宁夏地区尖锐湿疣皮损人乳头瘤病毒HPV基因分型的研究

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分类号：R75单位代码：10752密级：公开学号：201300340宁夏医科大学硕士专业学位论文宁夏地区尖锐湿疣皮损人乳头瘤病毒HPV基因分型的研究HPVinfetionandgenotypingincondylomaacuminatumpatientsinNingxia学位申请人：韩珈蓉指导教师：喻楠教授申请学位门类级别：医学专业名称：皮肤病与性病学研究方向：性传播疾病所在学院：临床医学院论文完成日期：二0一六年三月宁夏医科大学研究生部 NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeHPVinfetionandgenotypingincondylomaacuminatumpatientsinNingxiaStudent’sName:HanJiarongSupervisor:YuNanSubjectCategory:MedicalMajor:DermatologySpecialty:SexuallytransmitteddiseaseSchool:NingxiaMedicalUniversityCompletionDate:Mar.2016 宁夏地区尖锐湿疣皮损人乳头瘤病毒HPV基因分型的研究摘要目的：了解宁夏地区尖锐湿疣患者皮损人乳头瘤病毒HPV感染情况及基因型分布情况，为我区CA及生殖器肿瘤的预防、筛查、早期诊断以及治疗、预后评价等提供科学依据。方法：选择2013年12月-2015年12月就诊于皮肤科门诊的200例CA患者，采用流式荧光杂交法对其疣体表面脱落细胞或疣体组织进行HPV基因分型检测。结果：（1）27种亚型共检出24种，其中高危型16种（16183133353945515253565859666882），低危型8种（611404243446181）。（2）在609例被门诊拟诊断为尖锐湿疣的患者中，检出HPV阳性200例，阳性率32.84%，以21-30岁年龄段感染率最高。（3）在200例HPV阳性病例中，单一感染145例，占72.5%，其中单一高危型感染90例，占45%，16、52型是主要感染亚型，单一低危型感染55例，占27.5%，6型是主要感染亚型。多重感染55例，占27.5%，包括高低危型同时感染33例、单纯高危型混合感染19例、单纯低危型混合感染3例，感染类型多达51种。（4）在200例HPV阳性病例中，男性52例，主要以低危型6型感染为主。女性148例，高危型以16、52、58型感染为主，低危型以6型感染为主（因包含多重感染，1位患者可能被多次计数）。（5）在200例HPV感染者中，71例为银北地区，主要以高危型16型感染为主。49例为银川本市，80例为银南地区，均以低危型6型感染为主。结论：1、宁夏地区尖锐湿疣患者HPV感染主要为单一感染，主要感染类型为6、16、52型为主。2、其好发年龄为21-30岁之间，男性以6型感染为主，女性以6、16、52、58型感染为主。3、多重感染以高低危型同时感染为主。4、银北以高危型16型感染为主，银川、银南以低危型6型感染为主。关键词：尖锐湿疣，人乳头瘤病毒（HPV），基因分型I HPVinfetionandgenotypingincondylomaacuminatumpatientsinNingxiaABSTRACTObjectiveToinvestigatehumanpapillomavirus(HPV)infectionandgenotypedistributionincondylomaacuminatumpatientsinNingxia,inordertoprovidethebasisfortheprevention、screening、diagnosis、therapyandprognosisofgenitalneoplasms.MethodsTotally200casesofcondylomaacuminatumpatientsfromDec.2014toDec.2015admittedtotheoutpatientdepartmentofdermatologywereselected,theflowcytometryfluorescencehybridizationmethodwasusedonthewarttissuespecimentsforthedetectionofHPVgenotyping.RESULTS(1)24subtypesof27knownsubtypesweredetected,including16typesofhighriskHPV(16183133353945515253565859666882),8typesoflowriskHPV(611404243446181).(2)200in609caseswerepositive.ThetotalpositiverateofHPVinfectionwas32.84%.ThepeakageofHPVinfectionrangedfrom21to30yearsold.(3)In200positivecases,thesingertypeofHPVwas145caseswiththerateof72.5%.90casesweresinglehighrisktypeandtheratewas45%.High-risktypewasmainlyHPV16,HPV52subtype.55casesweresingerlowrisktypeandtheratewas27.5%.Low-risktypewasmainlyHPV6subtype.55casesweredetectedwithmultipleinfectionsandtheratewas27.5%,including33casesweremixedtype,19caseswerehigh-riskmixedtypes,3caseswerelow-riskmixedtype.Thereare51kindsofHPVtypesinmultipleinfections.(4)52in200positivecasesweremales,thegenotypesofHPVinfectionismainlyHPV6.148in200positivecaseswerefemales,themorecommonhigh-riskgenotypesandlow-riskgenotypeswereHPV16,HPV52,HPV58andHPV6respectively(becauseofincludingmultipleinfection,onecasemayberepeatedlynumeration).