向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究

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分类号S435.655学校代码10129UDC632学号2015202020029向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究BiologicalCharacteristics、PathogenicDifferentiationandGeneticDiversityofSclerotiniaminoronSunflower申请人：贾瑞芳学科门类：农学学科专业：作物保护学研究方向：分子植物病理学指导教师：赵君教授论文提交日期：二〇一八年六月 内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一，与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。一申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担切相关责任。、Ｌｃ會日期｛论文作者签名：：内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，Ｓ卩：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电。子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容。（保密内容除外），采用影印、缩印或其他手段保存论文论文作者签名：指导教师签名：考；＇〇日期／．Ｌ．：＞ｋ 摘要向日葵菌核病是一种世界性分布的真菌病害，在我国各个向日葵种植区均有发生，能够造成向日葵产量和品质的下降，严重的影响我国向日葵产业的发展。本研究对采集自内蒙古乌兰察布市、包头市和呼和浩特市的向日葵核盘菌和小核盘菌菌株的生物学特性和遗传多样性进行了研究，得到如下的结果：1.对采集自内蒙古乌兰察布白音查干镇高家地同一地块中的向日葵核盘菌和小核盘菌的生物学特性和致病力进行比较研究，发现核盘菌在菌丝生长速度、草酸分泌量、多聚半乳糖醛酸酶活力的平均值均高于小核盘菌；致病力测定结果表明核盘菌的致病力显著高于同一地块采集到的小核盘菌的致病力。2.相比23℃培养条件，核盘菌和小核盘菌置于4℃进行低温处理后，其菌丝的生长速度、草酸分泌量和多聚半乳糖醛酸酶活力都有明显的提高，相应的致病力也增强。3.以乌兰察布市四子王旗不同向日葵地块中发病的向日葵单株茎杆上采集到的小核盘菌为单独群体进行营养亲和群的研究，发现从公合成采集的GHC5单株上的供试小菌核被划分为4个不同的亲和群，其中最大的亲和群包括了63.3%供试菌株，而同一地块采集的GHC4单株上小菌核只划分为两个亲和群，最大的亲和群包括了80%的供试菌株。4.采自乌兰察布市四子王旗大黑河红旗滩同穴的两个向日葵病株TX1和TX2上的小核盘菌菌株均被划分为3个亲和组，其中TX1和TX2发病株上最大的亲合组中的小核盘菌的菌株数分别占供试菌株总数的86.7%和76.7%。5.通过对采集自内蒙古中部地区9个供试地点的110份向日葵小核盘菌的菌株进行亲和分组的结果表明，供试的菌株可以被划分为14个MCG亲和组。其中最大的亲合组包含32个菌株，占供试菌株总数的29.1%；有5个亲合组仅包括1个菌株，占比为35.7%。通过对不同亲和组的生物学特性和致病力进行测定的结果表明，不同MCG组在菌丝生长速度和草酸分泌量呈现显著的差异，但在菌核形成数量、PG酶活力和致病力方差异不明显。不同亲和组的组内各项测定指标都呈现出显著性的差异。6.利用小核盘菌交配型的特异引物对上述的110份菌株进行交配型测定结果表明除了MCG2组中Inv-和Inv+菌株比例为1:1外，在其它的亲合组中，Inv-和Inv+比例均偏离1:1的比例，且Inv-为优势交配型。关键词：向日葵；小核盘菌；生物学特性；遗传多样性；致病力分化 BiologicalCharacteristics、PathogenicDifferentiationandGeneticDiversityofSclerotiniaminorinSunflowerAbstractSunflowerSclerotiniablightisaworldwidedistributedfungaldisease,whichoccursineverysunflowerplantingareainChina.ThedestructivediseasecanleadtosignificantlossesinbothsunfloweryieldandseedqualityandseriouslyaffectsthedevelopmentofthesunflowerindustryinChina.Inthisstudy,thebiologicalcharacteristicsandgeneticdiversityofSclerotiniasclerotiorumandSclerotiniaminorstrainscollectedfromthecitiesofWulanchabu,BaotouandHohhotinInnerMongoliawerestudied.Theresultsobtainedareasfollows:1.AcomparativestudyofthebiologicalcharacteristicsandpathogencitydifferentiationofSclerotiniasclerotiorumandSclerotiniaminorcollectedfromthesamefieldofGaojiadi,BaiyinchaganTownship,Wulanchabu,InnerMongolia.Wefoundthattheaveragegrowthrateofmycelium,thesecretionofoxalicacidandtheactivityofpolygalacturonaseinSclerotiniasclerotiorumwereallhigherthoseofSclerotiniaminor.TheresultsofpathogenicitytestshowedthatthevirulenceofSclerotiniasclerotiorumwassignificantlyhigherthanSclerotiniaminor.2.Comparedwith23℃cultureconditions,thegrowthrateofmycelium,thesecretionofoxalicacidandtheactivityofpolygalacturonasewereobviouslyimprovedafterSclerotiniasclerotiorumandSclerotiniaminorweretreatedwithlowtemperatureat4℃,andthecorrespondingvirulencewasalsoincreased.3.Themyceliacompatibilitygroup(MCG)wasstudiedinSclerotiniaminorcollectedfromthestemsofsingleplantindifferentsunflowerfieldsinSiziwangqi,Wulanchabucity.TheresultsshowedthatthesclerotiacollectedfromthesingleplantGHC5inGonghechengweredividedinto4differentMCGs,thelargestgroupincluded63.3%ofallthetestedstrains,whilethesclerotiawerecollectedfromthesingleplantGHC4hadonlytwoMCGsandthelargergroupincluded80.0%ofallthetestedstrains.4.TheSclerotiniaminor,whichwereisolatedfromthetwosunflowerstemsTX1andTX2collectedfromthesameholeinHongqitan,Siziwangqi,Wulanchabucity,werebothdividedinto3MCGs.AmongwhichthenumberofSclerotiniaminorstrainsinthelargestgroupfromTX1andTX2taking86.7%and76.7%ofallthetestedstrains,respectively.5.Accordingtotheresultsofgroupingthe110Sclerotiniaminorstrainscollectedfrom9differentsitesincentralInnerMongoliabyMCG,wefoundthatthetestedstrains couldbedividedinto14MCGs.Thelargestgroupcontained32strains,taking29.1%ofallthetestedstrains,fivegroupsonlycontained1strain,taking35.7%ofalltheMCGs.BycomparingthebiologicalcharacteristicsandpathogenicityofisolatesfromdifferentVCGs,wefoundthatthegrowthrateofmyceliumandoxalicacidsecretionfromdifferentMCGshadsignificantdifference,exceptforthenumberofsclerotiniaformation,theactivityofPGenzymeandthepathogenicity.However,alltheindicatorstestedhadsignificantdifferencewithinthegroup.6.Thedistributionoftwomatingtypeofthe110strainswasidentifiedbyusingthespecificprimersformatingtypes.theresultsshowedthattheratioofInv-andInv+typewas1:1inMCG2,the1:1ratioofInv-andInv+typewasonlyobservedinMCG2,whiletheratioofInv-andInv+typeinotherMCGswerealldeviatedfrom1:1andInv-wasthedominantmatingtype.Keywords:Sunflower;Sclerotiniaminor;Biologicalcharacteristics;Geneticdiversity;PathogenicdifferentiationDirectedby:Prof.ZHAOJunApplicantforMasterdegree:JIARuifang(Cropprotection)(CollegeofAgriculture.InnerMongoliaAgriculturalUniversity.Hohhot010019.China) 目录1引言..................................................................................................................................11.1向日葵菌核病的危害...............................................................................................11.2向日葵菌核病的症状与侵染循环...........................................................................11.3核盘菌和小核盘菌的研究进展...............................................................................21.4核盘菌和小核盘菌的致病因子...............................................................................41.4.1草酸....................................................................................................................41.4.2细胞壁降解酶....................................................................................................41.5核盘菌和小核盘菌的亲和分组...............................................................................51.6核盘菌和小核盘菌的交配型的研究.......................................................................61.7本研究的目的意义...................................................................................................72同一地块核盘菌和小核盘菌生物学特性和致病力的比较..........................................82.1材料...........................................................................................................................82.1.1供试材料与菌株................................................................................................82.1.2供试培养基........................................................................................................82.2方法...........................................................................................................................82.2.1核盘菌和小核盘菌的分离纯化........................................................................82.2.2核盘菌和小核盘菌的菌丝生长速度测定........................................................82.2.3核盘菌和小核盘菌草酸分泌量的测定............................................................82.2.4核盘菌和小核盘菌的多聚半乳糖醛酸酶活力的测定....................................92.2.5核盘菌和小核盘菌的致病力的测定................................................................92.3结果与分析...............................................................................................................92.3.1向日葵核盘菌和小核盘菌菌落形态与菌核形成速度比较............................92.3.2核盘菌和小核盘菌菌丝生长速率的比较......................................................102.3.3核盘菌和小核盘菌草酸分泌量的比较..........................................................112.3.4核盘菌和小核盘菌多聚半乳糖醛酸酶活力的比较......................................122.3.5核盘菌和小核盘菌致病力的比较..................................................................132.4结论与讨论.............................................................................................................1334℃低温处理对核盘菌和小核盘菌致病力的影响......................................................153.1材料.........................................................................................................................153.1.1供试材料与菌株..............................................................................................153.1.2供试培养基......................................................................................................153.2方法.........................................................................................................................153.2.1向日葵核盘菌和小核盘菌的分离纯化..........................................................15 