苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析

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７６３分类号：Ｓ．１授予学位单位代码：１０４３４研究生学号：２０１４１１０３９０山東農業大學硕士学位论文苹果腐烂病菌基因的分离及功能分析ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎａｌｓｉｓｏｆＶｍＨＭＧ７ＧｅｎｅｏｎｙＶａｌｓａｍａｌｉｖａｒ．ｍａｌｉ研究生：贾晓曼学科专业：森林保护学研究方向：林果病原与寄主分子互作机制学院：植物保护学院刘会香副教授指导教师：何邦令副教授２０１７年６月２日 ：２〇７，＾Ｕ—＿Ｌ论文提交日期＿论文答辩日期：２０１１ＭＡＪ－学位授予日期：￣鲁：学科门类答辩委员会主席：叶建仁教授＿？雩＊１－＜＊．＊：卜：Ｖ－＃＇ ：关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研宄所取得的成果？对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明＾本声明的法律责任由本人承担．本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保窜和装要求商国家有关部门或机构送交论文纸质本和电￥钣Ｉ允许论．文被査阅和借阋。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全＿或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研宄所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务９保密论文在解密后应逋守此规定。？＜＊论文作者签名：宽唤＾导师签名：日期：糾ｍ‘， 目录摘要...........................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1前言........................................................................................................................................11.1苹果腐烂病的发生与危害.................................................................................................11.2苹果腐烂病致病机制的研究.............................................................................................21.3HMG-box基因的研究进展.................................................................................................31.4丝状真菌基因功能的研究方法.........................................................................................91.5本研究的目的、意义及技术路线...................................................................................132材料与方法..........................................................................................................................162.1试验材料...........................................................................................................................162.2方法...................................................................................................................................172.2.1FL550突变基因的分离和序列分析.............................................................................172.2.1.1突变体基因组DNA提取..........................................................................................172.2.1.2侧翼序列扩增.............................................................................................................182.2.1.3PCR特异性产物回收.................................................................................................192.2.1.4PCR特异性产物连接.................................................................................................202.2.1.5转化.............................................................................................................................202.2.1.6PCR检测.....................................................................................................................202.2.1.7侧翼序列分析.............................................................................................................212.2.2苹果树腐烂病菌HMG-box基因家族分析..................................................................222.2.2.1HMG-box基因家族成员鉴定.....................................................................................222.2.2.2系统发育树分析与蛋白质保守域序列比对..............................................................232.2.2.3HMG-box基因结构及染色体定位分析.....................................................................232.2.3VmHMG7基因功能分析...............................................................................................232.2.3.1VmHMG7基因敲除载体的构建................................................................................232.2.3.2基因敲除.....................................................................................................................282.2.4突变体验证.....................................................................................................................292.2.4.1潮霉素初筛.................................................................................................................29II 2.2.4.2PCR检测.....................................................................................................................302.2.4.3Southern杂交..............................................................................................................302.2.5敲除突变体的表型观察和致病力测定........................................................................342.2.5.1菌株的活化及培养.....................................................................................................342.2.5.2突变体菌落形态观察.................................................................................................342.2.5.3突变体生长速率测定及子实体测定.........................................................................342.2.5.4突变体致病性测定.....................................................................................................352.2.5.5数据分析.....................................................................................................................353结果与分析...........................................................................................................................363.1FL550突变基因的克隆及分析........................................................................................363.1.1FL550突变基因的克隆.................................................................................................363.1.2FL550突变基因的分析.................................................................................................363.2苹果树腐烂病菌HMG-box基因分析.............................................................................383.2.1苹果腐烂病菌HMG-box基因家族成员鉴定..............................................................383.2.2基因结构及系统进化分析............................................................................................393.2.3苹果腐烂病菌HMG-box基因家族染色体定位分析..................................................413.2.4VmHMG7基因的保守结构域分析...............................................................................423.3基因敲除载体的构建和突变体验证...............................................................................423.3.1敲除载体的构建............................................................................................................423.3.2PCR验证........................................................................................................................433.3.3Southern杂交验证.........................................................................................................433.4敲除突变体的表型观察和致病力测定...........................................................................443.4.1敲除突变体菌落表型观察............................................................................................443.4.2敲除突变体致病性测定................................................................................................454讨论......................................................................................................................................464.1敲除突变体表型未发生变化的原因...............................................................................464.2敲除突变体致病性增强的原因分析...............................................................................464.3HMG-box基因与有性生殖的关系...................................................................................474.4其他...................................................................................................................................485结论......................................................................................................................................49III 