚未发现，而这种扩增子的检测频率乂极低，故需加大样品进行分析后再作出科 第五章一个假定睡菌体转移基因的变异及流行学意义研究学评价。本研究中还出现了一种扩增子序列分析表明与同样来源于江西的样品产生的扩增子相比缺失了个核苦酸。将这个基因组区域称为嵌合基因组位点（在这个位点上，和仅产生一种扩增子，而产生两种，由此可以推测产生和的样品内只存在一种‘’株系；而产生的样品在染色体（或外染色体）上可能存在个扩增位点，亦可解释为可能有两种‘株系共存。而仅高海拔地区可以产生，因此，高海拔地区样品内株系情况较低海拔地区更为复杂。本章涉及的基因组位点推断的睡菌体转移酶）属于报道的韧皮部杆菌睡菌体的一部分，与其相似性为。有出现的及主要分布在云南、四川的样品中，广西、福建仅占极少数，而无出现的主要分布在广东、浙江、江西及福建、广西的绝大多数的样品中，这表明高海拔地区种群较低海拔地区种群有更大的原嗟菌体活性及基因组可塑性。 第六章主要结论、创新点及研究展望第六章主要结论、创新点及研究展望主要结论明确了中国相橘黄龙病各发病区病害发生动态及扩散原因通过广泛、系统地收集整理分析中国柑橘黄龙病从发生至今的病情报道、科研动态等历史文献资料，基本明确黄龙病在中国各病区的发生发展动态。同时根据各病区病害发展史，将病区大致分为两种类型，一类是由于苗木调运引起病害发生的病区，另一类是本身就可能为病害起源中心的病区，并对这一分类的依据进行了阐释，提出了中国可能不止一个柑橘黄龙病起源中心的论点。利用两个睡菌体相关位点评估了中国‘种群分化运用了两个已报道的睡菌体相关位点（、对来自中国个黄龙病病区的‘种群分化进行了评估。通过分析这两个位点的常规扩增结果，表明中国种群内高海拔地区（云南、四川）与低海拔地区‘’扩增频率明显不同，序列比对及构建进化树后得知，分别与和的存在相关，中国‘’已存在明显种群分化。分析两个位点扩增结果还发现，各病区种群内部亦存在扩增结果多态性，结合序列分析及前人研究结果，得出高海拔地区‘’株系存在高度的多样性与特殊性。研究了一个假定睡菌体转移酶基因的变异并分析了其流行学意义运用已报道的一个原暖菌体区域高度嵌合位点推断的噬菌体转移酶）研究了来自中国八个黄龙病病区的‘’的种群特性。特异引物扩增结果显示，样品共产生种大小不同的扩增子（、、序列分析表明所有扩增子享有同一序列骨架，且差异是由于在非编码区内序列的插入和缺失所致。序列比对及扩增电泳类型分布分析表明，云南、四川等高海拔地区种群较广东等低海拔地区种群有更大的原礎菌体活性及基因组可塑性。创新点柑橘黄龙病在中国具有长达一个世纪的发生史，本研究利用搜集的文献资料，首次对中国黄龙病各病区病害发生发展动态进行了梳理，并分析了引起各地病害发生的可能原因，提出了中国可能不止一个柑橘黄龙病起源中心的假说。此外，利用具有种群多态性的个紀标基因位点对中国不同来源的样品进行了种群分化验证，为该病“多中心起源”假说提供了分子依据。 西南大学硕士学位论文研究展望研究柑橘黄龙病已有多年历史，主要集中在病原性质的探索、病害的诊断方法、田间流行规律及防控措施等方面。随着对病害危害性的重视和研究手段的不断提高，人们对该病害的起源、病原不同种群特点、病害田间流行规律及由此获得的防控经验等都有了新的认识。但柑橘黄龙病病原菌的分离培养一直是该病研究的瓶颈，因此，目前仍对其病原菌生理生化特性知之甚少，这使得有效药剂的筛选工作进展缓慢。