3.2.2核盘菌和小核盘菌的低温处理的方法..........................................................153.2.3向日葵核盘菌和小核盘菌菌株菌丝生长速度测定......................................153.2.4向日葵核盘菌和小核盘菌菌株草酸分泌量测定..........................................153.2.5向日葵核盘菌和小核盘菌菌株多聚半乳糖醛酸活力测定..........................153.2.6向日葵核盘菌和小核盘菌致病力测定..........................................................153.3结果与分析.............................................................................................................163.3.14℃低温处理后的核盘菌和小核盘菌的菌丝生长速率比较......................163.3.24℃低温处理后的核盘菌和小核盘菌草酸含量的比较..............................173.3.34℃低温处理后核盘菌和小核盘菌多聚半乳糖醛酸酶活力比较..............173.3.44℃低温处理后核盘菌和小核盘菌致病力的比较......................................183.4结论与讨论.............................................................................................................184单株向日葵上小核盘菌群体的亲和分组....................................................................204.1材料.........................................................................................................................204.1.1供试材料与菌株..............................................................................................204.1.2供试培养基......................................................................................................204.2方法.........................................................................................................................204.2.1向日葵小核盘菌的分离纯化..........................................................................204.4.2菌丝亲和群（MCG）测定.............................................................................214.3结果与分析.............................................................................................................214.3.1向日葵小核盘菌菌丝体亲和群的划分..........................................................214.3.2同一病株上向日葵小核盘菌菌丝亲和分组测定结果..................................224.4结论与讨论.............................................................................................................235向日葵小核盘菌的遗传多样性的研究........................................................................245.1材料.........................................................................................................................245.1.1供试菌株..........................................................................................................245.1.2供试培养基......................................................................................................245.2方法.........................................................................................................................255.2.1向日葵小核盘菌的分离纯化..........................................................................255.2.2向日葵小核盘菌的亲和分组（MCG）的测定方法.....................................255.2.3同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌菌丝生长速度测定................255.2.4同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌菌核干重的测定....................255.2.5同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌草酸分泌量测定....................255.2.6同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌PG酶活力测定....................255.2.7同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌致病力的测定........................255.2.8不同MCG组内小核盘菌菌株Inv-和Inv+交配型的测定..........................25 5.3结果与分析.............................................................................................................265.3.1向日葵小核盘菌的亲和分组的结果..............................................................265.3.2不同MCG组间菌株的生物学特性和致病力比较.......................................275.3.3同一MCG组内菌株的生物学特性和致病力比较.......................................285.3.4小核盘菌菌株Inv-和Inv+分布频率的测定..................................................335.4结论与讨论.............................................................................................................346结论................................................................................................................................36致谢......................................................................................................................................37参考文献..............................................................................................................................38附录......................................................................................................................................44作者简介..............................................................................................................................50 插图和附表清单1.图1向日葵核盘菌和小核盘菌引起的菌核病田间症状.......................................................22.图2向日葵核盘菌和小核盘菌菌核形成速度比较.............................................................103.图3核盘菌和小核盘菌菌株平均生长速率的比较.............................................................114.图4向日葵核盘菌和小核盘菌草酸分泌量平均值的比较.................................................125.图5核盘菌和小核盘菌PG酶活力平均值的比较..............................................................126.图6核盘菌和小核盘菌代表菌株致病力的比较.................................................................137.图74℃处理后核盘菌和小核盘菌代表菌株菌丝生长速度的比较...................................168.图84℃处理后核盘菌和小核盘菌菌株平均生长速率的比较...........................................169.图94℃处理后核盘菌和小核盘菌草酸分泌量平均值的比较...........................................1710.图104℃处理后核盘菌和小核盘菌PG酶活力平均值的比较..........................................1811.图114℃处理后核盘菌和小核盘菌代表菌株致病力的比较.............................................1812.图12Sclerotiniaminor菌丝亲和表型示意图.....................................................................2113.图13不同地区同一病株上向日葵小核盘菌亲和分组结果...............................................2214.图14采样地点........................................................................................................................2415.图15不同地点菌株亲和分组情况........................................................................................2716.图16不同地点的菌株在亲和组中分布情况.....................................................................2717.图17MCG1组小核盘菌菌株致病力的比较.......................................................................3018.图18MCG2组小核盘菌菌株致病力的比较.......................................................................3119.图19MCG3组小核盘菌菌株致病力的比较.......................................................................3120.图20MCG4小核盘菌菌株致病力的比较...........................................................................3221.图21MCG5小核盘菌菌株致病力的比较...........................................................................3222.图22小核盘菌菌株Inv-和Inv+分布比例...........................................................................3323.图23MCG分组中小核盘菌菌株Inv-和Inv+分布比例.....................................................3424.