参考文献..................................................................................................................................50附录..........................................................................................................................................57攻读学位期间发表论文情况..................................................................................................61IV 山东农业大学硕士学位论文摘要苹果腐烂病是我国苹果产业的重大生物灾害，发生普遍，为害严重，Valsamalivar.mali是引起苹果腐烂病的主要病原真菌，深入研究病菌的生长发育及分子致病机制可为病害的科学防控提供理论依据，分离克隆和调控病菌生长发育和致病相关基因，进而研究这些基因的功能，可揭示腐烂病菌生长发育及致病分子机制。本研究以ATMT介导的突变体库中已筛选出的菌落形态、生长和致病性均出现变异的突变体FL550为出发菌株，通过侧翼序列扩增，分离克隆了苹果腐烂病菌HMG（VmHMG7）基因，利用生物信息学方法，从苹果腐烂病菌全基因组数据库中鉴定出HMG-box家族，利用MEGA5软件对基因家族进行了系统进化分析，利用MapDRAW及GSDS方法进行了基因家族成员的结构及染色体定位；利用融合PCR技术将VmHMG7基因上下游片段与及潮霉素筛选标记基因（hygromycinphosphotransferasegene，HPH）构建敲除载体，应用PEG-CaCl2介导原生质体，将敲除载体转化到野生型菌株中，然后经过潮霉素的筛选、PCR扩增和Southern杂交，获得了敲除突变体。将敲除前后菌株的培养学、形态学、生长和致病性等表型进行比较，初步分析了VmHMG7基因的功能，研究结果如下：1.侧翼序列克隆和序列分析显示，突变株FL550是通过ATMT载体的T-DNA插入置换了苹果腐烂病菌8号染色体（CM003105.1）而获得，其替换位点位于碱基2336793到2341108之间，长度共4316bp的序列。被置换的序列包括VM1G_07985（VmHMG7）5’端部分序列及其启动子，VM1G_07986（KUI72125.1）部分启动子序列和两基因间的非编码区序列。VM1G_07985与向日葵茎溃疡病菌（Diaporthehelianthi）的HMG（HighMobilityGroup-boxcontainingprotein）基因的同源性达99%，故将腐烂病菌的该段基因定名为VmHMG7基因，其位于苹果腐烂病菌8号染色体上，DNA全长2327bp，编码631个氨基酸的假定蛋白。07986编码1，3-β-葡聚糖合酶基因。本研究重在对VmHMG7基因及其家族进行了分析。2.全基因组数据分析表明，苹果腐烂病菌共包括8个HMG-box基因，其蛋白编号为VmHMG1（1107bp）、VmHMG2（1509bp）、VmHMG3（300bp）、VmHMG4（897bp）、VmHMG5（1752bp）、VmHMG6（1374bp）、VmHMG7（1893bp）、VmHMG8（606bp），分别位于苹果腐烂病菌13条染色体中的第1、2、3、8、9的5条染色体上，其中2号I 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析染色体含有4个（VmHMG2、VmHMG3、VmHMG4、VmHMG5），1、3、8、9号染色体上分别为VmHMG1、VmHMG6、VmHMG7、VmHMG8。分列2个亚家族：HMGB-UBF（VmHMG1、VmHMG2、VmHMG3、VmHMG4）和MATA（VmHMG5、VmHMG6、VmHMG8）。VmHMG7没有明确分析出亚家族。3.基因结构分析表明，VmHMG7基因含有Peptidases_S8_S53、Sprt-like（产物为DNA金属肽酶）和HMG-box三个结构域，其氨基酸序列与柄孢霉（Podosporaanserina）中同样含Sprt-like、HMG-box的PaHMG7基因（登录号CDP29961.1）比对，相似度达51%。PaHMG7主要影响病菌子实体形成和分布，而对菌落形态没有影响，说明VmHMG7有近似的功能。4.VmHMG7基因敲除菌株的筛选和表型分析显示，本研究共获得2株基因敲除突变体Δ1-5、Δ2-22，敲除效率为2.1%。与野生型菌株相比，VmHMG7基因敲除菌株Δ1-5和Δ2-22菌株菌落形态、病菌子实体大小和产孢作用不明显，但突变菌株平均生长率分别下降了10.8％和19.8％，致病性分别增加了48.5％和56.2％，说明VmHMG7基因的缺失抑制了苹果腐烂病菌的生长，增强了其致病性，对其它性状影响不明显。关键词：苹果腐烂病菌；VmHMG7；同源重组；融合PCR；Sprt-like；致病性II 山东农业大学硕士学位论文AbstractValsamalivar.maliisawidespreadandharmfulpathogencauseapplecankerdisease.In-depthstudyofthegrowthanddevelopmentandpathogenicmolecularmechanismcanprovidetheoreticalbasisforscientificpreventionandcontrolofthedisease.Isolateandclonethegenesthatregulatethegrowthanddevelopmentofpathogens,andstudythefunctionofthesegenescanrevealthegrowthandpathogenesisofrotpathogen.Inthisstudy,theATMT-mediatedmutantFL550wereselectedasthestartingstrains,whichhasagreatdifferentwiththewildstrainsoncolonymorphology,growthandpathogenicity.Bytheamplificationofflankingsequences,theHMG-boxgeneswereisolatedandcloned.Usingbioinformaticsmethods,theHMG-boxfamilyofapplerotpathogenwasidentifiedfromthewholegenomedatabaseofValsamalivar.mali,andthegeneticfamilywasanalyzedbyMEGA5software.ThestructureandchromosomelocalizationofgenefamilymemberswerecarriedoutbyMapDRAWandGSDS.Usingdouble-jointPCRtechniquetoconstructtheknockoutvectors,whichhavetheValsamalivar.maliHMG(VmHMG7)geneupstreamanddownstreamfragmentsandthescreeningmarkergene(HygromycinphosphotransferaseGene,HPH).TheknockoutvectorsweretransformedintothewildstrainsprotoplastbyPEG-CaCl2.Then,throughthescreeningofhygromycin,PCRamplificationandSouthernhybridization,theknockoutmutantswereobtain.Comparedthemorphology,growth,pathogenicityandphenotypicwiththewildstrain,thefunctionofHMG-boxgenewerepreliminaryanalysis.Theresultsareasfollows:1.Flankingsequencecloneandsequenceanalysisshowedthat,thesubstitutionsite2336793to2341108inchromosome8(CM003105.1)wasreplacedbytheT-DNAinsertionoftheATMTvectorinthemutantFL550.Thetotallengthofthereplacedfragmentis4316bp,whichincludesthe5’termenalanditspromoteroftheVM1G_07985(VmHMG7),thepartialpromotersequenceofVM1G_07986(KUI72125.1),andthenoncodingregionsequencebetweenthistwogenes.TheVM1G_07985,whichislocatedinthechromosome8(GenBank:CM003105.1)ofValsamalivar.mali,haveahighhomologyof99%withtheHMG(HighMobilityGroup-boxcontainingprotein)geneofsunflowerstemulcerbacteria(Diaporthehelianthi),sothatnameditasVmHMG7gene.TheDNAlengthis2327bp,encoding631III 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析aminoacidhypotheticalprotein.VM1G_07986encodesa1,3-beta-glucansynthasegene.ThisstudyfocusesontheVmHMG7geneandanalyzedtheHMG-boxgenefamily.2.WholegenomesdataanalysisshowedthatValsamalivar.maliincluded8HMG-boxgenes,incluedVmHMG1(1107bp),VmHMG2(1509bp),VmHMG4(897bp),VmHMG3(300bp),KUI27382.1(1752bp),VmHMG6(1374bp),VmHMG8(606bp),VmHMG7(1893bp).Thechromosome2contains4HMG-boxgenes(VmHMG2,VmHMG3,VmHMG4,VmHMG5).VmHMG1,VmHMG6,VmHMG7,VmHMG8areinthechromosome1,3,8,9,respectively.The8HMG-boxgenesarearelistedtotwosubfamilies:HMGB-UBF(VmHMG1,VmHMG2,VmHMG4,VmHMG3)andMATA(VmHMG5,VmHMG6,VmHMG8).3.TheresultsofgenomicanalysisshowedthattheVmHMG7genecontainedthreedomains:Peptidases_S8_S53,Sprt-like(DNAmetalloproteinase)andHMG-box.TheVmHMG7genewassimilartoPaHMG7(accessionnumberCDP29961.1),whichalsohaveSprt-likeandHMG-boxdomains.Thesimilarityisto51%.ThemaineffectofPaHMG7isonthedistributionoffruitingbodiesandhasnoeffectoncolonymorphology.ItisassumedthatVmHMG7hasasimilarfunction.4.ScreeningandphenotypicanalysisofVmHMG7geneknockoutstrainsΔ1-5andΔ2-22revealedthatthepathogenicitywassignificantlyimproved,knockoutefficiencyis2.1%.Therearenotdifferentbetweenthewildstrainsandthemutantsoncolonymorphology,sizeandspore-producing.Buttheaveragegrowthrateofmutantsdecreasedby10.8%and19.8%respectively,andthepathogenicityincreasedby48.5%and56.2%,whichindicatedthatthedeletionofVmHMG7geneinhibitedthegrowthofValsamalivar.mali,enhanceditspathogenicity,andhadnoobviouseffectonothertraits.Keywords:Valsamalivar.mali,VmHMG7,homologousrecombination,Double-jointPCR,Sprt-like,pathogenicityIV 山东农业大学硕士学位论文1前言1.1苹果腐烂病的发生与危害苹果位居当今世界四大水果，中国的第一大水果。我国苹果产业的规模已处于世界2领先地位，到2015年，我国苹果的种植面积已达到3500万hm，总产量已达到了4000万t以上，但却不能称为苹果生产强国，主要表现在两个方面：一是苹果的单位面积产量和苹果品质方面均低于世界平均水平；二是苹果的出口比例、价格、效益都不容乐观。造成这种状况的主要原因是苹果病害发生严重，影响了苹果的单产、品质，进而影响了出口和效益（王旭芳，2016）。山东省苹果产区属于我国的苹果主产区之一的环渤海湾产区，该产区还包括河北与辽宁，共占我国苹果生产面积44%。