然而，随着针对柑橘黄龙病各项研究的不断深入，定会为病害的防控提供更多途径。如致力于定量流行病学研究，确定虫媒控制与砍除病树分别对延缓病害蔓延的贡献率；研究病原媒介寄主的相互关系，寻找新的防治策略；借助现代分子生物学技术，研究病原遗传变异，为病害的起源及流行发展提供线索及依据；研究病原致病机理并寻找抗耐黄龙病基因，开展相关抗病育种研究，可能为治理黄龙病问题找到新方法。本论文重点对中国黄龙病各病区病害发生发展动态进行了梳理分析，同时在个已报道的具有种群多态性的基因组位点上进行了种群分化验证，从而从宏观及微观水平对中国柑橘黄龙病的起源及流行进行了探索。在今后的工作中，有待于对柑橘黄龙病及媒介昆虫柑橘木虱的发生动态进一步完善，并对柑橘木虱的适生区进行分析，同时解析中国典型株系中哩菌体的基因组序列，进而进行比较基因组学分析，明确不同地理来源样品中哩菌体类型及其多态性，进一步筛选分子标记，系统评估中国‘’的遗传多态性及种群分化，有望为中国柑橘黄龙病的起源及流行提供更为充分的依据。 参考文献参考文献，，，林孔瓶根梧黄梢黄龙病研究关于病原的探讨植物病理学报，，，，，，，，，，，，，，也，由，，，， 西南大学硕士学位论文柯冲，陈辉，林先沾相橘黄龙病研究工作小结福建果树，，吴世盘，李剑书根橘黄龙病和斑黄病病原体的初步观察中国农业科学，，范国成，刘波，吴如健等中国柑橘黄龙病研究年福建农业学报，也，，，，，，，，，，丁，，，，°邱柱石，唐明丽用“红鼻果”诊断黄龙病树好—三谈柑梧黄龙病树田间诊断广西园艺，，， 参考文献吴世盘，章潜才柑橘黄龙病叶的细胞病变观察电子显微学报，柯冲，柯穗，李开本柑桔黄龙病病原形态与性质的研究福建农业学报张天淼相橘病毒病北京：中国农业科学出版社，庄胜慨，蔡明段杨村柑桔黄龙病与管理体制中国南方果树，周启明，邱柱石，全金城广西根橘黄龙病发生动态及分析中国相橘，广西壮族自治区农业厅柑棺黄龙病防治领导小组办公室广西相梧黄龙病防控工作资料汇编（内部资料，赵学源重温广东华侨柑橘场遏制黄龙病大发生经验的现实意义中国南方果树，，赵学源，宋震第二届相橘黄龙病和亚洲相橘木風国际研讨会简况中国南方果树，；何畏冷广东果树病害之三岭南学报，，润菲尔格关于广东果树园艺工作的意见内部资料，陈其爆潮柑黄龙病研究报告新农季刊，陈延熙，梅汝鸿柑橘黄龙病毒研究初报植物保护学报林孔湘对柑橘黄梢（黄龙病）病究竟要不要检疫？（初稿）与陈延熙教授商榷内部资料，赵学源，蒋元晖，邱柱石，等相橘黄龙病嫁接传播方法的初步研究植物病理学报，，，，丨，，，，，，，， 西南大学硕士学位论文，广西根梧黄龙病研究小组利用四环素、土霄素治疗相橘黄龙病的效果（初报）柑橘科技通讯，，（广西柑結黄龙病研究小组桥橘黄龙病病原及防治的初步研究中国农业科学，，柯冲，林先沾，陈辉，等樹梧黄龙病与类立克次体及线状病毒的研究初报科学通报，，（谷，，，，，，，由，，，，，谷，，，，，，，，， 参考文献，，碎，，，，谷，，赵鸿燕，周咏芝，梁培华，等柑橘黄龙病病原类细菌的分离培养浙江相■橘，，胡勤学，周咏芝，丁达明长春花组织培养柑橘黄龙病病原类细菌的初步研究浙江柑橘，，，，‘，，，、，，孔维文，邓晓玲，梁志慧，等柑梧黄龙病病原片段的克隆及序列分析植物病理学报，，’廖晓兰，朱水芳，赵文军，等柑梧黄龙病病原克隆、测序及实时焚光检测方法的建立农业生物技术学报，，刘利华，姚锦爱，种藏文，等柑梧黄龙病亚洲种病原的分析福建农业学报，，单振菊，郭恒，冯震，等沙田柚黄龙病病原峰纵子片段的克隆与序列分析仲惜农业技术学院学报，，冯震，单振菊，周根，等沙田柚黄龙病病原片段的克隆与序列分析广西农业生物科学，，，， 