表1内蒙古乌兰察布市不同地点单株向日葵小核盘菌来源一览表.................................2025.表2菌丝亲和分组结果统计表..............................................................................................2226.表3内蒙古地区不同地点向日葵小核盘菌来源一览表.....................................................2427.表4向日葵小核盘菌生物学特性各项指标的测定结果.....................................................2828.表5不同MCG分组小核盘菌交配型测定..........................................................................33 内蒙古农业大学硕士学位论文11引言1.1向日葵菌核病的危害向日葵（HelianthusannuusL.）是菊科向日葵属的一年生草本植物，是我国重要的经济作物。菌核病是向日葵的重要病害之一，世界各向日葵种植区都有发生[1]。如20世纪60年代，由于向日葵菌核病在法国大规模发生导致法国向日葵生产停滞长达15年；20世纪70年代在塞尔维亚的一些向日葵产区菌核病的发病率达到40%，对该地区向日葵生产造成了巨大的损失；1970年加拿大向日葵产区菌核病发病严重，发病率达到95%，对该地区的向日葵产业造成了毁灭性的灾难；据统计，美国在20世纪末由于菌核病对向日葵的减产损失超过10亿美元[2]。我国向日葵菌核病主要在东北、内蒙古、山西、新疆等向日葵主要产区发生。1978年，自辽宁首次发现菌核病后，其发病面积逐年增加；1985年呼伦贝尔盟向日葵盘腐型菌核病发生率高达50%以上[3]；1999年，新疆特克斯县2000hm2的向日葵种植地，菌核病的发病率达到40%[4]。2009年～2014年，黑龙江省向日葵菌核病的年平均发病率在20%～40%，有些发病严重的地块发病率达到80%[5～6]。近几年，在巴彦淖尔种植区由向日葵菌核病造成的产量损失约为10%～30%，严重的达到60%[7]。向日葵菌核病发生后导致葵花籽的空壳率增加，籽仁的含油率和蛋白质含量的降低，严重的影响向日葵产业的发展[8]。1.2向日葵菌核病的症状与侵染循环向日葵的菌核病发生后，其症状主要有根腐型（图1A）、茎腐型（图1B）、叶腐型（图1C）和盘腐型（图1D）四种；而小核盘菌（Sclerotiniaminor）能侵染向日葵的根茎部，导致根茎腐（图1E），田间条件下未见由小核盘菌引起的茎腐、盘腐和叶腐等症状。根腐型的症状出现是由种子携带或土壤中的菌核萌发的菌丝体直接侵染植株的根或根茎部导致的。除了根部腐烂外，有时在茎基部也会由于病原菌的侵染产生褐色病斑，湿度大的情况下在病斑边缘能够观察到白色菌丝的形成。根腐症状出现后会导致整株的枯死。菌核萌发形成子囊盘，子囊盘散发出子囊孢子能够侵染向日葵的地上部，导致茎腐型、叶枯型菌核病和盘腐型的菌核病的发生。茎腐型菌核病产生的病斑在发病部位往往会沿茎杆纵向扩展，最后导致髓部烂空，其中充满了白色絮状菌丝和黑色颗粒状菌核，茎杆的表皮开裂而程纤维状。叶腐型菌核病发病初期会在发病部位形成的浅褐色水渍状病斑，随着湿度的增大，逐渐扩展为圆形或不规则形状的病斑，在病斑边缘产生白色菌丝，干燥后病部收缩干枯。盘腐型菌核病发生时，被侵染的花盘背面会出现水渍状病斑，空气湿度比较大时，褐色水渍状病斑会迅速扩展，导致整个花盘腐烂。在花盘上的病斑处产生大量白色絮 2向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究状菌丝，密生于整个花盘的籽粒间，最终形成盘网状菌核，覆盖整个发病的花盘。病害发生严重时病斑会扩展到与花盘相连的茎部，导致腐烂花盘的脱落。花盘受害后会在果实内部和表面形成黑色菌核颗粒，含油量和萌发率都会明显降低。向日葵菌核病的初侵染源主要是田间病残体中携带的菌核颗粒以及向日葵种子内部携带的菌丝或菌核。越冬后的菌核在开春后首先萌发形成菌丝体，侵染向日葵的根和茎基部，导致根腐或者茎杆基部的腐烂。随后在气候条件适宜时，土壤中的菌核能够萌发形成子囊盘。子囊盘中的散发出子囊孢子能够随着气流和雨水进行传播，从而侵染向日葵的茎杆、叶片和花盘，导致茎腐型、盘腐型和叶枯型的菌核病的发生。7-8月份高频率的降雨会导致病害迅速的扩展和蔓延。秋季花盘收获后，残留在地中的发病的茎杆和由于盘腐导致脱落的花盘中的菌核会随着土地的耕翻进入土壤中，成为来年潜在的主要的初侵染来源。注：A：核盘菌根腐型；B：核盘菌茎腐型；C：核盘菌叶腐型；D：核盘菌盘腐型；E：小核盘菌茎基部腐Note：A：Root-stemrotcausedbyS.sclerotirum；B：StemrotcausedbyS.sclerotirum；C：LeaverotcausedbyS.sclerotirum；D：FlowerdiscrotcausedbyS.sclerotirum；E：Root-stemrotcausedbyS.minor；图1向日葵核盘菌和小核盘菌引起的菌核病田间症状Fig.1ThesymptomsofSunflowerrotcausedbyS.sclerotiorumandS.minor1.3核盘菌和小核盘菌的研究进展核盘菌（Sclerotiniasclerotium(Lib.)deBery）属于子囊菌亚门，盘菌纲，核盘菌属的病原真菌。由于其营养方式以腐生营养型为主，因此其寄主范围非常广泛[9]。目前，核盘菌能够侵染包括向日葵在内的500多种寄主植物[10]。其菌丝体生长的最适温度为20～28℃，最适PH为4～7，最佳的碳源为麦芽糖和甘露糖[11]。余秋玉[12]等人的研究结果表明菌核萌发受到菌核形成时和诱导菌核萌发时的环境温度的影响；春季和秋季萌发的核盘菌菌株在菌核萌发条件上具有一定的差异性。Guimaraes[13]认为核盘菌菌丝生长的最适温度为20℃，在低温15℃时菌核能够萌发形成子囊盘。刘万仁等对从我国不同地区的农作物、蔬菜、牧草、和草药植物上采集到的28个核盘菌菌株进行研究，结果表明个别核盘菌菌株表现一定的寄主专化性。在核盘菌的种群中，尽管不同菌株之间的差异很小，但是它们对温度的适应性却呈现出明显的差异，因此， 内蒙古农业大学硕士学位论文3可分划为南方型和北方型两种生态类群。南方型菌株能够适应较高的温度，而北方型菌株适应低温的能力强[14]。由于核盘菌的寄主范围广泛，因此在致病力上存在一定的分化现象。李国庆等通过离体叶片法在油菜上测定了核盘菌致病力，结果表明油菜上的核盘菌的致病力存在一定分化现象，且我国的南方和北方的核盘菌菌株的致病型存在一定的差异性[15]。张蕾[16]等采用茎杆牙签接种法和离体叶片接种法测定46株核盘菌菌株对油菜的致病力，结果显示核盘菌致病力分化与油菜品种的抗性有关。刘勇等将23个油菜菌核病菌系接种在甘蓝型油菜植株茎杆上，结果表明不同菌系对油菜的抗感品种都具有一定的致病力，但是致病力存在一定的差异[17]。刘春来等研究结果认为核盘菌融合群之间的致病力存在一定的差异，但是与其地理来源并没有相关性[18]。李建广等对源自向日葵的核盘菌菌株致病力进行研究，结果表明向日葵菌核的萌发与菌株的来源有一定的关系，但其致病性与菌株地理来源的相关性不明显[19]。黄娟等将源于来自于茄子的16个核盘菌菌株的致病力划分为弱致病力、中等致病力和强致病力三种，表明源自同一块茄子田的核盘菌菌株在致病性方面存在分化现象[20]。许多国外学者认为地理来源相同的菌株间也会存在致病性差异，所以致病性的差异与寄主和地理来源的关系并不大[21～22]。而Lumsden[23]等认为大豆核盘菌之间没有明显的致病性分化。和核盘菌一样，小核盘菌（Sclerotiniaminor）也属于子囊菌亚门，盘菌纲，核盘菌属。但相比核盘菌其寄主范围比较狭窄，仅能侵染21科66属94种寄主植物[24]。近年，关于小核盘菌引起的向日葵菌核病报道逐渐增多。如2011年，Karov在马其顿共和国首次在向日葵上发现了小核盘菌[25]。2013年Koike[26]等人首次报道向日葵小核盘菌在墨西哥发生。本实验室的李敏[27]等人在2015年首次报道了向日葵小核盘菌在中国内蒙古地区中部的阴山北麓地区发生，并对向日葵小核盘菌的生物学特性和致病力进行了初步的探索研究。由小核盘菌引起的向日葵茎基部的腐烂极大的限制了澳大利亚东南部向日葵产业的发展。在维多利亚南部超过75%的向日葵种植地受到不同程度的侵染，且发病率在1～50%之间[28]。Burgess等人在调查高感小核盘菌的向日葵自交系的过程中首次发现在田间该病害在向日葵的幼苗期就有发生[29]。有研究者发现小核盘菌的菌核需要经过休眠期才能萌发形成菌丝体[30]。Hawthorne等人进行为期五年的田间试验结果表明，小核盘菌的菌核在5月和6月的田间条件下萌发的较多，子囊盘大量产生是在9月、10月，偶尔在11月的早期。室内研究发现小核盘菌的菌核萌发形成子囊盘的最适宜的温度为10℃-19℃之间，以15℃为最佳温度[31]。Hollowell首次报道了9种杂草在自然环境中可作为小核盘菌的寄主，且从杂草上分离得到的小核盘菌对花生也具有一定的致病性[32]。Chappell[33]等人在茎杆上接种来评价不同基因型的花生品种对小核盘菌的抗性水平，发现不同基因的型花生提取物会影响小核盘菌菌丝体的生长速度，预示着不同基因型的花生对小核盘菌的抗性水平存在显著性的差 4向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究异。在我国湖北省西部和西南地区小核盘菌引起的莴苣菌核病主要表现为根腐和茎腐两种症状。而李国庆等人的研究结果表明经过4℃的长期低温处理后小核盘菌能够萌发形成子囊盘，并通过田间实验证实了小核盘菌侵染莴苣的主要的初侵染源是越冬的小粒菌核[34～35]。Garrido采用ISSR分子标记指纹图谱分析了俄克拉何马州的花生小核盘菌的遗传多样性，发现基于ISSR标记产生了38个多态性DNA带，且小核盘菌菌株之间的遗传差异达到显著水平[36]。1.4核盘菌和小核盘菌的致病因子1.4.1草酸草酸是一种最简单的有机酸，它是许多动植物和微生物体都能产生的一种毒性物质。草酸在真菌的新陈代谢里起重要作用，为真菌在不同的环境条件下的存活提供了条件。有研究表明，草酰乙酸能够在草酰乙酸乙酰水解酶的催化作用下转化为草酸和二氧化碳，这是包括核盘菌在内的子囊菌亚门的真菌草酸生物合成的一个基本反应。Goday[37]通过紫外照射子囊孢子获得不产生草酸的营养缺失型突变体，该突变体接种到大豆叶片上丧失了致病力；而将其在诱导草酸产生的培养基上培养后，突变体又能够侵染植物并引起小的病斑，证实了草酸是核盘菌一个重要的致病因子。LiangX[38]等人获得了丧失草酸合成的OAH基因敲除突变体，通过接种鉴定发现该突变体的致病力明显的降低，但是该突变体也能形成较小的病斑，说明除了草酸以外同时存在其他致病因子能够使得寄主植物致病。草酸在核盘菌致病过程中的作用机制有一下几个方面：（1）在侵染初期草酸会在寄主的侵染部位大量的积累，会导致寄主细胞的PH值降低，增强多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、半纤维素酶等酸性酶的活性，加速植物细胞壁的降解[39～41]；（2）草酸能够形成草酸钙晶体，堵塞植物导管或维管束造成植物萎蔫的症状；（3）草酸的积累对植物具有直接毒害作用，草酸有较强的离子螯合能力，通过改变寄主细胞膜的通透性，引起电解质流失，为病原菌提供了营养和生存环境[42]；（4）草酸能够抑制寄主植物中与抗性有关的酶的活性[43]；（5）草酸能够促进寄主植物打开气孔，抑制ABA诱导的气孔关闭进而调控保卫细胞的功能，引起叶片萎蔫[44]。国内外许多学者都证明了草酸在核盘菌致病过程中的重要作用[45～46]，但草酸的致病机制仍然存在一定的争议性，因为有些研究结果证明了酸性环境为核盘菌的生长和致病力创造了条件，但者并非是都是草酸的作用[47]。1.4.2细胞壁降解酶细胞壁是病原菌侵入寄主植物的主要屏障，植物细胞壁的主要成分有果胶质、纤维素、半纤维素、糖蛋白和木质素等，病原菌通过分泌果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、木质素降解酶等一系列细胞壁降解酶促进病原菌对寄主植物的侵染[48]。 内蒙古农业大学硕士学位论文5在所有植物病原菌的细胞壁降解酶中研究最多的是果胶酶。果胶酶可以分为两种即果胶裂解酶和果胶水解酶。国内外学者对核盘菌产生的果胶酶在寄主的致病性上的作用进行了很多的研究，但不同寄主、寄主的不同部位、病原菌侵染的不同时期，果胶酶的种类、酶的活力对核盘菌致病性都有不同程度的影响[49～51]。多聚半乳糖醛酸酶（PG：Polygalacturonases）是一种重要的果胶酶，它能降解初生细胞壁与胞间层的结构性多糖，导致组织解体进而引起植物的软腐、干腐、枯萎等症状。母玉翠[52]在离体条件下培养核盘菌菌株发现在第5d时，PG酶活性达到高峰；将菌株接种到油菜叶片，PG酶活性则在侵染油菜叶片3d后达到最大值，并通过实验证明了致病力不同的菌株间PG酶活性也具有明显差异。许多的实验证明，果胶酶引起细胞的死亡并非是对植物细胞的直接伤害或者产生有毒物质，主要原因可能是果胶酶在降解多种细胞组分后造成细胞壁内压力的降低，原生质膜破裂进导致细胞的死亡。纤维素作为构成植物细胞壁的主要成分，能够保持细胞的形态，在细胞生命活动中具有重要作用。纤维素酶是能够降解纤维素的水解酶，多种病原菌能够产生纤维素酶。有研究表明纤维素酶在病原菌侵染寄主植物的过程中起一定的作用[53]。半纤维素酶是一种复合酶，核盘菌产生半纤维素酶的能力也较强。此外，植物病原菌还能分泌多种蛋白酶、淀粉水解酶等协同果胶酶增强病害的严重程度。近年来，专家学者们开始从分子水平上研究核盘菌与寄主互作，对核盘菌的致病机理进行深入研究。除了草酸和细胞壁降解酶一直作为两个与核盘菌致病力密切相关的致病因子外，一些与核盘菌的发育和致病相关的其他基因也在国内外学者的研究中也得到鉴定，如影响菌核形成的核盘菌钙调磷酸酶（Calcineurin）基因，腺苷酸环化酶基因（sacl）和NADPH氧化酶基因SsNox1和SsNox2；与核盘菌复合附着胞形成有关的Ss-caf1基因,促进核盘菌侵染垫形成的SsPeMG1，参与调节ROS的SCAT1等，小核盘菌的致病因子与核盘菌基本相似[54-57]。1.5核盘菌和小核盘菌的亲和分组（MyceliaCompatibilityGroup，MCG）核盘菌菌丝体的亲和组是研究核盘菌群体致病类群分析和遗传多样性的一种常用的研究方法。当不同菌株如果属于同一个亲和组时，菌丝体之间可以汇合共同生长，菌落形态完整统一，而属于不同亲和组的不同菌株的菌丝体共同培养后会形成明显的由于菌丝体相互作用而产生的的反应区带。Kohn[58]等对采自油菜上的35个核盘菌菌株进行了亲和性测定，并且对亲和组之间的遗传进化关系进行了分子验证，证明了菌丝亲和分组能够反映核盘菌遗传多样性。Osofee[59]等对采集自蔬菜作物寄主上的25个核盘菌菌株进行了亲和组测定，共得到了17个亲和组，其中有13个亲和组是有单个菌株组成。李易初[60]等把来自大豆病样的67个核盘菌菌株分划分为30个亲和组，有21个亲合组中只包含有单个菌株。2015年，Aldrichwolfe[61]等人对来自美国中部地 6向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究区不同寄主的145个核盘菌菌株的亲合组进行了划分，145个菌株被划分为49个亲和组。Barari[62]等人对来自不同寄主的65个核盘菌菌株进行亲和分组测定，共获得了39个亲和群，其中有26个亲和群是单个菌株组成。杨丹[63]等人对来自不同寄主的小核盘菌菌株进行菌丝亲和分组测定，结果显示供试的95个菌株分为8个菌丝亲和组，最大的一个亲和组中包含有29个菌株，仅有一个亲和分组为单个菌株。Wu[64]等人对生菜上的核盘菌和小核盘菌进行了亲和分析，结果显示小核盘菌的91.4%的菌株集中在4个亲和组中。而核盘菌却具有更丰富的多样性，89个菌株被分成37个亲和组。李敏等人对中国新疆温泉地区同一地块采集的向日葵核盘菌进行了亲合组分析，结果表明供试的90个核盘菌菌株被划分为15个MCG亲合组，有6个MCG亲合组仅有1个菌株，最大的MCG分组包含34个菌株，其余MCG分组包含2-13个菌株。上述这些研究结果表明核盘菌的亲和分组能够在某种程度上反映出核盘菌的遗传多样性水平[65]。1.6核盘菌和小核盘菌的交配型的研究大部分真菌具有有性态和无性态，取决于环境条件，55%的子囊菌在生活史上要经历有性生殖过程，其中，同宗配合和异宗配合是子囊菌的两种主要的有性生殖方式。异宗配合的子囊菌的有性繁殖需要两个不同亲和型的菌株，且不同亲和型的菌株分别都至少含有一个固定的交配型位点。含有两个对位遗传位点的菌株，除了DNA序列差别较大外，得到的转录产物也存在较大的差异。对位交配型基因位点是两个特异性基因位点，所以，只有包含两个相反的交配型基因的菌株相互配对后才能产生有性孢子[66]。同宗配合的子囊菌，只包含单个遗传位点，但是子代的子囊孢子的交配型却多样化，交配型基因的结构成为有性生殖能够成功的重要因素[67～68]。