其余的三个苹果产区为西南冷凉高地、黄河故道和西北黄土高原。渤海湾苹果产区的苹果产量占了全国49%（王旭芳，2016）。山东省苹果产业为推动区域的经济发展、农民的增收以及满足国内的消费需求，都做出了重要贡献。苹果腐烂病（Valsacankerofapple）是我国苹果树上的第一大病害。其病原菌为子囊菌黑腐皮壳属的苹果黑腐皮壳菌（Valsamalivar.mali）。在世界范围内，苹果腐烂病的发生也极其广泛，几乎所有的苹果种植区都有发生。在亚洲主要集中在东部地区（李保华，2013）。1903年，苹果树腐烂病在日本首次被发现，后相继于美国的新墨西哥州（1952），哈萨克斯坦（1972）等多个地方发现，苹果树的病死率甚至高达到85%和90%。在我国，苹果树腐烂病首次发现在渤海湾产区的辽宁省南部地区（1916）（高克祥等，1995）。苹果树腐烂病一共有较大的四次爆发：1948年到1953年，1960年到1963年，发生在辽宁省，平均的病株率达到了60%；1976年，在黄河故道产区、黄土高原产区、渤海湾产区等多地发生，病株率在20%-70%范围；1985年到1987年，在河南、西北和东北等多地发生，最高的病株率达到了62.3%，造成了苹果树的大面积死亡（曾士迈，2005）。2008年，我国的苹果产业技术体系对我国的10个苹果主要生产省市，总共147个苹果园区，进行了苹果树腐烂病的发生状况以及防治情况的调查，发现苹果树腐烂病总体的发病概率达到了52.7%，部分的苹果产区甚至达到了85％以上（曹克强等，2009）。1 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析据2010-2012年的调查结果，在我国的所有的苹果种植区中均发现了苹果腐烂病，且发生程度均为重度（胡清玉等，2016）。苹果腐烂病主要侵害苹果的主干和大枝，也能够侵害小枝和果实，可以导致苹果的树皮腐烂，进而造成树势的衰弱，苹果的产量下降，果实的品质的受损，严重时甚至可以造成整株的苹果树死亡（陈策，2009；Wangetal.，2014；李保华等，2013）。因此，深入研究病菌的生长发育及分子致病机制可为病害的科学防控提供理论依据。1.2苹果腐烂病致病机制的研究苹果腐烂病菌是一种弱寄生菌，可以通过叶痕、果柄痕等自然的孔口入侵，或者通过冻伤、剪锯口等伤口，侵入到寄主组织中。树势强的时候，苹果腐烂病没有表现症状，当树势变得衰弱时，潜伏的病原真菌即可扩展，最终导致树体的发病（樊民周等，2004；王磊等，2005）。刘福昌等（1979）的研究表明，在表面没有明显症状的苹果树枝条中，可能已经寄生了苹果腐烂病菌，并被检测到。2012年，Zang等（2012）利用巢式PCR技术，对无明显症状的枝条进行了检测，结果发现，在无明显症状的离体枝条中，带菌率最高甚至可以达到64.7%。苹果腐烂病菌潜伏侵染的特性，为有效防控带来了较大的难度。目前对于苹果腐烂病菌的致病基因研究，主要集中在己糖激酶基因、果胶裂解酶基因等几个基因。西北农林科技大学的戴青青（2014）初步研究了苹果腐烂病菌两个己糖激酶基因的功能。2个基因的缺失突变体与野生型相比，子实体形成时间延迟，子实体个数减少，这两个基因都与产孢相关。朱艳天（2014）研究了果胶裂解酶基因的功能，敲除突变体菌株的致病力呈现显著性增强，初步表明了苹果树腐烂病菌果胶裂解酶基因Vmpl-1参与了苹果树腐烂病的发病过程，并在一定程度上抑制了病菌的侵染。许力军（2014）研究了内切多聚半乳糖醛酸酶基因的功能。苹果树腐烂病菌基因组中含有5个同源的内切多聚半乳糖醛酸酶基因，他得到其中一个基因敲除突变体，但该基因在病菌生长发育及致病过程未起到重要作用，可能因为其他同源基因功能互补导致该基因敲除突变体致病性上没有差异。宋娜（2014）对4个多聚半乳糖醛酸酶基因功能进行了初步研究。4个多聚半乳糖醛酸酶基因与苹果树腐烂病菌菌丝生长及发育无关，与病原菌致病性有关。随着专家学者对苹果树腐烂病菌的深入研究，发现果胶酶等细胞壁水解酶类及其次2 山东农业大学硕士学位论文生代谢产物，在病原菌的致病过程中，起到非常重要的作用。刘福昌等（1980）的研究表明，在苹果腐烂病菌腐烂分解的苹果树树皮中，发现了果胶酶的存在，并且将该病原真菌培养在马铃薯麦芽糖培养基中，同样也检测到了果胶酶的存在。在苹果树腐烂病菌致病类群分离株培养液中，臧睿等（2006）测定了其中的半乳糖醛酸酶的含量，并测量其pH值，发现在病疤的扩展过程中，果胶酶起到非常重要的作用。Keetal.,（2013）利用免疫胶体金技术表明果胶酶与致病过程具有相关性。王建华等（2012）的研究也表明，果胶酶很可能是苹果腐烂病菌侵染致病的非常重要的因子之一。上述这些基因的表达与调控，最终都会受到转录因子的影响。1.3HMG-box基因的研究进展1.3.1HMG-box基因的命名及分类1973年，英国科学家Goodwin发现了一种特殊的蛋白质，其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中拥有较高的迁移率，因此把这类蛋白命名为高迁移率族蛋白（highmobilitygroupprotein，HMG蛋白）。根据其在序列的相似性、结合特性的差异，经典的HMG蛋白可以被分为HMGN、HMGA和HMGB。三类蛋白的不同结构域，调控着蛋白的不同功能（田华茹，2012）。HMGN含有核小体结合结构域，HMGA蛋白含有AT-hook结构域；HMGB基因，具有HMG-box结构域，HMGB蛋白通过与DNA的结合，调节有性繁殖、生长发育等过程。根据Genebank上对于HMG-box基因家族的分析，可以将其分为两个亚家族（见表1.1）：SOX-TCF-MATA，HMGB-UBF。SOX-TCF-MATA倾向于结合A/TCAAAG/C基序中富含T/A的DNA小沟，分为两种蛋白质群SOX-TCF和MATA。SOX-TCF存在于动物中，如转录因子TCF-1，SRY和LEF-1；MATA仅存在于真菌中，包括与交配相关的蛋白MATA1，MC和Ste11，在柄孢霉（Podosporaanserina）、禾谷镰刀菌（FusariumgraminearumSchw.）、烟曲霉（Aspergillusfunigatus）、核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）中都有关于MATA基因的研究（Butler，2004）。HMGB-UBF以低特异性结合DNA，其倾向于结合富含GC片段的rRNA启动子，含两个或多个串联HMG-box结构域，主要参与DNA重组，修复，转录和基因组稳定性，包括核仁和线粒体转录因子UBF和mtTF。其涉及啤酒酵母中核糖体DNA的转录，并且splsd1和splsd2在裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）中被转化成组蛋白脱甲基酶，影响细胞的表观遗传3 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析状态，如图1.1（Cateetal.，2010）。表1.1HMG-box结构域中的保守序列Table1.1ConservedsequenceofHMG-boxdomains亚家族结构域一致核心序列分布MATA(cd01389）IPRPPNAFILYRQHYHAEVKAQNPGLRTNNEISKIIGEQW仅存在于真菌SOX-TCF(cd01388）VKRPMNAFMVWSRDQRRKVAQENPKMH-NSEISKILGARW多存在于动物HMGB-UBF(cd01390）PKRPLSAYFLFCNEHRPKIKAENPGNLSIGEVAKKLGEMW图1.1经典的HMG蛋白的分类Figure1.1ClassificationofclassicalHMGproteinsHMGB蛋白可以与DNA小沟相结合，这与它的L形结构密不可分。在70-80个氨基酸中，HMGB蛋白形成了三个α-螺旋，最终折叠形成L形。它的长臂由螺旋III和N端组成，短臂由螺旋I和螺旋II组成。其中形成的凹面可以插入DNA双螺旋的小沟（徐佳等，2005）。然而，不同生物体中HMG-box结构域的数量是不同的。哺乳动物细胞中的HMGB含有两个同源结构域和一个富含酸性氨基酸的C-末端结构域；果蝇中的HMG-D和HMG-Z具有一个HMG-box和一个12个残基的C末端尾巴，酵母中的Nhp6ap和Nhp6bp仅有一个没有C末端结构域，而Hmo1p和Hmo1p仅含有两个HMG-box结构域。在基本的HMG-box结构域外，HMG-box基因也含有其他附加结构域。比如在柄孢霉的12个HMG-box基因中，含有许多附加结构域，如：DUF1898、SAM、SWIRM、SprT-like（表1.2）。在本研究中的目的基因VmHMG7中，有Sprt-like和Peptidases_S8_S53结构域。4 山东农业大学硕士学位论文表1.2柄孢霉中的HMG-box基因Table1.2HMG-boxgenesinPodosporaanserina同源序列基因号基因功能附加结构域Orthologs（基因名称）基因家族GeneAdditionalGenenumberHMGBfamilyfunctiondomain酿酒酵母裂殖酵母粗糙脉孢菌(genename)S.cerevisiaeS.pombeN.crassa(FMR1)配型调控MATA_HMG-MATa1-NCU01958(SMR2)配型调控MATA_HMG---NCU01960Pa_1_20590(FPR配型调控MATA_HMG--McMATa-11)线粒体稳Pa_1_13340(mtH定性；子实HMGB_UBFDUF1898--NCU02695MG1)体产生Pa_1_7390(PaHM生长HMGB_UBFSAM--NCU02819G2)Pa_1_9380(PaHM负调控子SWIRM,HMGB_UBF-lsd1NCU09120G3)实体分布amine-oxidasePa_1_11050(PaHHMGB_UBF---NCU03126MG4)Pa_1_13940(PaH子实体产NCU02326MATA_HMG--ste11MG5)生与否NCU09387生长；子实Pa_1_14230(PaH体产生速HMGB_UBF-NHP6BNHP6NCU09995MG6)度Pa_5_8400(PaHM负调控子NP_5959HMGBSprT-like-NCU06874G7)实体分布70.1Pa_6_4110(PaHM子实体产MATA_HMG-ROX1-NCU03481G8)生与否生长；菌丝尖端分枝；Pa_7_7190(PaHM负调控菌HMGB---NCU07568G9)丝融合；子实体产生与否Sprt-like为以谷氨酸为催化氨基酸的DNA金属肽酶，哺乳动物和酵母中都含有该类酶，其能造成DNA-蛋白质交联（DNAProteinCrosslinks，DPCs）类型的DNA损伤，电离放射物、紫外线、乙醛等为DPCs类型DNA损伤的诱因。1.3.2HMG-box基因的主要功能HMGB蛋白作为转录调节因子，能够与染色质结合，而影响和参与与DNA相关的反应中。在细胞核中，HMGB蛋白的含量比较丰富。在许多细胞功能的行使方面，HMGB蛋白都表现出了一定的调控作用，比如在转录、染色质的复制、核小体组装、细胞的发育、及性别的分化中，都能够显示出HMGB蛋白的调控功能（2002，牛林海）。5 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析在哺乳动物细胞内外，HMG-box基因均有表达，并且具有较为广泛的生物学功能。在细胞核中，HMGB蛋白具有调控DNA的复制、启动或抑制DNA转录、调控基因重组和修复DNA损伤等多种作用。HMGB蛋白存在着甲基化、乙酰化、磷酸化等多种修饰，进而能够把HMGB蛋白分泌出细胞，使其可以参与到与神经轴突的生长、细胞的增殖分化和肿瘤的产生等与生长分化密切相关的过程。1.3.2.1HMGB蛋白参与DNA的转录调控HMGB蛋白通过几种不同的作用机制，与其他转录蛋白一起，促进基因的转录过程。第一种作用机制为，HMGB蛋白通过直接与核小体相互作用，进而使得DNA的螺旋结构变得松散。在核小体上，HMGB蛋白与可进出位点的片段相结合。这是一种与组蛋白相同种的作用方式。HMGB蛋白的结合，能够在空间上锁定核小体的状态，进而抑制了与转录相关的因子间相互作用；而HMGB蛋白结合后，原本被包裹的核小体结构更加松散，染色体重建蛋白更容易被吸引过来，引起核小体滑动，暴露出先前被锁定的DNA区域。在基于EMSA竞争性实验和体外实验的第二种机制中，HMGB蛋白被认为是转录抑制子，能够与TATA-结合蛋白（TATAbindingprotein，TBP）形成HMG-1/TBP/TATA的稳定复合物，抑制启动子区域的起始复合物的形成。辅助转录因子TFIIA也可以与TBP结合，从复合物上将HMGB取代下来，从而促使转录开始。第三种机制是hit-and-run模型。HMGB蛋白导致其他转录因子识别并结合到DNA的识别位点，然后与三元复合物分离。HMGB作为短时间的分子伴侣，介导了其他转录因子的匹配，然后又与复合物分离。研究表明，虽然HMGB和一系列转录因子结合很弱，但具有特异性的相互作用，如类固醇受体，TBP，HOX亚基等。此外，HMGB蛋白还可以通过参与增强子的形成来调节转录。增强子是由在基因启动子或增强子区域上的多个转录因子形成大分子复合物。HMGB蛋白质可以破坏核小体的结构，暴露出DNA上新的蛋白质结合位点，从而吸引更多的核因子的结合，这些核因子在空间上可能是遥远的，不能相互作用，HMGB蛋白可能发挥弯曲的功能，使其在空间上彼此接近，促进两个转录因子的相互作用，从而形成一个被加强的新的染色体重组区域。6 山东农业大学硕士学位论文1.3.2.2HMGB蛋白参与DNA修复过程HMGB蛋白可以抑制和促进DNA修复。HMGB蛋白质对顺铂具有高亲和力，可防止DNA损伤被修复。但是，有些形式的DNA损坏，不能被抑制修复。例如，当DNA中插入了基因毒性核苷酸类似物，HMGB蛋白可以促使HMGB1、HMGB2、HSC7、胞质蛋白GAPDH复合物等到插入错误的位置，促进去除类似物。1.3.2.3HMGB蛋白在细胞凋亡中的作用当细胞凋亡时，HMGB蛋白的动力学特征完全改变，细胞核中的快速运动停止，核染色质浓缩并破碎。形成这种稳定的复合物是HMGB1特殊的，在染色凝集中，其他核蛋白在迁移中也有类似的下降。因为在细胞凋亡中，HMGB1的生物修饰没有改变，稳定的结合可能更依赖于染色质的浓缩。该结合信号机制还不明了，可能允许HMGB识别并结合染色体中的异染色体N端，或者当形成异质染色质时，大范围的组蛋白脱乙酰化，导致染色体的一些结构发生变化。1.3.2.4HMGB蛋白参与到细胞免疫的过程在凋亡细胞中，HMGB结合染色体最明显的生物学功能是防止蛋白质从死细胞中泄漏，以避免免疫反应。HMGB作为来自坏死细胞的“警告”分子而泄漏，能够引起组织的损伤，影响细胞分裂、迁移、激活并引起免疫反应。HMGB也可从单核白蛋白细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和其他免疫细胞中分泌，成为的败血症介质，随后传播至LPS，IL-1β，TNF-α等刺激因子。然而，关于免疫功能的重要一点是，HMGB通过其转录前的修饰来调节其在细胞核与细胞质中的穿梭和分泌。例如，磷酸化可以调节HMGB的穿梭，并重新引导分泌，特异性位点的甲基化允许HMGB停留在细胞质中。丝状子囊菌柄孢霉含有12个HMG-box基因。其中前三个是控制子实体受精和发育的交配型基因，第四个编码与线粒体DNA稳定性相关的因子。AitBenkhali等对剩余八个的HMG-box基因系统敲除后，发现没有一个对于生存是至关重要的。