西南大学硕士学位论文，彭军，刘元，黄俊生海南柑桔黄龙病病原片段序列分析中国南方果树，，丁芳，洪霓，钟云，等中国柑橘黄龙病病原序列研究园艺学报，张利平，陈国庆，王海琴等浙江柑橘黄龙病病原务操纵子核糖体蛋白基因的检测及其序列比对植物保护，，廖慧红，白先进，李杨瑞，等基于序列的柑橘黄龙病病原菌亚洲种系统发育研究生物技术通报，，胡文召中国柑橘黄龙病病原及分化研究重庆：西南大学，，，，，单振菊，冯震，周根，等南方省区柑橘黄龙病病原片段的克隆与序列分析华南农业大学学报，，，，，，，王雪峰基于基因组多位点比对的柑橘黄龙病病原菌遗传多态性及种群分化研究重庆：西南大学田亚南，柯穗，柯冲柑橘黄龙病诊断法的研究进展福建农业学报，，吴世盘柑橘黄龙病的直接荧光诊断法华南农业大学学报，，林尤剑，高日霞应用染色法观察柑橘黄龙病病株中的病原难培养细菌福建农业学院学报， 参考文献柯穗，唐伟文，高乔婉柑橘黄龙病病原物提纯方法和血清学的初步研究华南农业大学学报，，，，，李德望，唐伟文，范怀忠柑橘黄龙病的血清学检测与方法的初步研究华南农业大学学报，，，陈肇春，李德葆柑橘黄龙病（快速诊断方法的初步研究浙江大学学报（农业与生命科学版），，吉前华，郭雁君，梁广坚，等德庆贡柑果实品质相关的同工酶分析四川农业大学学报，，，，，，，，，，，，，，，，，，，， 西南大学硕士学位论文，，，，，，，，，，丁芳，王国平，易干军，等不同引物对检测柑橘黄龙病菌灵敏度比较植物保护学报，，，李韬，柯冲应用技术检测柑橘木虱及其寄主九里香的柑橘黄龙病带菌率植物保护学报，丁芳，易干军，王国平应用及技术检测柑橘黄龙病病原研究园艺学报，胡浩，殷幼平，张利平，等柑橘黄龙病的常规及荧光定量检测中国农业科学，，，，，，，，，，， 参考文献，邹敏，宋震，唐科志等柑橘黄龙病病原微量提取方法比较植物检疫，，丁芳，曹庆，王国平，等坩橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重检测园艺学报，，肖远辉，丁芳，曾继吾等柑橘黄龙病和衰退病的同步和检测果树学报，，王芝生，柯冲柑桔黄龙病的多芽枝段传病试验及病状类型观察初报福建农业学报，赵学源，蒋元晖，丘柱石，等柑桔黄龙病嫁接传播方法的初步研究植物病理学报，，柯冲，吴如健，李开本等柑橘种子、木质部传播黄龙病病原可能性的探研福建农业学报，，娄兵海中国八省柑桔黄龙病病原菌种类和种类分化的初步研究重庆西南大学，许长藩，夏雨华，李幵本，等柑橘黄龙病的病原在木虱体内循回期的研究植物病理学报，，，，，，洪士程柑桔木虱传播黄龙病之生态研究台湾：台湾大学， 西南大学硕士学位论文，，谢钟琛，李健，施清，等福建省柑橘黄龙病危害及其流行规律研究中国农业科学，，黄亮广西柑橘类之病害广西农业，林孔湘闽籍柑拮病害调查报告岭南大学柑拮研究专刊，农业部植物保护局中国农作物主要病虫害及其防治内部资料，柯冲柑桔黄龙病（未发表）内部资料潮汕柑橘试验站潮汕柑橘黄龙病调查材料内部资料，农业部农业局、植保总站、农科院柑桔所广东、福建省柑梧黄龙病调查报告内部资料’广东省植物检疫站广东省柑桔黄龙病防控工作总结内部资料，林孔湘柑桔黄梢病在福州地区的发生和发展（摘要）内部资料，黄邦侃柑橘木虱的初步观察内部资料柑橘黄龙病资料汇编（内部资料，福建省农业科学试验站果树所我省柑桔黄龙病的发生近况和有关柑桔“癫”病的初步探讨内部资料，广西柑桔黄龙病研究小组年广西柑桔黄龙病调查、复查总结内部资料，广西柑桔黄龙病研究小组广西柑桔黄龙病初步调查内部资料， 