核盘菌和小核盘菌属于丝状同宗配合真菌，控制其有性生殖的交配型基因MAT-1和MAT-2紧密连锁。Chitrampalam在近几年研究中检测到两个真菌中有两个MAT位点，Inv+（MATinversionpositive）和Inv-（MATinversionnegative）。王学亮等人对所克隆的核盘菌交配型基因MAT1-1，利用PAUP*软件将82个包含Alpha-box交配型基因的子囊菌进行系统进化分析以及氨基酸水平和核苷酸系统发育分析，结果显示，其构建的系统进化树与传统分类所表现出的进化关系基本一致，可见，核盘菌交配型基因MAT1-1在进化过程中的功能相对保守[69]。目前，有关核盘菌交配型的研究已有很多，如Chitrampalam[70]在2013年首次报道在核盘菌减数分裂过程中MAT位点会出现一个3.6kb片段的反转现象，导致MAT1-1-1的等位基因丢失，从而使得核盘菌inversion-minus和inversion-plus出现的频率呈现1:1的稳态分布。这种现象于2015年[71]在莴苣寄主上采集的小核盘菌中也被检测到，如采集自美国的莴苣上的38份菌株被分为3个MAT基因型Inv+，Inv- 内蒙古农业大学硕士学位论文7和heterokaryon（同时包含Inv+和Inv-），每个类型分别包含3、19和16份菌株，占总菌株数的8%、50%和42%。本实验室李敏对采集自同一向日葵地块的核盘菌菌株进行交配型的研究，结果表明在MCG1分组中，inversion-minus和inversion-plus出现的频率是1:1，其他分组中Inversion-plus为优势交配型。1.7本研究的目的意义本研究主要以内蒙古地区向日葵的核盘菌和小核盘菌菌株为供试材料，比较研究了乌兰察布市白音查干高家地同一地块采集的核盘菌和小核盘菌菌株的生物学特性和致病力分化；探究了低温（4℃）处理对核盘菌和小核盘菌的生长和致病力的影响。通过对单株上分离得到的小核盘菌菌株进行菌丝亲和分组，初步探究小核盘菌菌株的种群变异程度。通过对采自不同地点的向日葵小核盘菌菌株进行亲和分组和致病力的研究，明确不同地区来源的小核盘菌菌株之间是否存在致病力分化，不同亲和组之间以及亲和组内菌株间的生物学特性、致病相关因子之间的差异。上述的研究结果将填补我国在向日葵小核盘菌研究领域的空白，为后续的向日葵抗菌核、小菌核病的育种奠定坚实的理论依据。 8向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究2同一地块核盘菌和小核盘菌生物学特性和致病力的比较2.1材料2.1.1供试材料与菌株核盘菌菌株和小核盘菌菌株均为采集自内蒙古乌兰察布白音查干镇高家地同一地块的菌株。向日葵品种：LD50092.1.2供试培养基（1）PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水定容至1000ml。（2）MM培养基：（Minimal-medium）：1gNaOH、3gDL-malicacid、2gNH4NO3、0.1gMgSO4•7H2O、39gBacto-agar、蒸馏水1000ml、调PH为4.8。（3）PDB培养液：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，加水定容至1000ml。2.2方法2.2.1核盘菌和小核盘菌的分离纯化对采集自田间的向日葵核盘菌和小核盘菌的菌核样本进行表面清洁，然后置于2mL的离心管，先加入0.5%NaClO（v/v）消毒3～5min，再加入75%酒精，处理5～10s，最后用无菌水清洗3次，置于无菌滤纸上晾干。将晾干后的菌核接种在PDA培养基上（每皿放置5粒），置于23℃恒温培养箱进行培养。当菌核周围出现白色菌丝后，挑取菌丝尖端转接于新的PDA培养基中，连续转接3次后收集的菌核置于1.5ml离心管中4℃保存。2.2.2核盘菌和小核盘菌的菌丝生长速度测定将上述纯化好的向日葵核盘菌和小核盘菌的菌核置于PDA培养基上进行培养。当菌丝长至培养皿的3/4时，从菌落边缘打取直径为9mm的菌饼，置于PDA平板中央，23℃下进行培养。分别在培养48h，3d，4d，6d后利用十字交叉法测定菌落直径，同时观察菌落形态以及菌核形成的过程，记录相关的数据。每个供试菌株设置三个重复。取核盘菌和小核盘菌各10个菌株生长速率的平均值来作为各自的生长速度值。菌核形成过程的观察以最早出现菌核形成的起始结构的时间为记录起始点。2.2.3核盘菌和小核盘菌草酸分泌量的测定在活化好的菌落边缘打取2个直径9mm的菌饼，置于装有40mLPDB培养液的100mL三角瓶中，23℃条件下静置培养5d后取滤液作为测定草酸的样本。草酸的测定参照Durman[72]等人的方法进行。草酸测定反应液包含0.2mL滤液样品、0.11mL溴酚蓝（0.1mM）、0.20mL硫酸(1M)、0.18mL重铬酸钾(100mM)和4.8mL蒸馏水。反应液60℃水浴10min后加入0.5mL（0.75M）的氢氧化钠溶液来阻止反应。 内蒙古农业大学硕士学位论文9在600nm光谱上测定反应液的光谱吸收值。以没有接菌的PDB培养液作为空白对照。根据草酸标准曲线计算草酸浓度，单位是μg草酸/mg干菌丝。核盘菌和小核盘菌各取10个菌株，每个菌株设置3个重复。2.2.4核盘菌和小核盘菌的多聚半乳糖醛酸酶活力的测定在活化好的菌落边缘打取2个直径9mm的菌饼置于装有80mLPDB培养液的250mL三角瓶中，23℃，130-150rpm条件下震荡培养。10d后将培养液过滤后得到的菌丝体，晾干后称重。过滤得到的滤液在5000rpm低温条件下离心15min后，取上清液用于测定PG酶的活性。测定方法采用DNS法[73]即在试管中加入1ml的果胶底物后48℃水浴5min；然后加入4ml（PH4.8）的乙酸－乙酸钠缓冲液和1mL稀释的酶液，立即摇匀后在48℃水浴中准确反应30min；同时取1mL果胶底物、4mL缓冲液和1mL酶液于另一试管中，煮沸灭活15min后作为空白对照。反应完成后分别向两支试管中加入2.5mL的DNS试剂，煮沸5min后取出立即流水冷却。以空白对照为基准调零，用紫外分光光度仪测定其在540nm的吸光值。核盘菌和小核盘菌各取10个菌株，每个菌株各设3个重复。PG酶活力测定的标准曲线是以D-(+)半乳糖醛酸为标样做出。用上述测得的分光光度值在标准曲线上对应查找得到相应的D-半乳糖醛酸的量，代入下面公式计算PG酶的活力。酶活力(U)=Y×N×N×3/T×W其中，Y表示酶作用生成的D-半乳糖醛酸(mg)；N为样品稀释倍数；T表示反应所用时间(h)，W表示菌丝干重。2.2.5核盘菌和小核盘菌的致病力的测定将在PDA上活化好的供试菌株接种在MM培养基上，23℃恒温培养2d后接种到离体叶片上，对核盘菌和小核盘菌的致病力进行测定。具体测定方法如下：在方形磁盘底部铺两层灭菌的滤纸，倒入适量无菌水后使其刚好湿润。将向日葵的离体叶片在蒸馏水中清洗后将叶片背面朝上放入磁盘中的湿润的滤纸上。用吸水纸将叶片表面多余水吸干后，在MM培养基上打取直径9mm的菌饼，将菌丝面朝下放置在叶片主脉两侧，用保鲜膜封住磁盘，室温条件下放置2d后开始观察叶片上的发病情况。采用十字交叉法测量叶片上病斑直径大小，并记录相关数据。核盘菌和小核盘菌各取10个菌株，每个菌株接种5个叶片，取其病斑的平均值来衡量该菌株的致病力，以没有接菌的MM培养基菌饼作为接种对照。2.3结果与分析2.3.1向日葵核盘菌和小核盘菌菌落形态与菌核形成速度比较向日葵核盘菌和小核盘菌在PDA培养基上均能够形成白色菌丝体，核盘菌形成 10向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究的菌丝体较为疏松，而小核盘菌形成的菌丝比较致密。菌核颗粒的测量结果表明小核盘菌产生的小菌核的直径范围在0.33～1.02mm，而核盘菌产生的菌核直径范围在2.15～4.18mm。培养3天后，当小核盘菌培养皿里能够观察到菌核的起始结构即菌丝聚集形成疏松的白色突起结构时，核盘菌培养皿中还未见有菌核起始结构的形成，说明小核盘菌菌核形成早于核盘菌。4天后，当核盘菌从菌落边缘位置开始出现菌核的起始结构时，而小核盘菌培养皿中已经可见有黑色素沉积的菌核颗粒的形成（成熟的菌核）。6天后，二者的培养皿中均有肉眼可见的成熟的菌核颗粒的形成。但是，核盘菌的菌核颗粒多为圆形，较为整齐的分布在培养基的边缘，而小核盘菌则形成不规则的米粒大小的颗粒，有的为单粒，有的则连在一起。在菌核形成数量上，小核盘菌菌核形成的数量远远高于核盘菌，但是在单粒菌核的体积上，小核盘菌形成的菌核颗粒却显著的小于核盘菌的菌核颗粒（图2）。核盘菌小核盘菌图2向日葵核盘菌和小核盘菌菌核形成速度比较Fig.2ThecomparisonofsclerotialdevelopmentofS.sclerotiorumandS.minor2.3.2核盘菌和小核盘菌菌丝生长速率的比较核盘菌和小核盘菌菌株培养48h后的生长速率的统计结果如附表1所示。10株核盘菌中生长最快的菌株是2号菌株，菌落直径为8.62cm，3号菌株的生长速度最慢，菌落直径为8.10cm；而小核盘菌中生长最快的是9号菌株，其速度为6.35cm， 内蒙古农业大学硕士学位论文115号菌株的生长速度最慢仅为3.67cm。核盘菌和小核盘菌株生长速度的显著性测定结果表明，核盘菌供试的10株菌株间的生长速度没有显著差异，但是小核盘菌间生长速度具有显著差异。10株核盘菌的菌落直径平均值8.34cm,而小核盘菌的菌落直径平均值仅为5.38cm，其平均生长速率显著低于核盘菌菌丝的生长速率，且二者差异呈现极显著水平（图3）。图3核盘菌和小核盘菌菌株平均生长速率的比较Fig.3ThecomparisonofS.sclerotiorumandS.minoronhyphalgrowthspeed2.3.3核盘菌和小核盘菌草酸分泌量的比较核盘菌和小核盘菌供试菌株草酸分泌量测定结果见附表1。核盘菌菌株中草酸分泌量最高的是4号菌株，其数值为32.14μg/mg，最低的为9号菌株，为24.09μg/mg。而小核盘菌中草酸分泌量最高的是8号菌株，其分泌量为21.48μg/mg；7号菌株的草酸分泌量最低仅为17.70μg/mg。显著性测定的结果表明，供试的核盘菌中4号与8、9号菌株和其它菌株草酸分泌量差异极显著，其余供试菌株间差异不显著；同样，小核盘菌中，除8号菌株外，其余9份菌株间差异不显著。核盘菌和小核盘菌草酸分泌量平均值比较结果表明核盘菌草酸分泌量的平均值为27.67μg/mg，而小核盘菌的平均值仅为18.91μg/mg，且二者差异呈现极显著水平(图4)。 12向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究图4向日葵核盘菌和小核盘菌草酸分泌量平均值的比较Fig.4ThecomparisonofS.sclerotiorumandS.minoronOAsecretion2.3.4核盘菌和小核盘菌多聚半乳糖醛酸酶活力的比较PG酶测定的结果表明核盘菌中PG酶活力最高的是4号菌株（30.03U/mg），10号菌株的活力最低（24.91U/mg）；而小核盘菌中8号菌株的酶活力最高，其酶活力值为22.70U/mg，最低是7号菌株，其值为20.51U/mg。显著性测定结果表明核盘菌和小核盘菌菌株间PG酶活力水平差异都比较大。核盘菌和小核盘菌PG酶活力平均值的比较结果表明，核盘菌PG酶活力的平均值为26.87U/mg，而小核盘菌的平均值为21.58U/mg，两者在P<0.05水平上存在显著性差异（图5）。图5核盘菌和小核盘菌PG酶活力平均值的比较Fig.5ThecomparisonofS.sclerotiorumandS.minoronPGenzymesactivity 内蒙古农业大学硕士学位论文132.3.5核盘菌和小核盘菌致病力的比较通过离体接种叶片的方法测定核盘菌和小核盘菌不同菌株的致病力结果如附表1所示。供试的核盘菌菌株中，4号菌株的致病力最高，病斑直径为3.65cm，而1号菌株的致病力最低，病斑大小为2.68cm。显著性测定结果表明，核盘菌供试的10株菌株中，1号菌株和其它9份菌株差异呈现极显著水平，而4号、6号和7号菌株之间以及剩余的6株菌株间的差异均不显著，但是这两组菌株间差异显著。对于小核盘菌菌株，1号菌株致病力最强，病斑直径为2.30cm，而5号菌株的病斑直径最小仅为1.21cm。显著性分析结果表明1号和5号菌株的致病力和其它菌株存在极显著差异。而2、3、4号菌株间，6、7、10号菌株间，以及8号和9号菌株间的差异不显著，而这几组菌株间的差异呈现显著水平（图6）。同样，核盘菌和小核盘菌菌株的致病力平均值的测定结果表明，核盘菌菌株的病斑平均直径为3.1cm，而小核盘菌菌株病斑直径的平均值仅为1.7cm，且二者差异呈现极显著水平（图6）。图6核盘菌和小核盘菌代表菌株致病力的比较Fig.6ThepathogenicitycomparisonofS.sclerotiorumandS.minorisolates2.4结论与讨论菌核病是严重危害向日葵生产的主要病害，而核盘菌是其主要的致病菌。小核盘菌是核盘菌的近缘种，同样能够引起向日葵菌核病的发生。小核盘菌同样也能够感染很多重要经济作物，如莴苣、花生、油菜等。李敏于2015年在我国向日葵上发现了小核盘菌，这是我国首次有关向日葵小核盘菌的报道[27]。目前国外有关小核盘菌文章主要集中在从不同寄主上发现小菌核并对小核盘菌菌株种群遗传多样性及生物防治进行研究。同一地块中核盘菌和小核盘菌比较研究还未见有相关的报道。本研究对采集于内蒙古乌兰察布市白音查干高家地同一地块中的核盘菌和小核 14向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究盘菌的生物学特性和致病力进行了比较研究，发现核盘菌和小核盘菌菌的落形态存在差异，核盘菌的白色菌丝较为稀疏，在培养基边缘形成整齐排列的环状的椭圆形的黑色菌核颗粒；而小核盘菌的菌丝较为致密，在培养基的表面能够形成形状不规则的单粒或多粒的黑色米粒大小的菌核。在菌丝生长速率方面，尽管核盘菌的菌株的生长速度平均值显著高于小核盘菌菌株，但是各自菌株间生长速率没有显著差别。而核盘菌和小核盘菌关键致病因子的平均值测定结果表明核盘菌OA分泌量以及PG酶的活性整体水平显著高于小核盘菌，预示着二者的遗传背景不同可能是导致上述结果出现的主要原因。但是供试的核盘菌以及小核盘菌的群体内菌株在上述测定的指标上出现的显著性差异的原因可能是环境因素所导致。这一结果和Ozer报道的来自于菊芋的29个核盘菌被分到16个MCG亲和组，而64个小核盘菌被分成7个MCG亲和组，但是核盘菌和小核盘菌的同一亲和组中都存在致病力分化现象的结果相一致[74]。已有的研究结果表明核盘菌和小核盘菌均在生菜上引起腐烂症状，但是，由核盘菌侵染所致的发病株率明显高于小核盘菌[64]。也有研究者在温室条件下比对了核盘菌和小核盘菌接种后向日葵盘腐的发生情况，结果表明核盘菌引起盘腐的发病率同样明显高于小核盘菌，这些研究结果与本研究中在向日葵离体叶片上测定的核盘菌的致病力高于小核盘菌相一致。说明不论是何种寄主，核盘菌的致病力都要明显高于小核盘菌。这也许是在田间能够观察到由核盘菌侵染引起的根茎腐、茎腐、盘腐以及叶腐症状，而小核盘菌侵染向日葵只观察到了根茎腐的症状的原因之一。在上述测定各个指标中，草酸分泌量和多聚半乳糖醛酸酶的活力一直被认为是反映核盘菌致病力的两个关键因子[75]。草酸对致病力的贡献表现在多个方面如能够创造酸性环境、螯合Ca2+和影响Ca2+信号转导、抑制活性氧，产生毒素等[76]；而PG酶是细胞壁降解酶，能够破坏细胞的结构，降解寄主组织以达到为自己提供营养的目的。但是由于PG酶是酸性酶，因此，其酶活性最大发挥需要核盘菌分泌草酸降低侵入位点pH水平，从而使得PG酶的活性最大化[44]。有关这两个关键致病因子和致病力相关性的研究已有很多报道，如刘春来等人对44株核盘菌进行MCG亲和分组的研究结果表明OA分泌量和致病力呈现显著正相关关系[77]。然而，也有报道认为这两个致病因子和致病力没有一定的相关性，如李永红[78]等人对不同寄主上得到的核盘菌进行研究结果表明其致病力与产生草酸的能力不完全相关。本研究中，我们基于10株核盘菌以及10株小核盘菌本的数据初步进行了这两个关键致病因子和致病力相关性进行分析，结果表明不论是核盘菌还是小核盘菌群体中，OA分泌量以及PG酶活力和菌株的致病力没有任何的相关性。因此，还需在后续的试验中用向日葵核盘菌和小核盘菌群体中大量的样本进行测定，以期证明同一地块中的向日葵核盘菌以及小核盘菌的关键致病因子和致病力之间是否存在一定的相关性。 内蒙古农业大学硕士学位论文1534℃低温处理对核盘菌和小核盘菌致病力的影响3.1材料3.1.1供试材料与菌株向日葵核盘菌菌株和小核盘菌菌株采集自内蒙古乌兰察布白音察干镇高家地的同一地块中。向日葵品种：LD5009（食葵杂交种）3.1.2供试培养基（1）PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水定容至1000ml。（2）MM培养基：（Minimal-medium）：1gNaOH、3gDL-malicacid、2gNH4NO3、0.1gMgSO4.7H2O、39gBacto-agar、蒸馏水1000ml、PH调为4.8。