PaHMG5与来自裂殖酵母的SpSte11直系同源，是交配型基因的重要增强子，而PaHMG9对几种固定阶段的表型有抑制作用，最明显的是对菌丝融合的抑制作用。对缺失菌株中HMG-box基因的转录分析表明，PaHMG5位于调控交配型基因和交配型靶基因的几种HMG-box7 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析因子的网络中心（图1.2）。遗传分析显示，该网络还调控不受交配型转录因子调控的育性基因。本研究指出HMG-box成员在真菌中的重要作用，12个成员中有11个参与了P.anserina的性循环。PaHMG5和SpSte11是交配型基因的保守转录调控因子，尽管P.anserina和S.pombe在5.5亿年前进化分分离，两种HMG-box基因SOX9及其上游调节因子SRY也在哺乳动物的性别决定中发挥重要作用。P.aserina和裂殖酵母S.pombe交配型基因及其上游调节因子形成的HMG-box基因模式类似于动物中的SRY/SOX9模式，揭示了动物和真菌在性别调节的共同性。图1.2柄孢霉中HMG-box基因的遗传网络（引自AitBenkhalietal.，2013）Fig1.2GeneticnetworkofHMG-boxgenesthatregulatematinginP.anserina（FromAitBenkhalietal.，2013）PaHMG7基因含有与本研究中的VmHMG7基因相同的SprT-like结构域，与PaHMG3共同调控着子实体的分布，对有性生殖没有影响。在其他真菌中，HMG-box基因还起着多种作用。在施乐乐（2014）等用农杆菌介导，将一个内源HMG-box基因fvhom1介导进金针菇，发现fvhom1基因抑制了菌丝生长，促进菌丝扭结形成原基；Aronstein（2007）等发现HMG-box影响着蜜蜂病原真菌蜂囊菌的复制过程；在白色念珠菌中，HMG-box基因与线粒体类核的形成相关；在裂褶菌中，具有HMG-box结构域的hom1和hom2敲除后，子实体变小且不再发育，培养基中的菌落变成不对称的形状，说明HMG-box基因与的菌丝生长及子实体形成有重要关系（Ohmetal.，2011）。禾谷镰刀菌MAT1-1-3、MAT1-2-1保守结构域为一个HMG-box，敲除后的子囊壳变小，孢子不可育。MAT1-2-1突变体的子囊壳壁变厚，并且自交后不产生子囊或子囊孢子，突变体侵染玉米秆时致病力下降，可能无法适应并侵染玉米秆（郑倩，2015）。8 山东农业大学硕士学位论文HMG-box基因的研究已经较为深入，但大多局限于模式真菌中，并集中于对生殖调控有关的MATA基因的研究，仍有许多含有HMG-box结构域的HMG-box基因未得到鉴定。1.4丝状真菌基因功能的研究方法1.4.1基因功能的主要研究方法1.4.1.1基因敲除（knockout）技术基因功能的验证，主要采用了基因敲除（knockout）技术。将由靶基因的侧翼序列和融合标记基因组成的敲除载体引入真菌基因组中，然后通过同源重组实现敲除，破坏了目的基因功能的表达，继而通过观察缺失突变体与野生型菌株之间的表型差异，来分析该基因的功能。在丝状真菌中，主要通过同源重组（homologousrecombination）来完成基因的敲除（knockout）或者破坏（disruption）。基因敲除技术的前提为目的基因的序列已知。同源重组的原理是，根据该已知序列，设计出与目的基因侧翼的同源性较高的敲除载体，而目的基因部分用其他筛选标记基因替换，将敲除载体导入野生型菌株的细胞中，由于敲除载体的浓度较大，细胞把原本基因组中的“错误基因”置换下来，将目的基因替换成了筛选标记基因，使其功能丧失，进而删减了目的基因与位置无关的功能。细胞恢复后，最终能够对整个有机体产生其他的改变。我们通过这种改变，推测出与该基因相关的生物学功能。几乎所有应用于丝状真菌的遗传转化方法都可以达到同源重组的目的，但与其他转化方法相比，农杆菌介导和粒子轰击具有较高的同源重组效率，更适用于真菌靶基因（Davidsonetal.，2000），土壤杆菌高同源重组率及其T-DNA线性和单链特征是优选的载体和同源重组的转化方法，而丝状真菌的电穿孔和原生质体转化效率相对较低。不同真菌的效果非常不同，导致转换效率相对较低（Bundocketal.，1996；deGrootetal.，1998）。基于同源重组的靶基因敲除效率主要受到同源臂长度，转化方法和靶基因的基因组位置等因素的影响（Birdetal.，1997；Davidsonetal.，2000）。在同源重组中同源臂的长度随物种而异，如S.cerevisiae，以实现同源重组，其同源臂的长度仅为约100bp，丝状真菌的通常同源重组需要至少1kb侧翼同源序列（Michielseetal.，2005；9 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析Wendlandetal.，2003；Wilsonetal.，2002）。通过重叠PCR构建的线性敲除载体可用于基因推测和PEG介导的原生质体转化，并成功应用于新型新型隐球菌，构巢曲霉，Fumigatus和Fusariumgraminarium（Davidsonetal.，2002；Yuetal.，2004）。重叠PCR是快速丝状真菌同源敲除载体构建方法，其可以构建超过1kb的同源侧翼序列。1.4.1.2RNA干扰（RNAi）RNAi沉默是指在转录后水平上干扰基因的表达。其作用的原理是通过使用dsRNA介导，特异性的抑制同源基因的表达，并抑制其相应功能和表型，因此也称为转录后的基因沉默（Nakayashikial.，2005）。其中RNAi沉默的限速步骤是RNA双链的合成，通过整合到基因组DNA中，编码形成与靶基因互补的双链RNA。通过重复序列与目标基因在折叠结构后形成发夹，干扰基因在转录水平上的表达。重复片段的长度不同，干扰的效率将不同，200bp是可以发生的最短干扰序列（Goldonietal.，2004）。RNAi技术的最大特点是其特异性。与基因敲除技术相比，RNAi在某些方面具有一些优势。由于RNAi技术作用于转录水平，对多拷贝基因和非转化核酸影响不大。此外，当一些基因家族同时具有部分保守序列时，整个家族可以通过RNAi技术遗传减少，消除家族内的基因冗余和互补功能（Mouynaetal.，2004）。1.4.1.3过表达与RNAi技术相反，过表达加强了靶基因的表达，结合加强后的表型、致病性等生理生化特征，解释了基因的功能，过表达广泛应用于丝状真菌（Horioetal.，2005）。通过PCR克隆丝状真菌的靶基因，然后与启动子连接，通过转化将重组片段引入丝状真菌中，以增强靶基因的表达，然后通过表型、致病性等生理生化的变化，阐述了基因功能的特征。Stiler（1996）通过在Metarhiziumanisopliae中过表达Prl蛋白酶基因，大大增加了菌株的毒力，表明Pr1是与细菌毒力密切相关的基因。1.4.1.4酵母双杂酵母双杂是在体外分析DNA和细胞内蛋白质相互作用的一种方法。为了研究已知功能的基因，或与已知的基因相关的蛋白，用多重筛选基因的方法来研究基因新功能的重要方法。酵母杂交是通过让DNA与细胞内蛋白质相互作用，而用来分析DNA结合10 山东农业大学硕士学位论文位点与结合蛋白的方法。通过分析酵母中报道基因的表达，鉴定出DNA结合位点，发现了潜在的结合蛋白基因，或分析了DNA结合位点。使用这种技术，可以筛选与DNA结合的蛋白质，并且可以从基因文库直接获得编码该蛋白质的核苷酸序列。Liu等利用该技术分离了里氏木霉木聚糖酶启动子的转录因子（2004）。该系统的方法可以通过研究基因之间的相互作用，来探究未知基因的功能，也可以用来研究丝状真菌中，两种基因的表达产物之间的相互作用。通过研究FRP1和Skp1之间的相互作用，证实FRP1基因在马铃薯病原体中对尖孢镰刀菌的致病性具有重要作用（Duyvesteijnetal.，2005）。酵母双杂交系统已成为研究已知基因功能或已知基因之间几种基因功能的重要方法。1.4.1.5转座子技术2001年，Viilalba使用转座impala实现了稻瘟病菌的转化（Villalbaetal.，2001）。GuangganHu使用修饰后的GPS3转座子，实现对隐球酵母（Cryptococcusgattii）的转化，并在随后的研究中成功分离了许多功能基因（Huetal.，2006）。该技术不需要高效的转化体系，避免了基因组的损伤和重排（Villalbaetal.，2001）。Firon，Villalba等于2003发现，并非所有真菌中均存在转座子，且由于在转座子的稳定性及随机插入方面不能完全满足遗传分析的要求，所以该技术在许多丝状真菌的应用上受到限制。目前，转座子突变仍处于植物病原真菌插入的初期阶段。1.4.2遗传转化的方法将外源基因介导入受体细胞并表达外源基因的方法。1928年Griffth等报道了热休克肺炎链球菌的转化，证明外源基因可以在受体细胞中首次表达（Lorenzetal.，1994）。1973年，Mishra和Tatum首次报道了粗糙脉孢菌的遗传转化，以实现丝状真菌的遗传转化（Mishraetal.，1973）。植物致病真菌的遗传转化首次在1985年通过Cochliobolusheterostrophus的遗传转化实现（Turgeonetal.，1985）。目前已经建立了丝状真菌的多种转化系统，包括PEG介导的转化（PEG-CaCl2），电击转化法，基因枪，限制性内切核酸酶介导的转化（REMI），根癌农杆菌介导的转化（ATMT）等。11 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析1.4.2.1PEG-CaCl2介导PEG-CaCl2介导的真菌遗传转化基于原生质体作为感受态细胞，受体细胞悬浮于含有DNA溶液的质粒中，以一定浓度的PEG-CaCl2和pH8-9条件转化（周礼红等，2005）。1974年由Kao和Michayluk建立，然后将PEG的原生质体转化逐渐应用于丝状真菌（Caseetal.，1979；Turgeonetal.，1985；Wangetal.，1988）。PEG介导的原生质体转化技术已经在许多真菌中成功应用。PEG介导的原生质体转化是敲除靶基因，验证基因功能的有力工具。使用这种方法在稻瘟病菌，尖孢镰刀菌等致病真菌的信号转导、生长发育、发病机制等相关基因敲除突变体的研究中得到广泛报道，取得了重要进展（Bluhmetal.，2007）。近年来，PEG介导的原生质体的遗传转化已经在更广泛的背景下，例如绿色荧光蛋白的表达（Ancoetal.，2009），同源基因替代（Lietal.，2004）等。PEG-CaCl2转化法的前提条件是成功获得大量具有较强活性的原生质体。此外，该方法的转化效率与PEG的分子量和浓度，稳定剂浓度、pH和转化物质密切相关（李刚等，2004）。1.4.2.2根癌农杆菌介导Bundock等人第一次使用ATMT来成功转化酵母。1998年，deGroot也成功使用了ATMT丝状真菌，到目前为止，已经通过ATMT成功地转化了40多种丝状真菌。与其他转化技术相比，ATMT具有广泛的受体，转化效率高（Mullinsetal.，2001），单拷贝转化子多，T-DNA的同源取代及能够在插入位点的两端获得序列（Whiteetal.，2006）的优点，因此广泛应用植物病原真菌遗传系统和病原性研究基因，但不是所有的真菌都可以使用ATMT技术来实现成功的转化。1.4.2.3电击转化法Zimmerann于1979年开发，经过多年的应用和改进，已被广泛应用于动植物细胞融合和外源DNA遗传转化，（王关林，1998）。由于丝状真菌原生质体的转化效率不是很高，因此，很少有丝状真菌通过电击转化。12 山东农业大学硕士学位论文1.4.2.4基因枪法2+通过向DNA溶液中加入Ca，亚精胺等沉淀剂，将DNA吸附在金属颗粒（金或钨）的表面上，制成“DNA微弹”。在激发基因枪的瞬时力量下，以一定的速度进入受体细胞，以达到转化的目的。但其具有转换效率低、昂贵、嵌合体不容易排除的缺点。1.4.2.5显微注射法本方法是将外源DNA通过机械手段，使用显微注射装置直接注入细胞质或细胞核。然而，由于缺乏固定原生质体、壁细胞或细胞簇的有效方法，这种方法的应用受到很大限制。1.4.2.6醋酸锂转化法+以完全细胞为受体材料，高浓度Li诱导后，细胞通透性增强，有利于外源DNA通过细胞壁进入细胞体。然而，该方法的应用范围很窄，仅限于一些丝状真菌(Olmedo-Monfiletal.，2004)。1.5本研究的目的、意义及技术路线1.5.1本实验的目的及意义我国的苹果种植面积以及苹果产量均处于世界的领先地位。苹果是农民收入的重要支柱。由苹果腐烂病菌（Valsamalivar.mali）引起的苹果腐烂病威胁着苹果产业的健康稳定。苹果腐烂病危害苹果树枝干和果实，在我国各大苹果产区均有发生且有愈演愈烈之势，严重地影响了苹果的产量和质量，给农业生产造成了重大的经济损失，是我国苹果生产健康有序发展的重要阻碍因子。此外苹果腐烂病菌寄主范围广泛，能在热带和温带许多木本植物和经济作物上引起巨大的损失。由于对病原体的发生规律、致病机理的认识不清楚，导致病害的预防和控制工作被动，低效和盲目，最终导致了苹果产量和经济的损失。因此，深入研究苹果腐病的病原机制，有利于揭示疾病发生与发展的规律，也能对中国苹果生产安全具有重要的理论指导意义和实践价值。揭示苹果腐烂病菌的致病机理，明确其与寄主互作的本质，并掌握病害发生发展规律已显得迫在眉睫。13 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析目前在苹果腐烂病菌研究中，实验室前期工作建立了PEG介导的苹果腐烂病菌的遗传转化体系（陈亮，2014）。本实验室ATMT介导获得的突变菌株FL550菌落生长不对称，致病性降低。为分析其原因，对插入位点进行侧翼序列克隆，分析出其突变位置为8号染色体（CM003105.1）的2336793到2341108之间，影响了VmHMG7基因及1，3-β-葡聚糖合酶。HMG基因在多种真菌中都有分布，其在DNA的转录、修复、细胞凋亡及免疫中起着重要的作用，进而对真菌的菌丝生长、有性周期、子实体发育、致病性起着重要的调控作用。对该基因的研究主要集中在模式真菌中，且集中于对有性生殖的研究，在苹果腐烂病菌中并没有相关的研究和报道。本研究旨在通过建立苹果腐烂病菌VmHMG7基因敲除突变体，进而分析其表型和致病性变化，对VmHMG7基因的功能进行初步注释，为研究苹果腐烂病的致病机制、掌握其与寄主的互作关系提供科学依据，最终为苹果腐烂病菌的科学有效的防控提供策略。1.5.2本实验的技术路线本研究以ATMT介导的突变体库中已筛选出的菌落形态、生长和致病性均出现变异的突变体FL550为出发菌株，通过侧翼序列扩增，分离克隆了HMG-box基因，利用生物信息学方法，从腐烂病菌全基因组数据库中鉴定出苹果腐烂病菌HMG-box家族，利用MEGA5软件对基因家族的进行了系统进化分析，利用MapDRAW及GSDS方法进行了基因家族成员的结构及染色体定位；利用融合PCR技术将苹果腐烂病菌HMG（VmHMG7）基因上下游片段与及潮霉素筛选标记基因（hygromycinphosphotransferasegene，HPH）构建敲除载体，应用PEG-CaCl2介导原生质体，将敲除载体转化到野生型菌株中，然后经过潮霉素的筛选、PCR扩增和Southern杂交，基因敲除和敲除菌株培养学、形态学、生长和致病性等表型分析，初步分析了HMG-box基因的功能，研究技术路线如下：14 山东农业大学硕士学位论文侧翼序列扩增hiTail-PCRFL550突变基因的分离和序列分析基因克隆家族成员鉴定Blast基因的结构分析GSDSMUSCLE系统进化分析VmHMG基因家族生物信息学分MEGA5析蛋白质结构域分析NCBI-CDD基因的染色体定位MapDRAW蛋白分子量、等电点预ExPASy测敲除突变体构建及验证敲除载体构建融合PCRVmHMG7基因功能分析原生质体制备潮霉素初筛PEG-CaCl2介导突变体的表型分析PCR检测Southern杂交培养学特征形态学特征致病性测定15 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析2材料与方法2.1试验材料2.1.1供试菌株苹果腐烂病菌（Valsamalivar.mali）野生菌株sdau11-175，分离于发病的苹果枝干（辽宁，瓦房店E122°025.96’；N39°46.046’），经检测为强致病力菌株。