参考文献赵学源，蒋元晖，李世菱，等柑桔木虱与柑橘黄龙病流行关系的初步研究植物病理学报，，周启明，邱柱石，全金城广西柑桔木虱北延情况调查及其原因的初步分析内部资料，松本魏，苏鸿基台湾柑桔立枯病或黄龙病之研究内部资料，陈延熙对柑桔黄龙病的看法及防治工作的意见内部资料云南柑梧黄龙病调查小组云南柑梧黄化问题考察报告中国柑桔，陈之潭我国柑桔黄龙病分布北缘的初步探索内部资料，柑桔黄龙病专家考察组柑桔黄龙病考察报告内部资料，云南植保植检站柑梧黄龙病普查情况报告内部资料，四川省柑桔黄龙病调查小组西昌地区和渡口市柑桔黄龙病发生情况简报柑桔科技通讯，四川攀西相橘黄龙病研究协作组四川攀西柑桔黄龙病和综合防除技术研究西南农业大学学报，’黄立群赣州地区柑橘黄龙病综述江西柑桔科技，赣州地区柑桔黄龙病调查组关于柑桔黄龙病发生、分布情况的调查总结报告内部资料，陈又新，朱文灿防治柑橘木虱是防止柑桔黄龙病蔓延的关键现代园艺，，江西省赣州地区植保植检站柑桔黄龙病在江西赣州地区发生防治简况内部资料，江西省农牧渔业厅果业工程办公室赣南柑桔“三病（黄龙病、裂皮病、溃荡病）”考察资料汇编内部资料，蒋军喜，邱建斌，李庚花江西省吉安、抚州两地区柑橘黄龙病发生调查江西植保，，浙江省科学院亚热带作物研究所柑桔黄龙病调查报告内部资料，浙江省农业厅植物检疫站浙江省年柑棺检疫对象普查工作总结内部资料，浙江省亚热带作物所柑桔木虱课题组柑桔木虱生物学特性研究内部资料，柑桔木虱鉴定会材料之一，林云彪孟幼青，赵琳浙江省柑桔黄龙病的发生特点与检疫防治研究浙江柑桔，’孟幼青浙江省柑桔黄龙病发生现状和原因分析浙江柑橘，，蒋元晖，邱柱石一个值得重视的问题—略谈近年黄龙病区的增加中国柑桔，， 西南大学硕士学位论文湖南省植检站湖南省年柑桔黄龙病调查简报内部资料，李一农，唐庚元，毛晓林柑桔木虱在湖南省的分布植物检疫，，王春梅湖南柑橘黄龙病检测及片段克隆湖南：湖南农业大学陈之潭关于贵州柑拮黄龙病发生情况的调査汇报提纲内部资料，贵州省植物检疫站我省柑桔黄龙病考察小结内部资料，王祖泽柑橘黄龙病在贵州橘区的分布及蔓延植物保护，曾勉柑桔黄龙病问题内部资料：年月全国柑桔专业会议参考文件，四川省柑桔黄龙病调查小组西昌地区和渡口市柑桔黄龙病发生情况调查简报柑桔科技通讯，，，，，，，周常勇，，，—种微量快速抽提柑橘衰退病毒核酸应用于扩增的方法福建农业大学学报，，增刊，，，”，，，， 致谢致谢论文初稿完成已有一段时间，在之前的几次初稿中，我的致谢部分总是空着的，因为我清楚地明白，写完这部分后我离毕业就很近了。论文的写作过程是痛苦的，但在写完那一刻，我已没了疲惫，也没有长舒一口气，而是百感交集。三年的求学生涯将划上一个句号，我最美好的学生时代也将关上大门，从此，我将真正走出校门、踏进社会。年月刚进西南大学那一天的稚嫩情景还历历在目，而如今的我，早已完成了许三多式的华丽转身，眼前的这一切，我要感谢的人太多太多。首先，我要感谢我最敬慕的导师周常勇研究员。