（3）PDB培养液：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，加水定容至1000ml。3.2方法3.2.1向日葵核盘菌和小核盘菌的分离纯化具体方法参见章节2.2.1.3.2.2核盘菌和小核盘菌的低温处理的方法将分离纯化后的核盘菌和小核盘菌置于23℃PDA平板上培养两天后，用直径为5mm的打孔器在PDA平板上的菌落边缘位置切取菌丝块，然后接种于新的PDA平板上，分别置于4℃和23℃条件（对照）进行培养。当对照菌株的菌落长至满皿时，取出4℃培养的核盘菌和小核盘菌的培养物，菌落边缘打取菌饼后进行后续的相关实验。3.2.3向日葵核盘菌和小核盘菌菌株菌丝生长速度测定具体方法参见章节2.2.2。每个菌株设置3个重复测定菌丝生长速度。3.2.4向日葵核盘菌和小核盘菌菌株草酸分泌量测定具体方法参见章节2.2.3。每个菌株设置3个重复测定草酸分泌量。3.2.5向日葵核盘菌和小核盘菌菌株多聚半乳糖醛酸（PG酶）活力测定具体方法参见章节2.2.4。每个菌株设置3个重复测定PG酶活力。3.2.6向日葵核盘菌和小核盘菌致病力测定在23℃条件下生长的核盘菌和小核盘菌菌株满皿后，将经过4℃处理后的核盘菌 16向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究和小核盘菌菌株取出，同时接种在MM培养基上，23℃恒温培养3d后接种到离体叶片上对核盘菌和小核盘菌的致病力进行测定。具体测定参见章节2.2.5。每个菌株设置5个重复测定致病力。3.3结果与分析3.3.14℃低温处理后的核盘菌和小核盘菌的菌丝生长速率比较23℃处理4℃处理核盘菌（5号）小核盘菌(3号)图74℃处理后核盘菌和小核盘菌代表菌株菌丝生长速度的比较Fig.7TheComparisonofS.sclerotiorumandS.minorrepresentativeStrainsofMycelialGrowthRateafterTreatmentat4℃图84℃处理后核盘菌和小核盘菌菌株平均生长速率的比较Fig.8ThecomparisonofS.sclerotiorumandS.minoronhyphalgrowthspeedafterTreatmentat4℃ 内蒙古农业大学硕士学位论文17核盘菌和小核盘菌菌株经过4℃低温处理后，置于23℃条件下培养2天后菌丝生长速率的比较结果如图7所示。核盘菌和小核盘菌菌株在23℃培养条件下生长2天的菌落的平均直径为6.95cm和5.02cm，而经过4℃处理后的核盘菌和小核盘菌菌株的菌落直径平均值为8.07cm和6.69cm。经过4℃处理后的供试菌株在23℃条件下菌丝的生长速度明显的增加，并在0.05水平上具有显著性差异（图8），表明4℃低温预处理能够加快核盘菌和小核盘菌菌丝体的生长速度。3.3.24℃低温处理后的核盘菌和小核盘菌草酸含量的比较如图9所示，经过4℃低温处理后核盘菌和小核盘菌的草酸分泌量的平均值分别为32.73μg/ml和27.32μg/ml，而23℃正常培养条件下相应菌株的草酸分泌量平均值分别为27.69μg/ml和20.63μg/ml，因此，经过4℃处理后的核盘菌和小核盘菌菌株的草酸分泌量明显高于23℃生长条件下分泌量，且二者在0.05水平上差异显著。图94℃处理后核盘菌和小核盘菌草酸分泌量平均值的比较Fig.9ThecomparisonofS.sclerotiorumandS.minoronOAsecretionafterTreatmentat4℃3.3.34℃低温处理后核盘菌和小核盘菌多聚半乳糖醛酸酶（PG）活力的比较经过4℃处理后，向日葵核盘菌和小核盘菌菌株PG酶活力测定的结果如图10所示，核盘菌和小核盘菌菌株PG酶活力的平均值分别为26.37U/mg和24.54U/mg，而23℃正常培养条件下核盘菌和小核盘菌菌株PG酶活力的平均值分别为22.56U/mg和21.57U/mg，且二者在0.05水平上差异显著。表明4℃低温处理后能够提高核盘菌和小核盘菌PG酶的活力。 18向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究图104℃处理后核盘菌和小核盘菌PG酶活力平均值的比较Fig.10ThecomparisonofS.sclerotiorumandS.minoronPGenzymesactivityafterTreatmentat4℃3.3.44℃低温处理后核盘菌和小核盘菌致病力的比较向日葵核盘菌和小核盘菌的致病力测定结果如图11所示，经过4℃处理后的核盘菌和小核盘菌菌株接种到离体叶片上形成的病斑平均直径为3.34cm和2.43cm，而23℃培养条件下核盘菌和小核盘菌菌株接种后病斑的平均直径为2.57cm和2.08cm。因此，经过4℃处理后的核盘菌和小核盘菌菌株的致病力明显高于正常条件下培养的核盘菌和小核盘菌菌株，且二者在0.05水平上均存在显著差异。4℃处理23℃处理CK核盘菌（M5）小核盘菌(S3)图114℃处理后核盘菌和小核盘菌代表菌株致病力的比较Fig.11ThepathogenicitycomparisonofS.sclerotiorumandS.minorRepresentativeIsolatesafterTreatmentat4℃3.4结论与讨论通过对采集自内蒙古乌兰察布市白音查干高家地同一地块中的核盘菌和小核盘 内蒙古农业大学硕士学位论文19菌株进行4℃低温处理后，对其菌丝的生长速度、草酸含量、PG酶活力和致病力进行了测定，发现供试菌株经过4℃低温处理后，菌丝的生长速度明显加快，草酸的分泌量增加，PG酶活力也增高，致病力相应的也增强。说明低温处理能够显著的加速核盘菌以及小核盘菌生长以及提高菌株在寄主上的致病力。已有的研究结果表明，核盘菌的菌核容易在低温条件下萌发形成子囊盘。如杨谦等人通过对不同的温度下核盘菌的菌核萌发进行了研究，发现不同的菌株对低温处理的反应不一样。在不经过低温处理的条件下，有的菌核能够萌发形成子囊盘[79]。余秋玉[12]等人对秋季采集核盘菌的菌核进行室内诱导研究，发现在20、25、30℃条件下，菌核的萌发时间较早且萌发率高于放置在4、10、15℃下形成的菌核，说明菌核的形成时较高的温度有利于菌核后续的萌发；且这些菌核不需要经过低温诱导处理同样能够形成子囊盘。目前，有关温度对菌核的萌发和子囊盘的形成影响的较多，但是有关温度对核盘菌和小核盘菌的致病力影响的研究的相关报道非常少见。由于我们采集的向日葵的小核盘菌的地点都位于阴山北麓高海拔的冷凉地区，夏季温度偏低，因此，这一地区向日葵盘腐发生严重的现状可能和这一地区相对低的夜间温度导致菌核容易萌发形成子囊盘，且其致病力也相应的高于23℃条件下的核盘菌有相关性。这一推测和李国庆等人在湖北省海拔相对较高，低温持续的时间长的的西部和西南地区发现油菜小核盘菌现象有一定的相似性[34]。草酸和PG酶作为核盘菌致病力的两个重要的致病因子，许多学者对其进行了细致的研究，也有大量的相关报道。如李玉芳[80]利用菌丝体悬浮液接种油菜抗感品种的叶、茎、花及白菜和甘蓝的叶和茎，发现不同抗性品种的叶、茎、花接种5-30分钟总体呈现出PE酶活力远大于PG酶活力；接种白菜和甘蓝的叶、茎后其草酸含量呈现出急剧上升的趋势。Marciano[81]等发现无论是强致病力菌还是低致病力菌株都能够利用寄主细胞壁中的成分作为自己的营养来源，但是不同菌株间的草酸分泌量具有很大的差异。弱毒菌株的草酸合成能力较低，其致病力相应的也低。本研究在4℃低温处理后发现向日葵核盘菌和小核盘菌的菌丝生长速度，草酸的分泌量以及PG酶的活力相比正常培养条件下都有所增高，且呈现出显著的差异一。其中小核盘菌菌株草酸分泌量的变化较核盘菌更为明显，但在致病力方面，4℃处理后的核盘菌和小核盘菌菌株致病力增加幅度比小核盘菌更为明显。因此，4℃低温能够显著提升核盘菌和小核盘菌的致病力的机制还需要进行更多的实验来给出明确的答案。 20向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究4单株向日葵上小核盘菌群体的亲和分组4.1材料4.1.1供试材料与菌株本实验所用的向日葵小核盘菌采集于内蒙古乌兰察布市四子王旗红旗滩、德胜沟、乌拉太、公合成地块中单个发病向日葵植株上.每个病株上采集的小菌核构成一个单独的测试群体。经纯化后菌核置于1.5ml离心管中4℃保存。表1内蒙古乌兰察布市不同地点单株向日葵小核盘菌来源一览表Table1OriginofdifferentsclerotiniaminorisolatesfromsinglesunflowerinWulanchabu，InnerMongolia地点编号样本数TX130乌兰察布市-四子王旗-大黑河-红旗滩-同穴TX230乌兰察布市-四子王旗-德胜沟DSG30乌兰察布市-四子王旗-乌拉太WLT30GHC130GHC230GHC330乌兰察布市-四子王旗-公合成GHC430GHC530GHC6304.1.2供试培养基（1）PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水定容至1000ml。（2）MM培养基：（Minimal-medium）：1gNaOH、3gDL-malicacid、2gNH4NO3、0.1gMgSO4.7H2O、39gBacto-agar、蒸馏水1000ml、调PH为4.8。（3）PDB培养液：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，加水定容至1000ml。4.2方法4.2.1向日葵小核盘菌的分离纯化具体方法参见章节2.2.1. 内蒙古农业大学硕士学位论文214.2.2菌丝亲和群（MCG）测定将选定的小核盘菌菌株在PDA平板上活化，当菌落直径约为3cm时，用直径为5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌丝块，转接到新的PDA平板上。每个平板上成三角状接种来自2个菌株的3个菌丝块，其中两个菌丝块来自同一个菌株，第三个菌丝块来自另一个菌株（三个菌丝块有两个来自同一菌株，做自体亲和，另一个做菌株间亲和）。30个菌株两两随机组合，置于23℃～25℃恒温培养。7d后观察各个培养皿中的菌落交汇处的反应线，记录各菌株的亲和情况。当两个菌落的交汇处没有出现坏死线或空白带或在交汇处形成一条隆起的白色菌丝带且有菌核产生在菌丝带上，两个菌株为亲和型；当两个菌落的交汇区产生一条明显的坏死带或空白带时为不亲和型。每次融合群测定设置3个重复。4.3结果与分析4.3.1向日葵小核盘菌菌丝体亲和群的划分按照供试菌株在PDA平板上培养7天后配对的结果，将菌丝亲和分组划分为三种类型，即完全亲和、不完全亲和和非亲和。菌株间菌丝生长能够融合在一起为亲和型；有的菌丝之间形成明显的界限为不亲和型；有的菌落两个菌块直接能够亲，但是其中一个菌块和其它两个菌块直接出现不亲和的反应，则划定为不完全亲和型（图12）。图12Sclerotiniaminor菌丝亲和表型示意图Fig.12PhenotypeofmyceliacompatibilityofSclerotiniaminor 22向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究4.3.2同一病株上向日葵小核盘菌菌丝亲和分组测定结果表2菌丝亲和分组结果统计表Table2ResultsofMyceliaCompatibilityGroupingMCG1MCG2MCG3MCG4TX126310TX223340DSG25500WLT181020GHC121630GHC222530GHC322710GHC424600GHC519821GHC623430图13不同地区同一病株上向日葵小核盘菌亲和分组结果Fig.TheClassificationofMCGsgroupsofSclerotiniaminorfromsinglesunflowerinseedrapestem同一病株上向日葵小核盘菌菌丝亲和分组结果如表2所示。每个采样点的单株上采集的小核盘菌菌株均可以被划分为多个菌丝亲和分组。来自德胜沟和公合成4号的单株样本DSG和GHC4中小核盘菌菌株被划分为2个菌丝亲和组；而采集自公合成的5号单株样本（GHC5）中小核盘菌菌株被划分为4个亲和组。其余7个单株样本都被划分为3个菌丝亲和组。供试的10个单株群体中，除了来自乌拉太（WLT）的样本中MCG1分组中包含了18份菌株，公合成5号（GHC5）的MCG1中包含了19份样本，其余8份样本中MCG1组中包含的菌株数均超过20株，占比超过供试菌 内蒙古农业大学硕士学位论文23株总数的66.7%。采集自四子王旗红旗滩同穴的两个向日葵单株（TX1和TX2）上分离得到的小核盘菌菌株都被划分为3个亲和组中，每个亲合组中菌株个数基本接近。来自公合成同一地块中的6个向日葵单株上的样本，除了GHC5只有2个亲合组外，其余5份样本均被划分为3个亲合组，MCG1均为优势亲合组，占比介于63.3%～80.0%（图13）。4.4结论与讨论许多学者已经被证明菌丝体亲和分组可以作为评价小核盘菌种内遗传多样性的一种有效的方法。如Kohn[58]等人在MP培养基上采集自欧洲油菜上的63核盘菌菌株进行菌丝亲合群的测定，并通过分子标记的方法证实了每个菌丝亲和群在遗传上的一致性。本研究对来自4个不同地点的10个单株向日葵上分离得到的小核盘菌群体进行了菌丝亲和群研究，发现来自公合成同一地块中的6个病株上小核盘菌群体中5个群体可以被划分为3个亲合组，1个群体中只有2个亲合组，且6份样本中MCG1均为优势亲和群。采自四子王旗红旗滩同穴的两个向日葵单株的小核盘菌群体均被划分为3个亲和群，同样MCG1也是优势亲和群，分别占比为86.7%和76.7%。这两个样本群体尽管是从同一个穴中两个植株上分离得到，亲合组中包含的样本数仍然存在一定的差异，预示着小核盘菌上存在一定的遗传变异。这一结果和张丽艳对孝感郊区的一个田块中分离得到的核盘菌不同菌株间亲和群测定结果即小的区域内寄主植物上分离得到的菌株之间存在着亲和群的多样性，同时，同一个茎杆上的病斑可能是由于两种病原菌复合侵染所造成结果相一致[82]。然而供试的10个单株群体中均被划分为3个亲合组，而MCG1均为优势亲合组的结果也说明同一病株上的小核盘菌尽管存在一定的变异，但变异程度相对较低。 24向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究5向日葵小核盘菌的遗传多样性的研究5.1材料5.1.1供试菌株向日葵小核盘菌菌株采集自内蒙古包头市、呼和浩特市、乌兰察布市向日葵种植地块，菌核的采集地点及样本数如图14和表3所示。图14采样地点Fig.14SitesofIsolatesCollection表3内蒙古地区不同地点向日葵小核盘菌来源一览表Table3OriginofdifferentsclerotiniaminorisolatesfromsunflowerfieldinInnerMongolia采集地点地点编号样本数内蒙古-包头市-达茂旗-乌克镇WKJ6内蒙古-包头市-达茂旗-乌克新村WKXC9内蒙古-包头市-达茂旗-红格尔塔拉种羊试验地DMQ10内蒙古-呼和浩特市-武川上邑村ASYC-A15内蒙古-呼和浩特市-武川上邑村BSYC-B10内蒙古-乌兰察布市-察右中旗-西圪旦ABYS30内蒙古-乌兰察布市-察右中旗-西圪旦BZQ15内蒙古-乌兰察布市-察右中旗-土城子SCD5内蒙古-乌兰察布市-白音查干镇-高家地GJD105.1.2供试培养基（1）PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水定容至1000ml。 内蒙古农业大学硕士学位论文25（2）MM培养基：（Minimal-medium）：1gNaOH、3gDL-malicacid、2gNH4NO3、0.1gMgSO4.7H2O、39gBacto-agar、蒸馏水1000ml、调PH为4.8。（3）PDB培养液：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，加水定容至1000ml。5.2方法5.2.1向日葵小核盘菌的分离纯化具体方法参见章节2.2.1.5.2.2向日葵小核盘菌的亲和分组（MCG）的测定方法具体方法参见章节3.。每个菌株的亲和鉴定均设置3个重复。5.2.3同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌菌丝生长速度测定具体方法参见章节2.2.2。每个菌株设置3个重复测定菌丝生长速度。5.2.4同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌菌核干重的测定将小核盘菌菌核接种于直径为9cm的PDA平板中，待其长出新鲜菌丝后用打孔器打取生长速度一致的边缘菌丝接种于新的PDA平板中间位置，培养10d后，挑取培养皿中的全部菌核，晾干后测量称量每皿中菌核的重量，每个菌株设置三个重复。计算每个菌株菌核的平均干重。5.2.5同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌草酸分泌量测定具体方法参见章节2.2.3。