用20%甘油，4℃低温保存，待用。ATMT突变菌株FL550，菌丝紧实，子实体数量增多，体积变小，菌落呈不对称型菱花状，与野生菌株差异较大，菌株致病性降低。2.1.2细菌及质粒大肠杆菌（Escherichiacoli）为DH5α感受态细胞、克隆载体为pMD18-T（Takara，大连），质粒pCB1003（山东农业大学植物保护学院梁元存副教授惠赠）。2.1.3试剂和生化试剂2×EstaqmixDNA聚合酶、快速琼脂糖凝胶回收试剂盒、DM2000DNAmaker、1kbDNALaddermaker、50bpDNALaddermaker均购自北京康为世纪生物科技有限公司。DL5000DNAmaker、限制性核酸内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司。Driselase、LysingEnzyme、HygromycinB均购自Sigma-Aldrich。本实验其试剂和药品均为国产分析纯。2.1.4培养基及溶液配制具体试剂见附录。2.1.5实验仪器朗基A300PCR仪，北京六一DYY-8C电泳仪，艾本德移液器，冷冻离心机，凝胶16 山东农业大学硕士学位论文成像仪，超净工作台，恒温培养箱，水平摇床，水浴锅，低温槽，高压灭菌锅、称量天平、移液枪、研钵、研杵等。2.2方法2.2.1FL550突变基因的分离和序列分析2.2.1.1突变体基因组DNA提取（1）将玻璃纸（cellophane）剪成略小于培养皿直径的圆形，放置于培养皿中，加入少量去离子水，121℃灭菌20min；（2）将灭菌后的玻璃纸贴于PDA平板表面，并将培养基于玻璃纸间气泡赶出；（3）用打孔器在菌落边缘取6mm直径的菌饼，按五点取样法的形式，将菌饼接种到玻璃纸表面，在25℃黑暗培养5d；（4）收集玻璃纸表面的菌丝到灭菌的研钵中，向研钵中缓慢的加入液氮，快速研磨，重复3次，至菌丝被研磨成粉状。将研磨充分的2g菌丝装入1.5ml离心管中；（5）向离心管中加入1ml预热的2×CTAB抽提取缓冲液，颠倒混匀，65℃水浴15min，每隔3-4min颠倒混匀一次；（6）室温的条件下，12000rpm离心7min，转移上清液到新2ml离心管中；（7）加入等体积的体积比为酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），剧烈震荡15s，至液体呈均一乳白色；（8）室温的条件下，12000rpm离心10min，吸取上清液，转移至新2ml离心管；（9）加入2.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀，冰浴30min；（10）室温的条件下，12000rpm离心10min，然后弃去上清液，加入500uL预冷75%乙醇，12000rpm，离心5min，然后弃去上清液；（11）重复步骤5。12000rpm离心1min，用枪头吸出残余的乙醇，置于超净工作台中，室温通风的条件下，干燥5min；（12）加入30uLTE或ddH2O溶解，置于-20℃保存备用。17 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析2.2.1.2侧翼序列扩增采用高效热不对称交错PCR（hiTAIL-PCR）对FL550侧翼序列进行扩增。以FL550基因组DNA为模板，扩增T-DNA插入位点左右侧翼序列。引物如表2.1所示：表2.1hiTAIL-PCR引物Table2.1theprimersofhiTAIL-PCRPrimerSequencesLADACGATGGACTCCAGAGWAGTGNAGWANCANAGAAC1ACGATGGACTCCAGAGRB1ATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGRB2GGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCRB3AGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGLB1GAATTAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGLB2CGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTLB3CCCGAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT注：W=A/T，N=A/C/G/T，V=A/C/G，B=C/G/T，D=A/G/T；RB为右侧翼序列扩增引物，LB为左侧翼序列扩增引物。TAIL-PCR各级反应体系：2×EsTaqmix10μlSpecialprimer（10μM）0.5μlADprimer（10μM）1.5μlTemplate1μlddH2O7μlTotal20μl一级（Primary）反应中，模板为突变体菌株基因组DNA；二级（Secondary）反应、三级（Tertiary）反应中，模板分别为上一级反应产物稀释1000倍。表2.2hiTAIL-PCR各级反应程序Table2.2ThermalconditionsforhiTAIL-PCRReactionFileCycleThermalconditionNo.No.Primary1193℃（2min），95℃（1min）21094℃（30s），60℃（1min），72℃（2min）3194℃（30s），25℃（3min），rampingto72℃over3min,72℃（2min）41594℃（10s），60℃（1min），72℃（2min）94℃（10s），60℃（1min），72℃（2min）18 山东农业大学硕士学位论文94℃（10s），47℃（2min），72℃（2min）5172℃（10min）Secondary6194℃（1min）71594℃（10s），60℃（1min），72℃（2min）94℃（10s），60℃（1min），72℃（2min）94℃（10s），48℃（2min），72℃（2min）8172℃（10min）Tertiary9194℃（1min）103094℃（10s），50℃（1min），72℃（2min）11172℃（10min）各级反应产物均在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以DM2000maker为参照，每一级反应产物互为对照，其中第三步产物比第二步产物短约110bp左右的产物条带为特异性产物条带。2.2.1.3PCR特异性产物回收特异性产物回收使用康为世纪快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，具体操作步骤参照说明书。（1）将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管中，称量计算凝胶重量（提前记录离心管重量）。（2）向胶块中加入1倍体积BufferPG。50℃水浴，其间每隔2-3min温和地上下颠倒离心管，待溶胶液为黄色，以确保胶块充分溶解。（3）柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱（SpinColumnsDM）中加入200μlBufferPS，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（4）将步骤2所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2min，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（5）向吸附柱中加入450μlBufferPW，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。重复洗涤一次。（6）13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。室温放置3min，使酒精挥发干净。悬空滴加50μlddH2O，室温放置2min。13000rpm离心1min，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。19 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析2.2.1.4PCR特异性产物连接将回收的特异性片段连接pMD18-T载体，连接体系：胶回收产物3μlpMD18-T0.5μlSolutionⅠ5μlddH2O1.5μlTotal10μl低温恒温槽中16℃过夜。2.2.1.5转化（1）从-80℃冰箱中去出50μl大肠杆菌DH5α感受态离心管，置于冰上融化；（2）将10μl产物连接液全量加入离心管中，颠倒混匀，简短离心；（3）将感受态细胞冰浴30min；（4）42℃热激50s，然后迅速置于冰上，冰浴2min；（5）向感受态细胞中加入550μlLB液体培养基，放置于恒温摇床中，37℃，180rpm，水平振摇1h；（6）取适量菌液均匀涂布于LB（100μl/mlAmp）固体培养基平板表面，37℃倒置培养过夜。2.2.1.6PCR检测用灭菌的牙签，在LB培养基表面挑取不同单菌落，重新在含100μl/mlAmp的LB培养基表面划线培养，并分别将牙签在对应的200μlPCR管中搅动数次，在PCR管中加入各反应组分，进行PCR扩增。反应体系如下：2×EsTaqmix10μlRV-Mprimer（10μM）1μlM13-47primer（10μM）1μlddH2O8μlTotal20μl20 山东农业大学硕士学位论文反应程序：94℃3min94℃20s55℃1min30cycles72℃1min72℃10min4℃forever取5μlPCR产物，在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，以DM2000maker为参照，观察条带的有无及大小。2.2.1.7侧翼序列分析将阳性克隆菌落摇菌后送至华大基因测序，将得到序列用ApE软件进行本地比对分析，剔除pMD18-T序列和pKO1-HPHT-DNA序列，得到侧翼序列在使用NCBIBlastx进行在线分析，并结合西北农林科技大学（尹志远等，2015）测得的Valsamali03-8基因组序列使用BioEdit软件进行本地分析，获得T-DNA插入致病相关基因的位置，致病基因全长序列及相关信息。根据西北农林科技大学测得的Valsamali03-8基因组序列，在基因的两端设计引物，在野生型菌株sdau11-175进行克隆，得到目的基因全长序列，并与已知真菌的基因进行blastx对比分析，下载同源性高的蛋白序列，在MEGA5软件（http://megasoftware.net）中，用邻接法做系统发育树，自举值设为1000（序列编号见表2.3）；在突变体FL550中进行克隆，得到含T-DNA的目的全长序列，与目的基因进行对比分析，确定T-DNA的插入位点和方式。表2.3参比蛋白序列Table2.3InformationofreferencesequencesSequencesnameGenBankNo.Valsamalivar.pyriKUI58241.1DiaporthehelianthiOCW43717.1MarssoninabrunneaXP_007295314.1OphiostomapiceaeEPE02732.1ColletotrichumorbiculareENH83764.1EscovopsisweberiKOS23376.1FusariumoxysporumEWZ92622.1PurpureocilliumlilacinumOAQ79078.1TolypocladiumophioglossoidesKND90781.121 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析MagnaportheoryzaeXP_003718106.1VerticilliumdahliaeXP_009656663.12.2.2苹果树腐烂病菌HMG-box基因家族分析2.2.2.1HMG-box基因家族成员鉴定将HMG-box家族基因（cd00084）的每个亚家族的40个氨基酸的一致核心序列（表1.1）（Martinetal.，2010）tblastn比对分析，得到一些短的肽段；利用苹果腐烂病菌全基因组序列（KeXetal.，2014），构建本地BLAST数据库，用NCBI上截取短肽段进行本地BLAST（1e-003）搜索，对基因进行染色体定位，筛除重复基因，从NCBI上得到全基因序列及蛋白编号。所得结果利用NCBI-CDD工具进行蛋白结构预测，删除不含HMG-box结构域的蛋白及无完整读码框的序列，确定保守结构域及其在HMG-box家族中的分类；利用ExPASyProteomicsServer（http://expasy.org/）对HMG-box成员的氨基酸进行分子量、等电点预测（Artimoetal.，2012）。提取sdau11-175的DNA为模板进行PCR扩增，引物见表2.3。表2.3基因检测引物Table2.3Primersforgenedetection扩增片段引物序列（方向5’-3’）片段大小FragmentPrimersSequences(5’-3’)Length1-FGCAAACGACTCAATCCACCCTGVmHMG1962bp1-RTCCGTCTTGTCATTCTCCGC2-FATCCCAAACCCAACACTGCCAAGVmHMG23245bp2-RAATCATCAGACAAACGGCACAAC3-FATGCCTAAGGCCGCAGCAAAVmHMG3303bp3-RTTACTCCTCGTCCTCCTCCTG4-FGCACGGGAGGAGCAAAGCATAVmHMG41231bp4-RCACTAACAGTCGTTTACCATACAGC5-FATTCCTCTCTCGCCTACCTCCTCVmHMG51705bp5-RGTGCTGTGGCTGTAAATGGC6-FCTCTCCTCCTTACCGTCGCAVmHMG63348bp6-RATGCTGCACCTGCTCGAC7-FATGGCGAGGCAGGCAAGVmHMG72242bp7-RGATTGTTGGAAGGAAAGGGCTG8-FCTTTGCGACAGCGTGGTTCVmHMG83758bp8-RAGCCGACATACACATTCCCAG22 山东农业大学硕士学位论文2.2.2.2系统发育树分析与蛋白质保守域序列比对通过MUSCLE程序（Edgaretal.，2004）对苹果腐烂病HMG-box蛋白及粗糙脉胞菌进行多序列联配比对分析，序列联配比对结果使用MEGA5（http://megasoftware.net）（Tamuraetal.，2011）邻接法（Neighbor-Joining，NJ）生成HMG-box的系统进化树，校验参数Bootstrap重复1000次。