我的导师，亲切和善，关心学生无微不至、平易近人；学识渊博，对专业孜孜不倦、精益求精；百忙之余仍然读书不辍、兢兢业业；为人师表，率先垂范；传道授业，循循善诱、披星戴月。如果说我从您那里学会了怎样做好学问，那么首先应该说我从您那里领略了如何真正做一个有血有肉的人。虽然仅仅接触了三年，但您跟我的每一次交谈、您对我们的每一次教诲、甚至是您的每一个小举动，我都铭记在心。因为对您的崇敬有加，所以每次在您面前都容易犯傻，这让我好生懊恼。假如我可以选择时光，我想回到过去，让我再次龄听您那睿智深远的话语和博大宽容的豪情。师恩情谊重如山，值此毕业之际，谨向您表达最由衷的敬意及诚挚的感谢！其次，我要感谢那些在我的学习过程中给予我无私帮助的老师们，没有你们，我不可能取得如此进步和成长。感谢赵学源、蒋元晖两位德高望重的老师，在整个柑橘研究所学习期间，你们对我的关切一直贯穿始终，还有你们对学习孜孜不倦的态度一直勉励学生不断前进，在此，向你们致敬！感谢中国农业科学院柑桔研究所国家苗木脱毒中心这个团结、奋进、温暖的集体，你为我们提供了最好的学习、科研及生活的环境，解决了我们的后顾之忧。感谢李中安研究员、唐科志副研究员为我的论文提出的诸多宝贵意见并对我生活上方方面面的关心；感谢李太盛副研究员、卢志红高级农艺师、杨方云副研究员、宋震助理研究员、刘科宏助理研究员、陈洪明助理研究员、刘英助理研究员的各种帮助及支持；特别感谢刘金香副研究员作为副导师对我学习上的鼓励及提供的帮助；王雪峰及周彦两位博士暨良师益友在论文选题、研究方案、文章批改上所付出的心血及汗水，在此表达最真挚的谢意！感谢植物保护学院肖崇刚教授、王进军教授、谭万忠教授、青玲教授、陈国康副教授、孙现超副教授、杨水英副教授、马冠华副教授、毕朝位老师、董国菊老师、窦艳霞老师等及中国农业科学院柑桔研究所各位领导、老师的关怀、鼓励及帮助。衷心感谢浙江柑桔研究所陈国庆所长、贵州果树科学研究所蔡永强所长、湖南农业大学邓子牛教授、华南农业大学邓晓玲教授、广西水果总站赵小龙站长、赣南果业局植保站陈慈相站长等为我提供柑橘黄龙病调研资料。感谢公益性行业农业科研专项：柑橘有害生物种类与发生危害特点研究和柑橘黄龙病和溃疡病综合防控技术研究为本论文提供资金来源。 西南大学硕士学位论文感谢我的朋友同学们，没有你们，我不可能如此留恋。师姐江丽娜、申晚霞、蔡乐、邹勤、韦广琴，师兄刘永清、、曹孟籍、王永江、类兵海、胡文召、苏华楠、李文财，同窗唐淬、傅仕敏、李夏莲、吴精晶、黄爱军、于云奇等植保学院硕士级的同学们，师妹黄丽、李玲娣、吴琼、李敏，师弟谭锦、段硕，感谢你们与我共同分担这些年的快乐与忧愁，你们是我生命历程中最宝贵的财富及精神支柱！特别感谢我的父母、家人，在我年的人生、年的求学生涯中，你们奉献的太多太多，我一直铭记于心。面对熟悉的亲人，我们反而很难表达爱意，或许只有借助这样的机会，我才能放开声音对你们说声谢谢！此外，感谢孔毅同学长期以来对我的理解、宽容和帮助，感谢这些年我们一起走过的日子！最后，我衷心感谢在百忙之中评阅我论文及参加论文答辩的各位专家！再次向那些曾经给予我帮助的人们表达最诚挚的感谢！柏自琴 在读期间发表论文及参加科研项目情况在读期间发表论文及参加科研项目情况发表论文柏自琴，周常勇拼橘黄龙病病原分化及发生规律研究进展中国农学通报参加科研项目柑橘有害生物种类与发生危害特点研究，，公益性行业（农业）科研专项柑橘黄龙病和溃疡病综合防控技术研究，，公益性行业（农业）科研专项