每个菌株设置3个重复测定草酸分泌量。5.2.6同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌PG酶活力测定具体方法参见章节2.2.4。每个菌株设置3个重复测定PG酶活力。5.2.7同一MCG组内和不同MCG组间小核盘菌致病力的测定具体方法参见章节2.2.5。5.2.8不同MCG组内小核盘菌菌株Inv-和Inv+交配型分布频率的测定小核盘菌交配型基因MAT1-1-F/MAT1-1-R（Inv-）和TypeⅡF/TypeⅡR（Inv+）的引物序列参照Chitrampalam[83]发表的文章，序列如下MAT1-1-F：5’-ATACAGCCACTTACCTACCATACAGC-3’MAT1-1-R：5’-TCTGAGTGGAAGCAATGTGTTGTG-3’TypeⅡF:5’-CCGTTTAAGGGAAATCCAGA-3’TypeⅡR:5’-CGTGCATCCAAGAAGACGC-3’ 26向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究PCR反应体系为25μL，各成分的体积见下表PCR扩增体系ReactionsystemusedforPCRreaction体系成分体积病原菌DNA2μL10×TaqBuffer2μLdNTP（2.5mmol/L）2μLMAT1-1-F/TypeⅡF1μLMAT1-1-R/TypeⅡR1μLTaq酶（5U/μL）0.2μLddH2O16.8μL总体积12μLPCR扩增条件：（1）95℃变性10min；（2）95℃变性30s；（3）60℃退火30s；（4）72℃延伸90s；（2）～（4）35个循环；最后72℃延伸10min。凝胶电泳检测PCR产物。MAT1-1-F/MAT1-1-R（Inv-）和TypeⅡF/TypeⅡR（Inv+）分别能够扩增出673bp和1250bp大小的单一片段。按照国际上已有的鉴定标准，如果分别扩增出单一片段就鉴定为Inv-或Inv+型；如果能用两对引物同时扩增出两个片段，说明鉴定菌株是杂合型(Inv-/Inv+)；如果用两对引物扩增不出片段，确定为NotDetected。5.3结果与分析5.3.1向日葵小核盘菌的亲和分组的结果内蒙古包头市、呼和浩特市、乌兰察布市向日葵种植地块采集的110份小核盘菌菌株的亲和分组结果如图15、16所示。110份菌株样本被划分为14个亲和组。MCG1、MCG2、MCG3、MCG4、MCG5每个亲和组都包含了10份以上的菌株，共包含了92份供试菌株，占供试菌株总数的83.6%。14个亲合组中，MCG1组最大，包含了32份菌株，占供试菌株的29%。有5个亲合组只包含了1份菌株。如果按照采集地点来看，每个采样地点的小核盘菌至少被分为3个亲和组，其中采集自察右中旗西圪旦同一地块的30个菌株分别被划分在7个不同的MCG分组中，预示着这一地块中的小核盘菌可能具有较高的变异水平。同时，乌兰察布市察右中旗土城子的小核盘菌的样本数只有5份，但却被分到了4个不同的MCG亲和组中，预示着这一地块中的小核盘菌也具有较高的变异水平。 内蒙古农业大学硕士学位论文27图15不同地点菌株亲和分组情况Fig.15CompatibilityofIsolatesamongStrainsofSclerotiniaminorindifferentsunflowerfield图16不同地点的菌株在亲和组中分布情况Fig.16Distributionofstrainsindifferentsunflowerfieldinmyceliumaffinitygroup5.3.2不同MCG组间菌株的生物学特性和致病力比较5.3.2.1菌丝生长速度的比较对上述14个亲和组中包含10个菌株以上的5个MCG组组间的菌丝生长速度进行测定的结果表明，不同的亲和组的菌落直径的平均值范围介于5.11cm（MCG4）到6.16cm（MCG1）之间。其中，MCG1组菌丝的平均生长速度最快，菌落直径平均值为6.16cm，其次为MCG2分组，菌落直径平均直径为5.59cm，MCG4分组菌株的菌丝的生长速度最慢。 28向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究5.3.2.2菌核形成数量的比较对上述14个亲合组中包含10个菌株以上的5个MCG分组组间的菌核干重进行比较结果如表5，MCG分组间的菌核形成量没有明显的差异，平均值在0.15g上下浮动。5.3.2.3OA分泌量的比较对上述14个亲和组中包含10个菌株以上的5个MCG组组间的草酸分泌量进行测定的结果表明，MCG2分组草酸分泌量最高，平均值为26.24μg/mg，与其他MCG3组和MCG4组差异显著。5.3.2.4PG酶活力的比较对上述14个亲和组中包含10个菌株以上的5个MCG组组间的多聚半乳糖醛酸酶活力进行测定结果如表5，5个MCG分组间多聚半乳糖醛酸活力没有显著性差异，PG酶活力平均值介于24.09U/mg（MCG4）到24.37U/mg（MCG2）之间。5.3.2.5致病力的比较表4向日葵小核盘菌生物学特性各项指标的测定结果Table4ThecomparasiononthebiologicalcharateristicsofS.minorisolates生长速率/cm*（48h）-1菌核形成量（g）草酸/μg·mg-1PG酶活力/U·mg-1病斑直径/cmMCG16.16±1.86a0.1475±0.06a25.99±3.28ab24.18±3.44a24.00±7.28aMCG25.59±1.26b0.1482±0.07a26.24±3.01a24.37±3.30a24.34±4.59aMCG35.21±0.83b0.1582±0.02a24.79±1.30c24.29±3.11a25.11±4.30aMCG45.11±1.11b0.1572±0.03a25.00±2.07bc24.09±2.68a24.93±3.89aMCG55.28±1.22b0.1567±0.03a25.56±2.70abc24.17±2.25a23.91±4.34a采用离体叶片接种法对供试的110个向日葵小核盘菌进行菌丝亲和分组后，包含10个菌株以上的5个MCG分组组内和组间的致病力进行测定，接种48h后，不同菌丝亲和组间小核盘菌在向日葵离体叶片上形成的坏死病斑结果如表5，5个MCG分组组间的病斑直径平均值在23.91mm到25.11间，组间差异不显著。5.3.3同一MCG组内菌株的生物学特性和致病力比较5.3.3.1菌丝生长速度的比较MCG1分组中生长最快的菌株是BYX11和WKXC6，菌落直径的平均值为 内蒙古农业大学硕士学位论文297.70cm，菌丝生长速度最慢的是SYCA15，菌落直径平均值为4.3cm。显著性测定结果显示，MCG1和MCG2组内菌株生长速度存在显著性差异（P＜0.05），MCG3和MCG5组内菌株生长速度也存在差异，但显著性不及上两个分组，MCG4组内除了SYCB5和SYCB6与其他10个菌株有显著差异外，和其他菌株差异不明显。5.3.3.2菌核形成数量的比较供试的92个菌株中，干重最高的是BYS24，平均值为0.22g，干重最低的是DMQ6，平均值为0.09g，均来自MCG2分组；其中有86个菌株的平均干重在0.13g以上，31个菌株的平均干重在0.13-0.15g之间，有两个菌株WKXC-6，和BYS24的菌核干重超过0.2g，为0.21g和0.22g；仅有1个菌株DMQ6的菌核干重平均值低于0.1g，为0.09g。5.3.3.3OA分泌量的比较MCG1分组中草酸分泌量最高的为BYS28，平均值为29.28μg/mg，草酸分泌量最低的为WKXC-6，平均值为22.89μg/mg且这两个菌株与其他菌株之间存在显著性差异，其余菌株差异不显著；MCG2分组中，BYS29和SYCB8的草酸分泌量平均值分别为29.01μg/mg和28.93μg/mg，与16个菌株具有显著性差异，GJD7的草酸分泌量平均值为23.23μg/mg，与其他菌株差异性显著，剩余菌株差异不显著。MCG3分组中WKZ1和GJD2的草酸分泌量平均值为25.82μg/mg和25.81μg/mg和L37、SYCB3和WKZ6的草酸分泌量平均值为23.98μg/mg、23.96和23.48μg/mg具有显著性差异，其余菌株差异不显著；MCG4分组中GJD5、ZQ1和ZQ23的草酸分泌量平均值为26.93μg/mg、26.82μg/mg和26.64μg/mg，与其他菌株具有显著性差异，SYCB6和WKZ5的草酸分泌量平均值为22.93μg/mg，与其他菌株差异性显著，剩余7菌株之间没有显著性差异。MCG5分组中，SYCA12和SYCB2的草酸分泌量平均值为28.28μg/mg和27.97μg/mg，与其他8个菌株具有显著性差异，ZQ34、ZQ33和SYCB10的草酸分泌量平均值为24.16μg/mg、23.83μg/mg和23.44μg/mg，与其他菌株存在显著性差异，剩余5个菌株之间没有显著性差异。5.3.3.4PG酶活力的比较供试菌株中BYS28的多PG酶活力最高平均值为27.63U/mg，BYS20的PG酶活力最低仅为21.06U/mg。MCG1分组中，PG酶活力在21.17U/mg和27.63U/mg之间，BYS28的PG酶活力平均值最高，与其他菌株具有显著性差异，MCG2组中，BYS27的多PG酶活力平 30向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究均值为27.54U/mg，与其他菌株在0.05水平差异显著，BYS3、SYCA8、GJD7和BYS20之间没有显著差异，但与其他菌株差异性显著。MCG3组中，ZQ13的PG酶活力平均值为27.41U/mg，与其他菌株差异显著，WKZ1和ZQ27多PG酶活力平均值为26.44U/mg和26.4U/mg，与其他菌株具有显著性差异，SCD4和WKZ6PG酶活力最低，其余菌株之间差异不显著。MCG4组中ZQ1和ZQ5的PG酶活力平均值为26.78U/mg和26.19U/mg，与其他菌株之间差异显著，WKZ3、WKZ5和ZQ4之间没有显著性差异，与其他菌株差异显著，剩余菌株之间在0.05水平没有显著性差异。MCG5分组中BYS17和ZQ33与其他菌株具有显著性差异，其余菌株差异不显著。5.3.3.5致病力的比较不同组内所不同菌株形成的坏死病斑直径存在一定的差异性。MCG1分组中的菌株致病力测定结果如图17，GJD9、BYS22和DMQ7的病斑直径平均值在29mm以上，与其他菌株之间差异性显著，BYS19的病斑最小，病斑直径平均值为16.73mm，其余供试菌株接种后形成的病斑直径在二者之间，病斑大小在0.05水平呈现出一定的显著性。图17MCG1组小核盘菌菌株致病力的比较Fig.17ThepathogenicitycomparisonofS.minorisolatesfromMCG1接种48h后，对MCG2组内不同小核盘菌菌株在向日葵离体叶片上形成的坏死病斑大小测定，结果如图18，除了SYCA8菌株形成的病斑直径为19.75mm，其余菌株形成的病斑直径都在20mm以上，BYS29菌株形成的病斑直径最大为28.5mm，与其他菌株在0.05水平上存在显著差异，WKXC1菌株形成的病斑直径为25.63mm，其余菌株形成的病斑直径在三者之间，菌株间差异不显著。 内蒙古农业大学硕士学位论文31图18MCG2组小核盘菌菌株致病力的比较Fig.18ThepathogenicitycomparisonofS.minorisolatesfromMCG2接种48h后，对MCG3组内不同小核盘菌菌株在向日葵离体叶片上形成的坏死病斑大小测定，结果如图19，ZQ13菌株在向日葵离体叶片上形成的病斑最大，直径为29.42mm，与除ZQ17（28.33mm）的其余菌株存在显著差异，WKZ6菌株形成的病斑最小，直径为20.94mm，剩余菌株形成的病斑直径范围在二者之间，菌株之间差异不明显，但相互之间存在一定的差异。图19MCG3组小核盘菌菌株致病力的比较Fig.19ThepathogenicitycomparisonofS.minorisolatesfromMCG3 32向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究采用离体叶片接种法对MCG4组中的12个小核盘菌菌株和MCG5分组中的10个小核盘菌菌株进行致病力测定结果如图20和图21，MCG4组中小核盘菌菌株在向日葵离体叶片上形成的病斑直径范围在21.05mm到27.82mm之间，其中SYCB6和WKZ5与其他菌株在0.05水平上差异显著，其余菌株差异不显著。MCG5分组中SYCA12和SYCB2形成的病斑直径为27.29mm和27.25mm，与除了SYCA4（25.19mm）的其他菌株在0.05水平差异显著，ZQ33菌株形成的病斑直径为19.57mm，与除了BYS-17（21.36mm）的其他菌株具有显著差异，其余菌株之间差异不显著。图20MCG4小核盘菌菌株致病力的比较Fig.20ThepathogenicitycomparisonofS.minorisolatesfromMCG4图21MCG5小核盘菌菌株致病力的比较Fig.21ThepathogenicitycomparisonofS.minorisolatesfromMCG4 内蒙古农业大学硕士学位论文335.3.4小核盘菌菌株Inv-和Inv+分布频率的测定通过利用小核盘菌特异引物MAT1-1-F/MAT1-1-R和Type-ⅡF/Type-ⅡR[74]对挑选出的5个亲和分组中的92个小菌核的配位型基因的分布频率进行了鉴定，结果表明供试的92份菌株中，有37份菌株鉴定为Inv-型，有30份菌株鉴定为Inv+；此外，还有8份菌株鉴定为Inv-/Inv+型，分布在MCG1，MCG3和MCG4中；17份没有得到鉴定结果的菌株分布在MCG3,MCG4和MCG5中。整体看来，供试的92份小核盘菌群体中Inv-和Inv+的比例接近1:1。图22小核盘菌菌株Inv-和Inv+分布比例Fig.22DistributiionratioofInv-andInv+indifferentSclerotiniaminor表5不同MCG分组小核盘菌交配型测定Table5ProportionoftheMatingTypeAllelesindifferentpopulationsofSclerotiniaminorMATInv-MATInv+MATHeterokaryonNotDetectedSubtotalMCG119（59%）9（28%）4（13%）0（0%）32（100%）MCG212（48%）13（52%）0（0%）0（0%）25（100%）MCG31（8%）3（23%）2（15%）7（54%）13（100%）MCG42（17%）1（8%）2（17%）7（58%）12（100%）MCG53（30%）4（40%）0（0%）3（30%）10（100%）然而，在不同的MCG组中，Inv-和Inv+的分布频率呈现出一定的差异。MCG1中的32份菌株中，有19份为Inv-型，占总菌株数的59%，而呈现Inv+的菌株只有9份，占总菌株数的28%，Inv-和Inv+同时出现的有4份，占总菌株数的13%。MCG2分组中的25个供试菌株中，Inv-和Inv+出现的频率接近1:1，分别为12和13。MCG3中的13个供试样本中，鉴定为Inv+的菌株数为3份，占总菌株数的23%，Inv-型的只有1份样本，占总菌株数的8%，呈现Inv-/Inv+型菌株数有2份，占供试的总菌株数的15%，而Inv-和Inv+二者都没有鉴定出来的菌株数7份，占比为54%。MCG4中的12个供试菌株中，Inv-型、Inv+型、Inv-/Inv+型，未鉴定出来配位型菌株的比率为2:1:2:7。MCG5组的10个菌株中，Inv-型、Inv+型、和未鉴定出来配位型菌株 34向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究的比率接近1:1:1，没有Inv-/Inv+型的菌株。上述的结果表明在供试92份菌株中Inv-型和Inv+型比例接近1:1，呈现一个稳态的分布，而不同亲和分组交配型基因的分布频率存在较大的差异（图22）。图23MCG分组中小核盘菌菌株Inv-和Inv+分布比例Fig.23DistributiionratioofInv-andInv+indifferentMCG5.4结论与讨论本研究对采集自内蒙古地区9个地点采集的110份小核盘菌菌株进行了亲和组的测定，共划分出14个MCG组，其中有5个MCG分组只包含了1个菌株。MCG1为最大亲和组，包含来自5个地点的32份菌株，占比为29%；MCG2组中包含了7个地点的25份小核盘菌菌株，仅次于MCG1分组，占比为23%。其余亲和组包含2-10份菌株，说明内蒙古地区的向日葵小核盘菌存在着遗传多样性。同时，本研究中，同一地点的菌株最少被分到三个不同的MCG组中，最多被划分为7个不同的MCG组，这一结果和本实验室李敏[65]对来自同一地块的52个小核盘菌菌株的亲和分组结果的相一致。杨丹[63]等人将采集自湖北三个不同地点的莴苣和杂草上的95个小核盘菌菌株划分为8个不同的亲和组，其中MCG1和MCG2中包含的菌株数占总测试的菌株数的30.5%和29.5%；其中MCG1组中包含来自三个地点七个不同地块菌株，说明小核盘菌具有较高的遗传变异程度，这一结果与我们的研究结果相似。