2.2.2.3HMG-box基因结构及染色体定位分析利用MapDraw（刘仁虎等，2003；王竹林等，2012）和GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）（郭安源等，2007）工具分别进行染色体定位及基因结构作图（王小非等，2013；Wangetal.，2013）。2.2.3VmHMG7基因功能分析2.2.3.1VmHMG7基因敲除载体的构建2.2.3.1.1VmHMG7基因敲除载体引物设计以苹果腐烂病菌基因组序列为模板，设计构建敲除载体的引物及检测敲除突变体的引物。引物序列如表2.4所示，并且引物位置于图2.1中标出。SYTY-F/R和XYTY-F/R扩增目的基因编码区侧翼序列。HPH-F/R扩增与侧翼片段融合的HPH片段。其中引物SYTY-R和XYTY-F末端带有HPH基因两端同源的尾巴（表中用小写字母标示）。表2.4基因敲除载体构建及检测引物Table2.4Primersforgeneknockoutcassetteestablishedanddetection扩增片段引物序列（方向5’-3’）FragmentPrimersSequences(5’-3’)HMG上游片段hmg-SYTY-FCAACGTGCCGCATATCAAGGhmg-SYTY-RattcattgttgacctccactAAGGTCATCAAGCAGGAGAhmg-XYTY-FgggcaaaggaatagagtagaGTCAGTGTCTCGGATGTCAGCHMG下游片段hmg-XYTY-RGCATGAACGGTTCCATAACGGHPH-FagtggaggtcaacaatgaatHPH片段HPH-RtctactctattcctttgcccPCR验证L1QCYZ-F1TCCGTCTCTCTCTCTCTCGCATAC23 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析QCYZ-R1CAGTTCGGTTTCAGGCAGGTQCYZ-hph-FTATTAGCAGACAGGAACGAGGACPCR验证HPHQCYZ-hph-RCTTCTGCGGGCGATTTGTGTAQCYZ-F2TACACAAATCGCCCGCAGAAGPCR验证L2QCYZ-R2CGTCCTCACACAACATACCTACCAQCYZ-hmg-FGCACTCCCACACGTACTTAAAGTCPCR验证HmgQCYZ-hmg-RCGAAACCTCATCACATACCAAGCGRV-MGAGCGGATAACAATTTCACACAGG菌落PCRM13-47CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC2.2.3.1.2野生型菌株sdau11-75基因组DNA的提取提取步骤参考2.2.1。2.2.3.1.3质粒pCB1003的提取质粒提取采用碱裂解法，步骤如下。（1）挑取保存的含有pCB1003质粒的保存菌液，于LB平板表面划线，37℃过夜培养。（2）挑取LB平板表面的单菌落于20mlLB培养基中，以150rpm的转速，摇菌过夜。（3）取1.5ml菌液于离心管中，4000rpm离心2min，然后然后弃去上清液。可重复多次。加100uL溶液I，涡旋混匀。（4）加200uL新鲜制备的溶液II，温和的上下颠倒5-10次，在冰上静置2min，<=5min，至开盖有粘丝。（5）缓慢加入150uL冰冷的溶液III，温和颠倒1-2次，冰上静置10min。（6）室温条件下，12000rpm离心10min，离心上清液转移到干净的离心管中。加入等体积的体积比为的酚：仿：异戊醇（25:24:1）混合液，震荡至液体呈乳白色。（7）室温条件下，12000rpm离心10min，上清液移至新管。加入上清液2.5倍体积的无水乙醇或者等体积的异丙醇，温和颠倒混匀，冰浴30min，12000rpm离心5min，然后然后弃去上清液。（8）加500uL的75%乙醇，颠倒混匀洗涤1-2次，12000rpm离心1min，然后弃去上清液，重复一次。（9）12000rpm离心1min，用黄枪头吸尽残液，于超净工作台中室温开盖晾干5min。（10）加30uLTE或ddH2O，在室温条件下，放置超过30min以上，溶解提取物，置于-20℃保存备用。24 山东农业大学硕士学位论文2.2.3.1.4Double-jointPCR方法构建基因敲除载体（1）单片段的扩增以苹果树腐烂病菌野生型菌株sdau11-175的基因组DNA为模板，分别用引物SYTY-F/R和XYTY-F/R扩增出基因的上下游片段SYTY和XYTY，切胶回收产物。以pCB1003为模板，引物HPH-F/R扩增出HPH片段，PCR程序同1中，胶回收PCR产物。PCR反应体系：Takaraprimer-STARMax25μL模板0.5μL正向引物（10μM）1.5μL反向引物（10μM）1.5μLddH2O21.5μLTotal50μL混匀后稍离心除去气泡。PCR反应程序：98℃10s55℃5s/15s72℃2kb/min35cycles72℃5min4℃forever退火时间为根据引物的Tm值而定。Tm值（℃）＝2（NA＋NT）＋4（NC＋NG）-5。当引物Tm值均为55℃以上时，退火时间为设定为5s；当引物Tm值有一个为55℃以下时，退火时间为设定为15s。此公式适用于25mer以下的引物，超过25mer时，退火时间为设定为5s。取5μlPCR产物，在1%的琼脂糖凝胶中电泳，以DL5000DNAmaker为参照，观察条带的有无及大小。（2）Double-jointPCR扩增第一步：将上下游片段以及HPH片段混合进行扩增。PCR反应体系：25 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析primeSTARMax25μL上游片段SYTY0.5μL下游片段XYTY0.5μLHPH片段0.5μLddH2O20.5μLPCR反应程序：98℃10s55℃5s/15s8cycles72℃2kb/min4℃foreverTm值为中间搭桥片段的Tm值。第二步：以第一步的产物为模板，直接加入引物最两端引物SYTY-F/XYTY-R：1.5μL。PCR程序如下：98℃10s55℃5s/15s35cycles72℃2kb/min72℃5min4℃forever取5μlPCR产物，在1%（w/v）琼脂糖凝胶中，以120V，100A的电泳，检测PCR结果，以DL5000DNAmaker为参照标准，观察条带的有无及大小。若有目的条带，则将全部产物电泳，目的条带切胶回收。切胶回收步骤见试剂盒。2.2.3.1.5敲除载体的检测为确定敲除载体构建成功，并长期保存敲除载体，需将敲除载体连接到宝生物公司生产的pMD18-T的载体，转化大肠杆菌感受态DH5-α细胞，然后送公司测序。若测序结果与所构建的敲除载体一致，则构建成功。（1）PCR产物加A因为Takaraprimer-STARMax的产物为平末端，所以在连接pMD18-T载体之前，26 山东农业大学硕士学位论文需将上述PCR产物加A尾巴。体系如下：Taq（5U）1ul10×buf1uldATP（2.5mM）0.8ul胶回收产物7.2ulTotal10ul混匀液体后轻微离心，在PCR仪中进行反应。72℃或70℃反应15min。（2）连接pMD18-T载体具体反应步骤见2.2.4。（3）连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞具体反应步骤见2.2.5。（4）单菌落PCR验证阳性克隆具体反应步骤见2.2.6。取5μlPCR产物，在1%（w/v）的琼脂糖凝胶中电泳，以DL5000DNAmaker作为参照的标准，观察条带的有无及大小。（5）敲除载体的保存挑取条带大小正确的一个菌落，摇菌后送公司测序，进一步验证敲除载体的正确性。验证正确的单克隆，重新划线后，挑取单菌落，转接入含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃的恒温摇中，150rpm，震荡培养4-6h。取1ml菌液于1.5ml离心管中，室温下4000rpm，离心2min，然后然后弃去上清液，收集菌体，重复收集3次后，加入1ml20%甘油，震荡混匀后，置于-80℃保存。2.2.3.1.6敲除载体的PCR扩增（1）质粒的提取挑取先前验证过的含敲除载体的大肠杆菌单菌落，用含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基摇菌过夜或12-16h。剩余的提取步骤见2.4.1.3。（2）敲除载体的PCR扩增以质粒为模板，敲除载体的两端hmg-SYTY-F/hmg-XYTY-R为引物，扩增敲除载体。PCR扩增的体系如下：27 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析2×EsTaqmix25μL模板0.5μL正向引物（10μM）1.5μL反向引物（10μM）1.5μLddH2O21.5μLTotal50μL取5μlPCR产物，在1%（w/v）的琼脂糖凝胶中电泳，以DL5000DNAmaker为参照，观察条带的有无及大小。2.2.3.2基因敲除2.2.3.2.1野生型苹果腐烂病菌原生质体制备1、酶解液的配制（1）转移10ml的1.2M的KCl，装于50ml离心管中。（2）称取崩溃酶0.15g和裂解酶0.15g，加入1中的离心管中。（3）盖紧离心管，摇匀，放在摇台上30℃，30min，100rpm左右。（4）离心3500-4000rpm，10min。（5）用细菌过滤器吸上清液再通过膜滤出，上清液滤入到50ml离心管中，可分装或直接放入-20℃冷冻备用。2、原生质体的制备方法参照陈亮等（2014）。（1）刮取贴有玻璃纸的PDA平板上的11-175菌丝于装有100mlPD培养基的250ml三角瓶中，放置在25℃的恒温摇床中，以150rpm的转速，培养至菌丝较多且幼嫩，约2天。（2）通过抽滤的方式，过滤培养基，无菌水清洗2-3次后，收集菌丝体，以每10ml酶解液中放置0.5g菌丝体的比例，将两者混匀。30℃90rpm，酶解约2小时。（3）用细胞过滤器，滤除酶解残体，用1.2MKCl冲洗2-3次，液体收集至50ml离心管，室温下，4000rpm离心6min。（4）然后弃去上清液，加入15mlSTC缓冲液轻微的重新悬浮，放置于4度离心机中，4000rpm离心15min。28 山东农业大学硕士学位论文（5）重复步骤（4）。然后弃去上清液，加入1mlSTC缓冲液，重新悬浮，用血球7计数板镜检，然后将原生质的浓度调至每毫升约1×10个。（6）将原生质体，按照平均每管约100ul的体积，分装到1.5ml的离心管中，然后放置的-20℃，保存备用。但尽量在1个月内用完。2.2.3.2.2PEG介导转化方法参照高静（2011）。（1）将DNA片段加入原生质体（每100μl原生质体加入10μg-15μgDNA片段），室温静止20min。（2）加入1mlPTC到管中，轻轻翻转混合均匀，室温静置20min。（3）转移上述液体至5ml离心管，加入5mlTB3和6ul卡那霉素（100ug/ml），封口，25℃，100rpm，斜悬摇培24-36h。2.2.4突变体验证2.2.4.1潮霉素初筛（1）将再生后的原生质体，放置于4℃离心机中，5000rpm离心15min，然后弃去上清液液，加入1mlSTC缓冲液，用剪大开口并灭菌的枪头，轻微的吹浮，使其混匀。（2）将TB3固体培养基融化，待温度降低到50℃时，加入氨苄青霉素至终浓度100μg/ml，加入潮霉素至终浓度50μg/ml，摇晃均匀，转移培养基到含有已复生原生质体的50ml离心管中，混匀后快速倒平板。（3）25℃培养3-4d后，平板上长出单菌落突变体，挑取突变体到含有100μg/ml的潮霉素的PDA培养基上继续筛选，并用野生型菌株sdau11-175做对照。（4）将筛选后抗潮霉素的突变体保存备用（20％甘油，-80℃）。29 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析2.2.4.2PCR检测图2.1敲除载体的构建及突变体PCR验证示意图Fig.2.1ConstructionoftheknockoutvectorandthemutantdetectionbyPCR用CTAB法快速提取突变体DNA，方法见步骤2.2.2。用四对引物（表2.4）对突变体进行检测，其位置如图2.1所示：引物QCYZ-hph-F/QCYZ-hph-R：检测HPH基因的存在；引物QCYZ-F1/R1：检测上游片段是否发生同源重组；引物QCYZ-F2/R2：检测下游是否发生同源重组；引物QCYZ-hmg-F/R：检测目的基因是否被成功敲除。只有当图中三个同源重组同时发生，且QCYZ-hmg-F/R引物无扩增信号时，表明目的基因VmHMG7被HPH基因成功代替，从而实现目的基因的定点敲除。2.2.4.3Southern杂交方法参照刘立鸿等（2008）。2.2.4.3.1基因组DNA酶切提取sdau11-175及突变体的基因组DNA，用OneDrop测量DNA浓度，进而决定酶切时的DNA量。酶切体系：30 山东农业大学硕士学位论文HincII1μL10×H缓冲液2μLDNA20ug补ddH2O至20μL加样后混匀离心，放置于37℃水浴锅中，酶切8小时或过夜，加10×上样缓冲液终止反应，取5μL酶切产物进行1%（w/v）琼脂糖凝胶120V，100A电泳，检测酶切结果。剩余的酶切产物，加2.5V无水乙醇，冰浴沉淀30min，在室温下，12000rpm离心10min，然后然后弃去上清液，加7ulddH2O，室温放置30min，使DNA完全回溶。2.2.4.3.2电泳及转膜（1）向sdau11-175和突变菌株的DNA酶切产物中，加入1uL10×上样缓冲液，轻轻弹匀，然后混匀离心。（2）用1%（w/v）琼脂糖凝胶做120V，100A电泳，以DL5000DNAMarker作为对照，将sdau11-175和突变菌株的DNA酶切产物分别加入点样孔中，每个样品仅加入一个孔中。琼脂糖凝胶最外缘的空中端应加4ul的6×上样缓冲液作为电泳进度的参考。以15V的低电压（1V/cm）缓慢电泳过夜（约7.5h）。（3）电泳结束后，用溴化乙锭（EB）充分染色10min，放于凝胶成像仪中，将胶多余的部分切除，并且切角做胶的正反面的标记。准确的测量出剩余的胶块的长与宽，但应保证长宽不到10cm，并记录DL5000DNAMaker在琼脂糖凝胶的相对位置。（4）将琼脂糖凝胶放置在超纯水中，室温充分温和的漂洗10min后，置于约80ml的0.25MHCl溶液中，室温轻微的震荡洗涤20min，然后用超纯水漂洗5min后，将胶置于变性液中轻微震荡30min。（5）再用超纯水漂洗凝胶，然后将凝胶放置于中和液中，室温轻微的震荡15min，总共两次，再用超纯水漂洗。（6）剪将一张与凝胶等大的尼龙膜，在转膜之前在超纯水中充分浸泡约15min；剪三张与凝胶等大的3M滤纸，放置在在10×SSC缓冲液中浸泡；用3M滤纸剪一张盐桥滤纸，长度只要能保证能够垂在槽底即可，宽度比槽的宽度窄大概3cm左右，但必须大于或等于凝胶的宽度，31 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析（7）搭建盐桥：在转印迹槽中，倒入其三分之一体积的10×SSC缓冲液，槽边横放一玻璃板作为支持物。在支持物上放一张3M盐桥滤纸，两端注意应该没入到缓冲液中。（8）将一张浸湿的3M滤纸铺在盐桥的中间位置，将漂洗好的凝胶，背面朝上，放于滤纸之上，再将尼龙膜放于凝胶上，注意尼龙膜剪角做标记（杂交结果只出现在正面，即与凝胶接触的面）。用保鲜膜将凝胶四周封好，防止实验中，液体直接被吸水纸吸走而发生短路。（9）自尼龙膜向上依次置入：两张与凝胶大小相同的3M滤纸、一张干的滤纸、一打略小于滤纸的厚度至少5cm的吸水纸。压上平板之后，再加放上400-800g重物，注意平衡，防止倒塌。转膜期间，隔一段时间为，就应把贴近凝胶的吸水纸换为干燥的吸水纸，整体厚度不变（保证厚度，以便过夜转膜）。（10）转膜24小时取出尼龙膜，用5×SSC缓冲液漂洗干净，并且用干净的滤纸轻轻吸干表面的水分，再将尼龙膜夹到一张新的3M的滤纸中，80℃烘烤2小时然后将尼龙膜连同滤纸一起放入4℃保存。（11）转膜后的凝胶，用EB染色，在凝胶成像仪器中观察转膜效果。2.2.4.3.3探针模板制备采用PCR扩增法。利用引物从sdau11-175中，扩增在上游臂上400bp的片段，作为探针。反应体系如下：2×EsTaqmix250uLF（10μM）2uLR（10μM）2uL模板1uLddH2O20uLTotal50uL扩增程序为：32 山东农业大学硕士学位论文94℃5min95℃30s55℃1min72℃1min72℃10min4℃forever扩增完毕后，将所有的PCR产物进行1%（w/v）的琼脂糖凝胶120V，100A电泳，并进行胶回收。2.2.4.3.4探针合成（1）向一个PCR反应管中加入1μg模板DNA和ddH2O，使得最后的体积达到16μL，沸水浴或用PCR仪99℃，10min，然后迅速插入冰水混合物中。（2）取4μLDIG-HighPrime（1号管）加入到变性DNA中，混合后离心，37℃孵育20h。（3）加入2μL0.2MEDTA（pH8.0）终止反应。2.2.4.3.5杂交取5μL变性的地高辛标记探针，加入到55℃预热的地高辛杂交缓冲液中，充分混合。封口时避免产生较大的气泡。2.2.4.3.6洗膜（1）将缓冲液在65-68℃的水浴锅中水浴预热。打开摇床，温度设定至65-68℃。（2）用充足适量的2×SSC缓冲液和0.5%SDS缓冲液，连续振荡洗涤尼龙膜两次，每次洗涤时间为为5min。（3）用充足适量的0.5×SSC，0.5%SDS连续振荡洗涤两次，每次洗涤时间为为5min。2.2.4.3.7免疫检测2（1）杂交和洗膜后，将膜用洗涤缓冲液冲洗1-5min，在100ml/100cm封阻液中孵33 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析育30-60min（为降低背景噪点，时间可延长）。2（2）在20ml/100cm抗体溶液中孵育30min。2（3）用100ml/100cm洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min。2（4）在20ml/100cm检测缓冲液中平衡2-5min。2（5）将膜上带有DNA的一面朝上，放在培养皿中，向膜上加入1ml/100cm的在暗处的新鲜配制的显色液。（6）始终保持膜的潮湿，静置放在37℃的避光环境中，孵育时间为最长约4小时以增强发光反应，期间可以短时间为的看反应效果，一般几分钟就可以看到显色。期间不能使膜震荡。（7）用TE缓冲液洗涤尼龙膜。在凝胶成像仪中拍摄照片。2.2.5敲除突变体的表型观察和致病力测定2.2.5.1菌株的活化及培养（1）在超净工作台中，用PDA培养基倒培养皿，尽量保证每个平板的厚度一致，约20ml每皿。（2）在突变体菌株和野生型菌株sdau11-175的菌落的边缘，用打孔器（Φ=7mm）打取菌饼，分别接种到培养皿（Φ=9cm）的中心位置，在25℃恒温培养箱中，黑暗的状态下，倒置培养4d。（3）在上一批的菌株的菌落边缘，再用打孔器（Φ=7mm）打取菌饼，接种到新的PDA培养基上，以保证培养菌株的生活状态一致。培养的条件同上。2.2.5.2突变体菌落形态观察在接种4天后，观察并记录菌落的形状、正反面的颜色和气生菌丝的生长情况。2.2.5.3突变体生长速率测定及子实体测定（1）分别于第2到4天，用十字交叉的方法，测量菌落的生长直径，最后计算菌株的平均生长速率。（2）7d后转移至25℃恒温黑暗的条件下继续培养，观察繁殖体产生情况。34 山东农业大学硕士学位论文2.2.5.4突变体致病性测定（1）将离体的粗细一致的富士苹果枝条用自来水冲洗表面，用75%酒精浸泡表面，风干。（2）用灭过菌的刀片刮伤枝条的表皮，直径约0.5cm，每个枝条可均匀刮伤4个部位。（3）用打孔器（Φ=7mm）在野生型菌株sdau11-175、突变体菌株菌落边缘幼嫩处打菌饼若干，用挑针接种于刺伤部位；以无菌的PDA圆饼（Φ=7mm）做为空白对照。用保鲜膜包扎固定菌饼。（4）接种好的苹果放入25℃恒温培养箱中培养，于接种后4d-5d观察并记录接种点发病率，统计病斑大小。2.2.5.5数据分析每次实验设置3个重复，独立重复3次。统计实验数据，用SPSS统计软件对数据进行单因素方差分析（P<0.05）。35 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析3结果与分析3.1FL550突变基因的克隆及分析3.1.1FL550突变基因的克隆在突变体FL550的T-DNA左边界获得了约1500bp的特异性片段，在右边界获得了约800bp的特异性片段，产物条带如图3.1所示。图3.1hiTAIL-PCR产物电泳条带Fig.3.1ElectrophoreticbandofhiTAIL-PCR注：L（R）2、L（R）3分别代表第二三步反应产物，Marker为DM2000maker，白线指示条带为目标条带位置。3.1.2FL550突变基因的分析分别将两突变体的特异性片段切胶回收，连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取单菌落进行PCR验证。选取阳性克隆送至华大基因进行测序。使用BioEdit软件，将所获得的突变体T-DNA左右侧翼序列与西北农林科技大学测得的Valsamali03-8基因组（YinZetal.，2015）进行本地序列比对，并结合NCBIGenBank数据，发现突变体FL550中T-DNA插入位点在Valsamali第8号染色体（CM003105.1）的2336793和2341108之间，T-DNA置换掉了第8号染色体上共4316bp长度序列。被置换的序列包括VM1G_07985（VmHMG7）5’端部分序列及其启动子，VM1G_0798636 山东农业大学硕士学位论文（KUI72125.1）部分启动子序列，和两基因间的非编码区序列（图3.2）。图3.2FL550中T-DNA的插入位点Fig.3.2theinsertionsiteofT-DNAinFL550VM1G_07986编码1，3-β-葡聚糖合酶基因，VM1G_07985为假定蛋白。在NCBI上对VM1G_07985进行blastx比对，下载同源性高的蛋白序列，以大丽轮枝菌Verticilliumdahliae的序列作为外源序列，在MEGA5软件中，用邻接法做系统发育树，自举值设为1000。将VM1G_07985蛋白与其他真菌同源蛋白构建进化树，发现其与Valsamalivar.pyri、Diaporthehelianthi亲缘关系最近，Diaporthehelianthi所对应的为向日葵茎溃疡病菌的HMGbox-containingprotein。结果图如图3.3。图3.3苹果腐烂病菌的系统发育分析Fig.3.3ThephlogenticangligiseofV.malivar.mali在苹果腐烂病菌基因组数据库中VM1G_07985被注释为编码假定蛋白的基因，DNA全长2327bp，仅含1个内含子，1896bp的编码序列编码631个氨基酸的假定蛋白。因为该基因与向日葵茎溃疡病菌的HMGbox-containingprotein同源，我们将该基因命名为VmHMG7。在柄孢霉中，HMG-box基因影响了柄孢霉的产孢量（JinaneAitBenkhalietal.，2013），与FL550产孢增加的特性相一致。因而选择VmHMG7基因作为目的基因。37 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析3.2苹果树腐烂病菌HMG-box基因分析3.2.1苹果腐烂病菌HMG-box基因家族成员鉴定苹果腐烂病菌全基因组中鉴定到8个HMG-box家族成员。设计引物（表2.3）对其进行PCR验证，结果如图3.4，长度与目的片段大小一致。M1234567850003000200015001000800500300M：DL5000，1：VmHMG2，2：VmHMG1，3：VmHMG7，4：VmHMG3，5：VmHMG6，6：VmHMG4，7：VmHMG8，8：VmHMG5图3.4苹果腐烂病菌中HMG-box家族的PCR检测Fig3.4ThePCRtestofHMG-boxfamilyinV.malivar.mali通过NCBI-CDD工具进行蛋白质结构域分析，发现8个HMG-box蛋白均含有HMG特征结构域。通过ExPASy工具，对HMG-box的蛋白长度、分子量及理论等电点等生化属性进行分析，发现最长的HMG-box蛋白VmHMG7包含631个氨基酸残基，最短的VmHMG3蛋白仅有100个氨基酸残基，等电点最低5.77（VmHMG1），最高10.57（VmHMG4）（表3.2）。38 山东农业大学硕士学位论文表3.1苹果腐烂病菌中HMG-box转录因子家族信息Table3.1TheinformationofHMG-boxtranscriptionfactorfamilyinV.malivar.mali编码序粗糙脉孢菌基因名称蛋白编号染色体定位大小分子量等电点列长度同源基因VmHMG1KUI65156.1ch1:4,481,816..4,482,925110736940889.345.77NCU07568VmHMG2KUI65974.1ch2:674,248..678,760150950353723.449.46NCU02819VmHMG3KUI66185.1ch2:923,497..923,98330010011447.719.3NCU07568VmHMG4KUI66166.1ch2:1,412,077..1,413,48089729932868.4710.57NCU02695VmHMG5KUI66382.1ch2:2,683,341..2,685,095175258465697.286.1NCU02819NCU06874,VmHMG6KUI67285.1ch3:3,398,698..3,402,776137445849608.15.88NCU03126VmHMG7KUI72281.1ch8:2,334,715..2,337,041189363171156.299.43NCU03481VmHMG8KUI72756.1ch9:256,222..260,60660620222872.75.8NCU034813.2.2基因结构及系统进化分析为深入分析HMG-box与其它物种同源基因的进化关系，构建了苹果腐烂病菌与模式真菌粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）的系统进化树（图3.5），找到在粗糙脉孢菌中的同源基因。基因结构图显示，苹果腐烂病菌HMG-box基因的内含子数目不超过6个，2个不含内含子，2个含有1个内含子，1个含有3个内含子，2个含有5个内含子，1个含有6个内含子，内含子数目与聚类关系较近的粗糙脉胞菌的相类似。39 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析图3.5苹果腐烂病菌与粗糙脉孢菌HMG-box转录因子的系统进化树及基因结构Fig.3.5Theneighbor-joiningphylogenetictreeandgenestructureofHMG-boxtranscriptionfactorsinV.malivar.maliandNeurosporacrassa表3.2基因名称及附加结构域Table3.2Genenameandadditionaldomain亚家族结构域基因编号基因名称附加结构域VmHMG1hypotheticalproteinmRNA-FACTcomplexsubunitVmHMG2SAM-1SSRP1HMGB-UBFmRNA-Non-histoneVmHMG3chromosomalprotein6mRNA-Non-histoneVmHMG4chromosomalprotein6VmHMG5mRNA-HMG-boxproteinSTE11VmHMG6mRNA-RuvB-likehelicase1TIP49；P-loop_NTPaseMATAmRNA-SporulationminusVmHMG8EEP；zf-GRFregulator2SprT-likefamily；HMG-boxVmHMG7mRNA-hypotheticalproteinpeptidaseS8、S5340 山东农业大学硕士学位论文家族进化树及基因结构显示（图3.6），8个HMG-box基因形成4对旁系同源基因对。NCBI-CDD分析将HMG-box基因分成MATA和HMGB-UBF两类，分别含有3个和4个基因，VmHMG7及VmHMG4中的一个结构域没有确切归属的亚家族。不同HMG-box基因中还含有其他附加结构域，推测与蛋白功能相关。除VmHMG1、VmHMG7外，其他6个蛋白已经被命名（表3.2）。图3.6苹果腐烂病HMG-box家族进化树及基因结构Fig.3.6Theneighbor-joiningphylogenetictreeandgenestructureofHMG-boxtranscriptionfactorsinV.malivar.mali3.2.3苹果腐烂病菌HMG-box基因家族染色体定位分析根据基因位置信息得到HMG-box基因在苹果腐烂病菌染色体上的定位图（图3.7）。8个HMG-box分布在苹果腐烂病菌13条染色体中的5条（1、2、3、8、9），2号分布最多，含有4个HMG-box（VmHMG2、VmHMG3、VmHMG4、VmHMG5），1、3、8、9号上各有1个HMG-box。4对HMG-box在2号染色体上紧密连锁在一起，且VmHMG2、VmHMG4、VmHMG3均属于UBF亚家族，VmHMG5属于MATA亚家族。图3.5显示VmHMG2/VmHMG5、VmHMG4/VmHMG3、VmHMG1/VmHMG8、VmHMG6/VmHMG7属于旁系同源基因，步长分别为81、76、55、55，其中VmHMG2/VmHMG5的步长值最高（81）。推测为基因组的串联复制造成了这4对基因的扩张，且VmHMG2/VmHMG5发生复制事件较晚。41 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析图3.7苹果腐烂病HMG-box转录因子在染色体上的位置Fig.3.7ThechromosomelocationoftheHMG-boxtranscriptionfactorsinV.malivar.mali3.2.4VmHMG7基因的保守结构域分析NCBIConservedDomainSearch分析表明其包含3个结构域：Peptidases_S8_S53、Sprt-like（产物为DNA金属肽酶）、HMG-box。将其氨基酸序列与柄孢霉中同样含Sprt-like、HMG-box的PaHMG7（登录号CDP29961.1）比对，相似度为51%。推测两者有相近似的功能。（图3.8）图3.8NCBICDS分析VmHMG7基因的保守结构域Fig.3.8TheconserveddomainanalyseofVmHMG7gengbyNCBICDS3.3基因敲除载体的构建和突变体验证3.3.1敲除载体的构建融合PCR第一步扩增的上下游片段及HPH片段大小分别为815bp、987bp和1352bp，与预期结果相符合（图3.9-A）。第二步将上游、下游和HPH片段进行融合PCR，得到3154bp目的片段（图3.9-B）。