草酸和PG酶活力在核盘菌的致病过程中能够表现出一定的协同作用[83]。本研究对向日葵小核盘菌菌株的菌丝生长速度、菌核形成量，草酸含量、PG酶活力和致病力进行了测定，结果表明供试菌株之间都存在显著性差异。但不同亲和组组间除了在菌丝生长速度和草酸含量上存在一定的差异性外，其他个指标包括菌核的形成量，PG 内蒙古农业大学硕士学位论文35酶活力和致病力的差异不显著。相关性分析结果表明，草酸含量和PG酶活力呈现出正相关关系，但与致病力没有明显的相关性。这与王玉杰[84]以向日葵的核盘菌的亲和分组为单位，对MCG组中随机挑选的3个菌株作为致病力分化研究的样本得出的研究结果相一致，即表明核盘菌的草酸分泌量和PG酶活力与其致病力呈现正相关。Chitrampalam[70]在2013年首次报道在核盘菌减数分裂过程中MAT位点会出现一个3.6kb片段的反转现象，导致MAT1-1-1的等位基因丢失，从而使得核盘菌inversion-minus和inversion-plus出现的频率呈现1:1的稳态分布。这种现象于2015年[71]小核盘菌中也被检测到，如采集自美国的莴苣上的38份菌株被分为3个MAT基因型Inv+，Inv-和heterokaryon（同时包含Inv+和Inv-），每个类型分别包含3、19和16份菌株，占总菌株数的8%、50%和42%。本研究中，我们对92份菌株配位型进行了检测，发现除了Inv+，Inv-和heterokaryon外，还有一些菌株检测不到配位型基因，因此命名为NotDetected.在不同的亲和组中除了MCG1分组中，Inv-和Inv+的比率为2:1外，其它的亲合组中Inv-和Inv+出现的频率基本接近1:1。个别亲合组中如MCG3和MCG4中出现了一定比例菌株检测不到任何交配型基因的现象，这其中的原因还有待于后续的研究结果给出答案。 36向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究6结论基于上述对向日葵核盘菌和小核盘菌的研究结果，得到如下的结论：（1）内蒙古乌兰察布白音查干高家地同一地块的向日葵核盘在菌丝生长速度、草酸分泌量、多聚半乳糖醛酸酶活力的平均值均高于小核盘菌；且核盘菌在向日葵离体叶片上致病力显著的高于小核盘菌。（2）核盘菌和小核盘菌菌丝体在经过4℃处理后，菌丝生长速度、草酸分泌量和多聚半乳糖醛酸酶活力都较23℃有所提升，同时致病力也有一定的增强。（3）对采集自内蒙古乌兰察布市4个地块的10个向日葵单株上分离得到的小核盘菌进行菌丝亲和分组鉴定，结果表明来自公合成的GHC5分离得到的小核盘菌菌株被划分为4个菌丝亲和组，GHC4被划分为2个菌丝亲合组，GHC4中最大亲和组的菌株数占总菌株数的80%。GHC5中最大亲和组中的菌株数占总菌株数的63.3%。向日葵单株茎杆上分离得到的小核盘菌菌株大部分都被划分到同一个亲和分组中，但个别菌株间存在一定的差异。（4）采集自乌兰察布市四子王旗红旗滩同穴的TX1和TX2的小核盘菌菌株均被划分为3个MCG组，最大分组中包含的小核盘菌菌株个数占总菌株数的86.7%和76.7%。（5）采集自内蒙古中部地区9个地点的110份向日葵小核盘菌菌株划分为14个MCG亲和组，其中最大的MCG组包含32个菌株，占总菌株数的29.1，其中有5个分组仅由1个菌株组成，占总总分组的35.7%。MCG2分组中包含25个小核盘菌菌株，仅次于MCG1分组，但MCG2分组中包含来自7个不同地点的菌株。不同MCG分组在菌丝生长速度和草酸分泌量差异显著，但在菌核形成量、PG酶活力和致病力方面差异不显著。但不同MCG组组内各个测定指标都呈现出显著差异。（6）不同亲合组中交配型鉴定的结果表明除了MCG2组中Inv-和Inv+菌株比例为1:1外，在其它的亲合组中，Inv-和Inv+比例均偏离1:1的比例，且Inv-为优势交配型；在MCG3和MCG4分组中出现Heterokaryon菌株，而在MCG3、MCG4和MCG5分组均检测到Inv-和Inv+都没有出现的小核盘菌菌株。 内蒙古农业大学硕士学位论文37致谢三年光阴似箭、岁月如梭，伴随着论文的完成，我的硕士研究生生涯即将结束。回想过往，三年的学习生活中，对一直陪伴我成长的家人、老师、朋友和同学除了感谢，还是感谢。首先感谢我的导师赵君教授，三年来对我的关心和帮助。本论文是在赵老师的悉心指导下完成的，从论文的选题、实验的设计、论文的写作和论文的修改，无不凝聚着导师的心血。赵老师学识渊博、态度严谨、工作认真，从导师身上，我不但学习到了专业知识、还有科研的精神、做事情的态度和方法、更有为人处世的道理。在此谨向我的导师赵君老师表示我诚挚的敬意和感谢！论文的顺利完成得到了多方的支持和帮助，感谢内蒙古农业大学植物病理教研室的所有老师和同学，感谢分子植物病理实验室的所有成员，特别感谢张键师哥和张园园师姐在实验过程中对我的帮助和指导，感谢师姐杨叔青、高婧、李敏、康立茹；师哥张贵、卢兴国、徐东升；戴雅婷、田永伟、赵晓军、石胜华、侯丁一、杨剑锋、柳慧卿，在他们的关心和帮助下，我才能顺利的完成实验，谢谢大家的帮助和友谊，让我在最困难的时刻，能顺利的完成我的论文。感谢我的父母，感谢他们对我默默的付出与支持，给我无私的资助和鼓励。感谢一直以来关心我的亲人和朋友，在我迷茫无助的时候，为我排忧解难，让我不断的前进。最后，再次感谢所有关心和帮助我的人们，谢谢你们一直以来的支持、鼓励和陪伴，让我顺利的完成我的学业、衷心的感谢你们。 38向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究参考文献1BoltonMD,ThommaBP,NelsonBD.Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary:biologyandmoleculartraitsofacosmopolitanpathogen[J].MolecularPlantPathology,2006,7(1):1.2孟庆林.向日葵菌核病发生规律及防治技术研究[D].北京：中国农业科学院,20133于秀英,刘海学,张丽娟,崔云龙.向日葵菌核病研究进展[J].内蒙古民族大学学报(自然科学版),2002，24(5):467-469.4张宏.向日葵菌核病的防治技术[J].农业科技通讯,2002,31(8):34-35.5刘秋,于基成,房德纯,付晓光.向日葵菌核病菌毒素的产生及其生物活性的测定[J].沈阳农业大学学报,2001,46(6):422-425.6刘佳,张匀华,孟庆林,石凤梅,马立功,李易初,刘春来,左豫虎.黑龙江地区向日葵核盘菌致病性分化研究[J].植物保护,2016,42(1):119-124.7CubetaMA,CodyBR,KohliY,KohnLM.ClonalityinSclerotiniasclerotiorumonInfectedCabbageinEasternNorthCarolina[J].Phytopathology,1997,87(10):1000-4.8曹翠玲,刘素琪,康瑞姣,李仕河,高俊明.康氏木霉对向日葵菌核病菌拮抗作用研究[J].山西农业大学学报(自然科学版),2005,46(2):150-152.9淡建兵,孔德胤,刘双平,高飞翔,杨松,张静.河套灌区向日葵菌核病发生程度预测预报[J].中国农业气象,2012,33(1):142-147.10SaharanGS,MehtaN.Sclerotiniadiseasesofcropplants:Biology,ecologyanddiseasemanagement[M].SpringerNetherlands,2008.11刘秋,于基成,房德纯,魏守恩.向日葵菌核病的生物学特性研究[J].辽宁农业科学,2000,41(4):1-4.12余秋玉,范璇,张静,李国庆.油菜菌核病菌秋季与春季萌发菌株生物学特性的比较[J].华中农业大学学报,2015,34(5):37-41.13RejaneL.Guimarães,HenrikU.Stotz.OxalateProductionbySclerotiniasclerotiorumDeregulatesGuardCellsduringInfection[J].Plantphysiology,2004,136(3):3703-11.14刘万仁,王崇仁,吴友三.核盘菌生态型和致病性分化的研究[J].沈阳农业大学学报,1990,35(2):141-145.15李国庆.作物菌核病病原——核盘菌的多样性研究[J].植物病理学报,1997,43(2):95-96.16张蕾,余垚颖,刘勇,黄小琴,周西全,.核盘菌接种不同抗性油菜后致病力分化的研究[J].中国油料作物学报,2015,37(2):201-205.17刘勇,刘红雨,曾正宜.油菜菌核病菌系致病性研究[J].中国油料作物学报,2001,23(3):55-57. 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40向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究32HollowellJE,ShewBB,CubetaMA.WeedspeciesashostsofSclerotiniaminorinpeanutfields[J].PlantDisease,2003,87(2):197-199.33ChappellGF,ShewBB,FergusonJM.MechanismsofResistancetoSclerotiniaminorinselectedPeanutGenotypes[J].CropScience,1995,35(3):692-696.34李国庆,王道本,黄鸿章,姜道宏.小核盘菌有性阶段的诱导研究[J].植物病理学报,1996,42(4):37.35李国庆,王道本.莴苣上小核盘菌的发生为害调查及侵染循环的初步研究[J].植物保护,1994,33(6):8-10.36Garrido,P.A,Dobhal,S,Flores,F.J,rodriguez,C.G,Blough,K,Melouk,H,andGarzon,C.D.PopulationstructureandgeneticdiversityofSclerotiniaminorfrompeanutresearchplotsinOklahoma[J].Phytopathology,2011,101:S5937GodoyG,SteadmanJR,DickmanMB.UseofmutantstodemonstratetheroleofoxalicacidinpathogenicityofSclerotiniasclerotiorum,onPhaseolusvulgaris[J].Physiological&MolecularPlantPathology,1990,37(3):179-191.38LiangX,LibertiD,LiM.OxaloacetateacetylhydrolasegenemutantsofSclerotiniasclerotiorumdonotaccumulateoxalicacid,butdoproducelimitedlesionsonhostplants[J].MolecularPlantPathology,2015,16(6):559.39GodoyG,SteadmanJR,DickmanMB.UseofmutantstodemonstratetheroleofoxalicacidinpathogenicityofSclerotiniasclerotiorumonPhaseolusvulgaris[J].Physiological&MolecularPlantPathology,1990,37(3):179-191.40NoyesRD,HancockJG.RoleofoxalicacidintheSclerotinia,wiltofsunflower[J].PhysiologicalPlantPathology,1981,18(2):123-132.41MarcianoP,LennaPD,MagroP.Oxalicacid,cellwall-degradingenzymesandpHinpathogenesisandtheirsignificanceinthevirulenceoftwoSclerotiniasclerotiorum,isolatesonsunflower[J].PhysiologicalPlantPathology,1983,22(3):339-345.42Bateman,D.F.Simultaneousproductionandsynergisticactionofoxalicacidandpolygalacturonaseduringpathogenesisbysclerotiumrolfsii[J].Phytopathology,1965,55(2):204.43MagroP,MarcianoP,DiLP.OxalicacidproductionanditsroleinpathogenesisofSclerotiniasclerotiorum[J].FemsMicrobiologyLetters,1984,24(1):9-12.44FavaronF,SellaL,D'OvidioR.Relationshipsamongendo-polygalacturonase,oxalate,pH,andplantpolygalacturonase-inhibitingprotein(PGIP)intheinteractionbetweenSclerotiniasclerotiorumandsoybean[J].MolPlantMicrobeInteract,2004,17(12):1402-1409.45LivingstoneDM,HamptonJL,PhippsPM.EnhancingresistancetoSclerotiniaminor 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42向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究58KohnLM,StasovskiE,CarboneI.MycelialincompatibilityandmolecularmarkersidentifygeneticvariabilityinfieldpopulationsofSclerotiniasclerotiorum[J].Phytopathology,1991,81(4):480-485.59OsofeeH,HameedKM,MahasnehA.RelatednessAmongIndiginousMembersofSclerotiniasclerotiorumbyMycelialCompatibilityandRAPDAnalysisintheJordanValley[J].PlantPathologyJournal,2005,21(2):106-110.60李易初.黑龙江大豆菌核病菌生物学特性、融合群及遗传多样性研究[D].哈尔滨：东北农业大学,2014.61Aldrichwolfe,L,S.Travers,andN.B.Jr.GeneticVariationofSclerotiniasclerotiorumfromMultipleCropsintheNorthCentralUnitedStates.[J]PlosOne,2015.10(9):658-65.62BarariH,AlaviV,BadalyanSM.GeneticandMorphologicalDiversitiesinSclerotiniasclerotiorumIsolatesinNorthernPartsofIran[J].WorldAppliedSciencesJournal,2010,8(3):326-333.63YangD,ZhangJ,WuM.CharacterizationoftheMycelialCompatibilityGroupsandMatingTypeAllelesinPopulationsofSclerotiniaminorinCentralChina[J].PlantDisease,2016.64Wu,B.M.andK.V.Subbarao.AnalysesoflettucedropincidenceandpopulationstructureofSclerotiniasclerotiorumandS.minor[J].Phytopathology,2006,96(12):1322-1329.65李敏.向日葵小核盘菌的鉴定以及小核盘菌和小核盘菌遗传多样性的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学,201566陈婷婷.核盘菌交配型基因MAT-2的克隆及其功能验证[D].