42 山东农业大学硕士学位论文图3.9上下游片段及HPH片段的PCR扩增及UP-HPH-DOWN融合片段的电泳图Fig.3.9PCRamplificationofsegmentsUP,DOWN,HPHandligationfragmentsUP-HPH-DOWN注：1-4：下游片段、HPH、上游片段及融合片段UP-HPH-DOWN；Marker：DL5000。Note:1-4:FragmentDOWN、HPH、UPandfusionfragmentUP-HPH-DOWNbyPCR.TheDNAladderwasDL5000.3.3.2PCR验证-1野生菌株在潮霉素培养基上不能生长，95个转化子在含50μg·ml潮霉素的PDA培养基上生长良好。用检测引物对转化子进行PCR检测，上游片段、下游片段、HPH片段有1705bp、1346bp、1109bp目的条带，证明敲除成功。筛选得到理想的同源重组转化子2个，编号Δ1-5、Δ2-22（图3.10）。敲除效率为2.1%。图3.10突变体PCR验证Fig.3.10Verificationofthemutantsusingthefourpairsofprimers注：1-4：片段UP、DOWN、HPH及hmg片段；Marker：DM2000。Note:1-4:FragmentUP、DOWN、HPHandhmgbyPCR.Marker:DM2000.3.3.3Southern杂交验证Southern杂交结果Δ1-5、Δ2-22呈现788bp的单条杂交带，野生型菌株为1781bp的单条杂交带（图3.11）。说明HPH片段已将VmHMG7基因置换，且为单拷贝插入。43 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析图3.11突变体Southern杂交验证Fig.3.11VerificationofthemutantsusingSouthernBlotdetection注：WT：sdau11-175；Δ1-5、Δ2-22：敲除突变体。Note：WT:sdau11-175.Δ1-5、Δ2-22:knockoutmutants.3.4敲除突变体的表型观察和致病力测定3.4.1敲除突变体菌落表型观察Δ1-5、Δ2-22在PDA平板上生长5d的菌落与sdau11-175在菌落颜色、菌丝致密程-1-1度上无明显变化。Δ1-5、Δ2-22平均生长速率为17.5mm·d和15.8mm·d，与sdau11-175-1（19.6mm·d）相比下降10.8%和19.8%。sdau11-175、Δ1-5和Δ2-22培养30d后即可见黑色子实体，但子实体产生数量无明显差异（图3.12）。图3.12菌落形态及生长速度Fig.3.12Colonymorphologyandgrowthrate44 山东农业大学硕士学位论文3.4.2敲除突变体致病性测定活化3d的sdau11-175、Δ1-5、Δ2-22（Φ=5mm）接种在离体富士苹果枝条上，枝条上，25℃保湿，4d后sdau11-175病斑长度为13.0mm，远小于Δ1-5的19.3mm和Δ2-22的20.3mm。Δ1-5、Δ2-22的致病性分别上升了48.5%和56.2%（图3.13）。注：A：无菌PDA，对照；B：野生菌株sdau11-175；C：突变体Δ1-5；D：突变体Δ2-22。图中标尺为2cm。Note:A:AsepticPDAblock,contrast.B:Wildtypestrainsdau11-175.C:MutantΔ1-5.D:MutantΔ2-22.Bar=2cm.图3.13野生菌株及突变菌株的致病力测定（6d，P<0.05）Fig.3.13Virulencetestofthewild-typestrainandthemutantsofsdau11-175(6days,P<0.05)45 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析4讨论本研究采用融合PCR方法构建了VmHMG7的敲除载体，共获得了2个敲除突变体，两个突变体与野生型相比，生长速率降低，致病性增强近一半。与FL550相比，敲除突变体的表型并没有发生改变。4.1敲除突变体表型未发生变化的原因HMG-box基因家族成员之间的功能的互补或相互作用。在柄孢霉中，PaHMG7与VmHMG7具有相似的附加结构域SprT-like，它与PaHMG3共同影响着子实体的数目和分布。所以，仅敲掉VmHMG7基因，可能有其他HMG-box基因继续维持了病菌的正常生长（AitBenkhalietal.，2013）。在FL550中，因为其中的随机突变产生的位置包含了HMG-box和1,3-β-葡聚糖合酶的启动子位置，并不是单独影响HMG-box基因，所以造成了不对称的表型。4.2敲除突变体致病性增强的原因分析在基因表达的第一个环节，在DNA、染色质水平以及转录起始水平，HMG-box转录因子起着重要的调控作用。许多HMG-box转录因子都是基因表达的调控因子，参与到需要依靠DNA来完成的调控过程，例如核蛋白复合物的组装，启动转录，复制和DNA修复。根据HMG-box转录因子的功能，推测有以下四方面的原因影响了苹果腐烂病菌的致病性。第一，由于HMG-box转录因子调控早衰的功能丧失。在H2O2处理后的人体细胞中，作为转录抑制因子的HMG-box转录因子1（HBP1）的表达增高，促进了细胞的早衰，而在敲除HBP1后，细胞早衰程度降低（姜彬等，2012）。本研究中VmHMG7敲除突变体的致病性增强，推测由于其调控早衰的功能丧失，使得苹果腐烂病菌对于侵染过程中产生的乙醛、乙醇等的敏感性降低，致病性反而增强。第二，由于产毒素基因受HMG-box转录因子调控下调表达，进而抑制了其致病性的发挥。HMGB蛋白可以通过与TATA-结合蛋白相结合形成稳定复合物，抑制了起始46 山东农业大学硕士学位论文复合物的组装，进而抑制表达（Julianetal.，2015）。VmHMG7可能抑制产毒素基因的表达，当其被敲除的时候，致病性得到增强。第三，推测与HMG-box转录因子保护DNA损伤免受修复及Sprt-like结构域的功能相关。HMGB蛋白对顺铂加合物的高亲和力，保护了DNA损伤免受修复（Julianetal.，2015）。Sprt-like为以谷氨酸为催化氨基酸的DNA金属肽酶，其产物可造成DNA-蛋白质交联类型的DNA损伤（刘世男等，2016），苹果腐烂病菌侵染苹果树后产生的乙醛也会诱导苹果腐烂病菌产生该类型的DNA损伤。野生型菌株中VmHMG7抑制了对DNA损伤的修复，进而抑制了其侵染，造成野生型的致病性弱于敲除突变体的致病性，与本研究的结果相一致。第四，HMG-box基因家族成员之间的功能的互补或相互作用。在禾谷镰刀菌中，Mat1-1-2蛋白和其它所有的含有HMG-box或Matα结构域的MAT位点转录因子都相互作用，可能在有性生殖时期形成一个蛋白复合体，共同起着调控作用。（郑倩，2013）4.3HMG-box基因与有性生殖的关系在其他真菌中，HMG-box在交配过程中起着重要作用，子囊菌（Ascomycota）的交配位点中至少含有一个HMG-box基因；啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）在进化中失去了HMG-box，但保留了其原型MATa1p；接合菌门（Zygomycota）和微孢子虫（Microsporidia）中存在决定配型的一对HMG-box等位基因；担子菌（Basidiomycota）配型位点不含HMG-box基因，但HMG-box在性发育过程中也起着必不可少的作用（施乐乐等，2014）；柄孢霉的12个HMG-box基因中有10个与有性生殖有关，2个对有性生殖起间接的调控作用（AitBenkhalietal.，2013）。但并不是所有的MATA基因中都含有HMG-box结构域，也可能含有与HMG-box结构域相似的Matα1p基因，或者不含有结构域，如禾谷镰刀菌的Mat1-1-2；也不是所有含有HMG-box结构域的基因都会对有性生殖有直接作用，比如柄孢霉中的PaHMG7。本研究中的VmHMG7敲除突变体的孢子产生没有变化，说明该基因对苹果腐烂病菌的有性生殖不起直接的调控作用。VmHMG7与柄孢霉中的PaHMG7相似度为51%，PaHMG7只影响子囊的分布，而不影响有性孢子的产生，VmHMG7的功能与该结果基本相符。47 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析4.4其他由于时间的原因，本研究仅对VmHMG7基因进行分离和功能的初步分析，尚未对其进行回补，而且VmHMG基因家族的其他的成员的功能尚需继续研究。为了全面透彻地了解VmHMG7基因的表达和调控，还应对敲除突变体进行VmHMG7基因回补，并对剩余的HMG-box基因进行敲除，以得到更为深入和系统地研究。48 山东农业大学硕士学位论文5结论本研究对ATMT介导的突变体FL550进行侧翼序列扩增，分离克隆了HMG-box基因，利用生物信息学方法，鉴定出了苹果腐烂病菌HMG-box（HighMobilityGroup-boxcontainingprotein）家族，并对其进行了系统进化分析、基因家族成员的结构及染色体定位；将苹果腐烂病菌HMG（VmHMG7）的基因进行敲除，通过培养学、形态学、生长和致病性等表型分析，初步分析了VmHMG7基因的功能，研究结果如下：1.突变株FL550是因ATMT载体的T-DNA置换了苹果腐烂病菌8号染色体上4316bp长的序列。包括VM1G_07985基因5’端的启动子及部分序列，VM1G_07986基因的部分启动子序列及两基因间的非编码区序列被置换。2.全基因组数据分析表明，苹果腐烂病菌共包括8个HMG-box基因，分别位于13条染色体中的第1、2、3、8、9的5条染色体上，其中2号染色体含有4个。分列2个亚家族：HMGB-UBF（VmHMG1-3）和MATA（VmHMG5、VmHMG6、VmHMG8）。VmHMG7没有明确分析出亚家族。3.基因结构分析表明，VmHMG7基因含有Peptidases_S8_S53、Sprt-like（产物为DNA金属肽酶）和HMG-box三个结构域。4.VmHMG7基因敲除共获得2株敲除突变体Δ1-5、Δ2-22，说明VmHMG7基因的缺失抑制了苹果腐烂病菌的生长，增强了其致病性，对其它性状影响不明显。49 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山东农业大学硕士学位论文附录（1）PDA培养基：马铃薯200g葡萄糖15g琼脂粉10g加水定容至1L，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（2）LB培养基：胰蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g琼脂粉（固体）10g加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（3）TB3培养基：酵母提取物3g胰蛋白胨3g蔗糖200g加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（4）STCbuffer：蔗糖200g1MTris-HCl(pH8.0)50mlCaCl2·H2O7.351g（5）0.5MEDTA（pH8.0）：EDTANa2·2H2O186.1gNaOH20g用NaOH调pH值至8，用去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。室温保存。（6）1MTris-HCl(PH8.0)：Tris121.1gHCl42ml加浓盐酸调pH值至8，加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。室温保存。（7）0.5MTris-HCl(PH8.0)：Tris60.5g57 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析HCl42ml加浓盐酸调pH值至8，加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。室温保存。（8）0.5MTris-HCl(PH7.0)：Tris60.5gHCl42ml加浓盐酸调pH值至8，加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。室温保存。（9）10%SDS：SDS10g68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节pH值至7.2，用无菌水定容至100ml，室温保存。（10）2NNaOH：NaOH8g用去离子水定容至100ml，置于塑料容器中，室温保存。（11）3M醋酸钠（pH5.2）：NaAc·3H2O40.8g加冰醋酸调节pH值至5.2，加去离子水定容至100ml，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（12）2×CTAB提取液：CTAB20g1MTris-HCl(pH8.0)100ml0.5MEDTA（pH8.0）40mlNaCl81.8g加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。室温保存。（13）SolutionⅠ：1MTris-HCl(pH8.0)25ml0.5MEDTA（pH8.0）20ml葡萄糖9g加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（14）SolutionⅡ：10%SDS1ml2NNaOH1ml加无菌水定容至10ml，充分混匀，现配现用。（15）50×TAEBuffer：Tris242gEDTANa2·2H2O37.4g58 山东农业大学硕士学位论文冰醋酸57.1ml加去离子水定容至1L，室温保存。59 苹果腐烂病菌VmHMG7基因的分离及功能分析致谢研究生生活转瞬即逝。三年的时光中，在老师和同学的帮助下，我得到了很多，不仅包括理论知识、实验技术，做人的道理，解决各种问题的能力与思路，还包括珍贵的师生情和同窗情。感谢导师刘会香副教授和何邦令副教授在科研和生活上给予我的巨大帮助，两位导师的谆谆教导和身体力行的示范都是激励我前行的动力，两位导师渊博的知识、严谨的治学态度、敏锐的观察力和勤勉的工作精神是我今后生活工作的榜样。同时还要感谢森林保护专业的周成刚老师、刘振宇老师、马洪兵老师、姜淑霞老师、乔鲁芹老师、尹淑艳老师、邵云华老师在我知识水平和技能提高上给予极大地帮助。本研究能够顺利完成，离不开林业有害生物检定检测研究室全体同学的帮助和支持。感谢于成明师兄、孙庚午师兄、刘志勇师兄、冯小帅师兄和赵迎彤师姐，他们在实验技术方面给予了我许多帮助；同时感谢同学杨玲玉、郑伟，在实验室的两年中，我们一起进步了许多；感谢实验室的师弟师妹们，师妹张永乐、王怡霖、于晓静、刘莉莉和师弟曹贞冬、王程利协助我完成了部分的科研内容；感谢一起学习的同学曹先聪、龚赛、孙超、宋真真、于娜和王丹凤，大家在一起互相督促和交流学习，共同进步。感谢父母的理解体谅以及支持，这是我坚持到今天的支柱，也将永远是我不断前进的动力。没有比人更高的山，没有比脚更长的路，毕业是研究生生活的结束，也是一个新的起点。希望我们都能拥有一个更加美好的明天。贾晓曼2017年6月60 山东农业大学硕士学位论文攻读学位期间发表论文情况贾晓曼,王怡霖,孙庚午,葛顺峰,何邦令,刘会香.苹果腐烂病菌VmHMG基因敲除突变体获得及表型分析[J].核农学报.(已接收)郑伟,贾晓曼,王怡霖,孙庚午,何邦令,刘会香.Botryosphaeriadothidea突变体库的构建及分析[J].山东农业大学学报(自然科学版),2017,01:1-6.61