长春：吉林大学,2012.67YunSH,BerbeeML,YoderOC.Evolutionofthefungalself-fertilereproductivelifestylefromself-sterileancestors[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96(10):5592-5597.68ScherrerS,ZipplerU,HoneggerR.Characterisationofthemating-typelocusinthegenusXanthoria(lichen-formingascomycetes,Lecanoromycetes)[J].FungalGenetics&Biology,2005,42(12):976-988.69王雪亮,史洋,张艳华,孙凤杰,潘洪玉.子囊菌交配型基因MAT1-1的系统发育[J].菌物学报,2015,34(6):1219-1226.70Chitrampalam,P.,andPryor,B.M.Characterizationofmatingtypr(MAT)allelesdifferentiatedbyanaturalinversioninSclerotiniaminor[J]Plantpathology,2015,64:911-92071ChitrampalamP,InderbitzinP,MaruthachalamK.TheSclerotiniasclerotiorummating 内蒙古农业大学硕士学位论文43typelocus(MAT)containsa3.6-kbregionthatisinvertedineverymeioticgeneration[J].PlosOne,2013,8(2):e56895.72Durman,S.B,A.B.Menendez,andA.M.Godeas.VariationinoxalicacidproductionandmycelialcompatibilitywithinfieldpopulationsofSclerotiniasclerotiorum[J].SoilBiology&Biochemistry,2005,37(12):2180-2184.73Moyo,S.OptimisinggrowthconditionsforthepectinolyticactivityofKluyveromyceswickerhamiibyusingresponsesurfacemethodology[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2003,85(1-2):87-100.74Ozer,G.andH.Bayraktar.OccurrenceofFungalPathogensandMycelialCompatibilityamongSclerotiniaspp.AssociatedwithJerusalemArtichokeinTurkey[J].InternationalJournalofAgricultureandBiology,2015,17(3):619-624.75Mbengue,M.EmergingTrendsinMolecularInteractionsbetweenPlantsandtheBroadHostRangeFungalPathogensBotrytiscinereaandSclerotiniasclerotiorum[J].FrontiersinPlantScience,2016,7:422.76Fryer,M.J.Imagingofphoto-oxidativestressresponsesinleaves[J].JournalofExperimentalBotany,2002,53(372):1249-1254.77刘春来,王爽，夏吉星.内蒙古和黑龙江的核盘菌菌丝融合群分化及致病性研究[J].植物保护,2016(3):145-150.78李永红，王灏,李建厂.核盘菌对油菜、向日葵和大豆的侵染及其致病性分化研究[J].植物病理学报,2005,49(6):486-492.79杨谦,张翼鹏.核盘菌子囊盘形成的影响因子[J].东北林业大学学报,1995,39(2):12680李玉芳.油菜菌核病致病过程中酶活性及草酸含量变化的研究[D].长沙：湖南农业大学,2007.81MarcianoP,MagroP,FavaronF.Sclerotiniasclerotiorumgrowthandoxalicacidproductiononselectedculturemedia[J].FemsMicrobiologyLetters,1989,61(61):57-59.82张丽艳.单一田块核盘菌多样性分析及携带真菌病毒的菌株遗传特性研究[D].武汉：华中农业大学,2010.83DuttonMV,EvansCS.Oxalateproductionbyfungi:itsroleinpathogenicityandecologyinthesoilenvironment[J].RevueCanadienneDeMicrobiologie,1996,42(42):881-895.84王玉杰.向日葵菌核病病原菌遗传多样性及致病力分化的研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2011. 44向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究附录附表1向日葵核盘菌和小核盘菌生物学特性各项指标的测定结果菌株编号生长速率/cm*（48h）-1草酸/μg·mg-1PG酶活力/U·mg-1病斑直径/cmS.sclerotiorum1(8.27±0.07)ab(29.00±1.33)b(26.72±0.15)c(2.68±0.43)cS.sclerotiorum2(8.62±0.28)a(28.22±0.55)b(25.94±0.93)d(3.00±0.11)bS.sclerotiorum3(8.10±0.24)b(27.58±0.09)bc(27.22±0.35)c(3.07±0.04)bS.sclerotiorum4(8.32±0.02)ab(32.14±4.47)a(30.03±3.16)a(3.65±0.54)aS.sclerotiorum5(8.18±0.15)ab(28.24±0.57)b(25.91±0.96)d(2.89±0.22)bcS.sclerotiorum6(8.58±0.25)a(26.16±1.50)bcd(28.67±1.79)cd(3.60±0.49)aS.sclerotiorum7(8.22±0.12)ab(28.78±1.11)b(27.08±0.21)c(3.49±0.38)aS.sclerotiorum8(8.50±0.16)ab(24.76±2.91)cd(26.98±0.11)c(2.83±0.28)bcS.sclerotiorum9(8.12±0.22)b(24.09±3.57)de(24.91±1.96)e(3.07±0.04)bS.sclerotiorum10(8.47±0.13)ab(27.70±0.04)bc(25.25±1.62)de(2.84±0.27)bcS.minor1(5.25±0.13)c(18.63±0.37)ab(21.39±0.20)bc(2.3±0.59)aS.minor2(5.57±0.19)bc(19.95±0.95)ab(21.75±0.17)b(1.68±0.03)cS.minor3(5.23±0.14)c(18.90±0.10)ab(20.77±0.81)d(1.70±0.01)cS.minor4(5.37±0.01)bc(17.76±1.24)b(20.74±0.85)d(1.75±0.04)cS.minor5(3.67±1.71)d(19.80±0.80)ab(21.61±0.02)b(1.21±0.50)eS.minor6(5.40±0.02)bc(17.21±1.79)b(21.21±0.37)c(1.43±0.28)dS.minor7(5.13±0.24)c(17.70±1.31)b(20.51±1.07)de(1.57±0.14)cdS.minor8(5.78±0.41)abc(21.48±2.48)a(22.70±1.12)a(2.01±0.30)bS.minor9(6.35±0.98)a(19.28±0.28)ab(21.16±0.42)c(1.98±0.27)bS.minor10(6.00±0.63)ab(19.31±0.31)ab(20.32±1.26)e(1.45±0.26)d 内蒙古农业大学硕士学位论文45附表2向日葵小核盘菌生物学特性各项指标的测定结果菌株编号病斑直径/mmPG酶活力/U·mg-1草酸/μg·mg-1生长速率/cm*（48h）-1菌核形成量（g）BYS-419.4322.7225.576.100.1450BYS-519.2423.4527.426.600.1250BYS-622.6023.7424.596.200.1300BYS-721.4225.0327.626.930.1350BYS-821.9821.3923.026.500.1525BYS-1019.2525.7727.786.100.1325BYS-1127.1125.3027.727.700.1700BYS-1521.4725.1228.016.400.1325BYS-1625.3321.8124.435.850.1300BYS-1824.9821.9624.805.750.1525BYS-1916.7324.3123.205.750.1375BYS-2229.0322.9128.296.250.1050BYS-2520.4824.0825.096.530.1625BYS-2825.6927.6329.286.830.1450BYS-3026.2125.5624.516.100.1325GJD-421.8624.9526.936.400.1650GJD-623.9725.8924.855.230.1550GJD-929.4021.8624.017.100.1450WKXC-B-226.9924.0425.926.900.1725WKXC-B-322.0124.3925.687.150.1850WKXC-B-627.0323.8622.897.700.2075WKXC-B-726.1524.9926.647.030.1675DMQ-421.7725.9725.996.130.1425DMQ-527.4227.4127.655.380.1375DMQ-729.0323.3926.756.430.1075DMQ-1027.7523.6824.406.180.1500SYC-A-225.9724.2625.184.680.1575SYC-A-322.9623.6225.915.630.1600SYC-A-526.0324.3325.976.430.1500SYC-A-923.3726.0128.694.800.1400SYC-A-1124.2223.2126.854.400.1400SYC-A-1521.3521.1726.324.300.1525BYS-126.6525.7627.386.200.1500 46向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究22.9724.8927.026.050.1550BYS-222.4721.9525.386.080.1425BYS-320.9423.6427.215.750.1150BYS-1327.3821.0623.426.130.1525BYS-2022.6624.2124.196.050.1550BYS-2122.0824.2224.086.180.2200BYS-2428.2127.5427.385.850.1575BYS-2728.5025.9429.025.930.1900BYS-2922.7424.3926.774.330.1375SYC-A-122.6023.3526.235.700.1500SYC-A-621.3822.4626.735.500.1350SYC-A-719.7521.8725.774.330.1375SYC-A-823.6827.2328.544.730.1400SYC-A-1322.3726.2828.934.400.1325SYC-B-821.7626.1027.855.780.1525DMQ-126.0124.0825.235.030.1500DMQ-226.9023.9524.665.780.1475DMQ-327.0224.9127.626.850.0900DMQ-625.6325.8724.195.350.1500WKXC-B-128.2424.7326.294.750.1375WKXC-B-427.7424.6827.325.550.1500WKXC-B-522.3624.6125.446.030.1500SCD-127.0623.7326.155.530.1575WKZ-221.4621.8023.236.000.1500GJD-723.2721.8224.635.350.1575SCD-424.2223.8625.185.700.1625SCD-524.2924.6823.965.400.1500SYC-B-322.5523.3724.224.380.1500SYC-B-926.9526.4425.825.480.1750WKZ-120.9421.4123.494.430.1350WKZ-626.8724.6525.815.580.1675GJD-225.6223.3824.585.050.1600ZQ-729.4227.4125.255.830.1825ZQ-1328.3326.4025.505.950.1700ZQ-2723.3023.8523.984.700.1550ZQ-3726.2124.0524.994.780.1400ZQ-3824.5024.4724.905.130.1525ZQ-48SYC-B-523.5024.5725.034.150.1450 内蒙古农业大学硕士学位论文4721.0424.4422.934.000.1375SYC-B-625.8424.0924.515.350.1450BYS-2625.2524.1924.845.480.1500DMQ-824.9721.4325.015.650.1825WKZ-321.6522.2322.935.030.1550WKZ-527.8224.0126.935.850.1800GJD-525.5226.1926.824.980.1525ZQ-124.7021.7224.945.480.1825ZQ-426.3026.7824.355.450.1725ZQ-526.6924.8126.644.800.1400ZQ-2325.9524.6525.075.130.1450ZQ-5423.7225.1123.444.450.1550SYC-B-1024.6623.9825.485.700.1625GJD-121.3621.9125.204.150.1375BYS-1725.1823.9226.155.800.1625SYC-A-427.2926.1028.285.900.1800SYC-A-1227.2426.2327.976.480.1475SYC-B-224.1025.1525.445.000.1675ZQ-L-224.1623.5725.755.730.1725ZQ-1519.5721.9423.835.600.1550ZQ-3321.8923.8024.164.030.1275ZQ-34 48向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究附图192个小核盘菌菌株平均生长速率的比较附图292个小核盘菌菌株菌核重量的比较 内蒙古农业大学硕士学位论文49附图392个小核盘菌菌株草酸分泌量比较附图492个小核盘菌菌株PG酶活力的比较 50向日葵小核盘菌的生物学特性、致病力分化以及遗传多样性的研究作者简介贾瑞芳，女，汉族，1994年1月出生于内蒙古乌海市海南区。2011年考入内蒙古农业大学农学院园艺专业，2015年大学本科毕业获得农学学士学位，同年考入内蒙古农业大学农学院作物保护学专业攻读硕士，研究方向为分子植物病理学。发表文章：1贾瑞芳,张键,李敏,孟庆林,周洪友,赵君.相同立地条件下向日葵核盘菌、小核盘菌生物学特性及致病力的比较[J].北方农业学报,2017,45(06):67-74.2LiM,JiaR,NaR,etal.GeneticdiversityofSclerotiniasclerotiorumwithinasinglesunflowerfieldinWenquan,Xinjiangprovince,China[J].JournalofPlantPathology,2016:43-53.3ZhangJ,JiaR,ZhangYY,etal.Firstreportofstemrotofsunflowerbroomrape(Orobanchecumana)causedbySclerotiniaminorJaggerinInnerMongolia,China[J].PlantDisease,2017.