(5)71in200positivecaseswereYinbeiregioncases,thegenotypesofHPVinfectionismainlyHPV16.49wereYinchuanregioncases,80caseswereYinnanregioncases,bothofthegenotypesofII HPVinfectionismainlyHPV6.Conclusion1.TheinfectionofHPVinpatientswithCAinNingxiawasmainlysingletypeofHPV6andHPV16,HPV52.2.Theageofinfectionismainlyconcentratedin21-30yearsold.ThegenotypesofHPVinfectionofmalesismainlyHPV6,females’wereHPV6,HPV16,HPV52andHPV58.3.MixedtypewasthemainlytypeindoubleandmultipleHPVtypesinfection.4.ThegenotypeofHPVinfectionismainlyHPV16inYinbeiregion,thegenotypeofHPVinfectionismainlyHPV6inYinchuanandYinnanregion.KeywordsCondylomaacuminate,HumanPapillomavirus,GenotypeIII 中英文缩略词表英文简称英文全称中文全称CACondylomaacuminate尖锐湿疣HPVHumanPapillomavirus人乳头瘤病毒VLPvirus-likeparticle,病毒样颗粒ALA-PDT5-aminolevulinicacidphotodynamictherapy5-氨基酮戊酸光动力疗法VLPvirus-likeparticle病毒样颗粒IV 目录前言................................................................................................................................................1资料与方法......................................................................................................................................3结果................................................................................................................................................5讨论................................................................................................................................................9结论..............................................................................................................................................13参考文献........................................................................................................................................14综述..............................................................................................................................................16综述参考文献................................................................................................................................22致谢............................................................................................................................................27攻读学位期间发表的学术论文....................................................................................................28个人简历........................................................................................................................................29V 前言尖锐湿疣(Condylomaacuminate，CA)是当前发病率最高的，由人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)感染生殖器部位的皮肤黏膜组织，使其发生增生的性传播疾病。引起尖锐湿疣的人乳头瘤病毒是一种双链无包膜的DNA病毒,它感染人体后不进入血液循环，仅局限于感染部位的皮肤及粘膜组织，主要存在于感染细胞的胞内，与其共生。机体内的免疫细胞很少接触HPV，从而不能发生抗原释放及递呈等一系列免疫过程，所以病毒不易被机体清除而常处于潜伏状态,使尖锐湿疣易复发不易根除，从而成为临床治疗尖锐湿疣亟［1］待解决的问题。随着分子生物学与流行病学的发展，已经证实HPV是最重要的肿瘤相关病毒之一。目前已发现有200多种HPV，其中已完整测序并完整命名的有100多种，与人类生殖道疾病有关的有40余型，约有20多种与癌症相关。流行病学资料表明CA与外生殖器癌密切相关，据WHO统计：95%宫颈癌、85%的肛门癌是由HPV感染引起；50%的外阴癌、阴道癌、阴茎癌与HPV感染有关。根据HPV与肿瘤发生的关系可将HPV分为低危型、中危型和高危型，低危型常引起尖锐湿疣、乳头状瘤等良性病变；高危型常导致外生殖器肿瘤、子宫颈癌、鼻咽癌等的发生。CA除由常见的HPV6、11感染之外，部分尖锐湿疣患者还能检测出高危型且具有潜在癌病可能的HPV16、18。2005WHO／IARC将HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66等型别正式确认为与子宫颈癌相关；HPV5，6，8，11可能对人类有致癌风险。HPV基因型的分布有地理性差异，不同地区HPV的感染类型亦不一样，HPV16为全球宫颈癌最常见的感染型别，占研究病例的50%-60%，HPV18仅占10%-20%。2011年的一项全球研究报告显示，HPV16和（或）HPV18在亚洲中西部的感染率最高至82%，其它地区分别为70%、76%，据统计HPVl6(57％)，18(16％)，31，58，33，52，56，35，51，39，59和45等型别的感染率排在前12位。2010年有一项关于亚洲范围内HPV感染的研究报告显示，HPV在浸润性宫颈癌中的总感染率为88.9%，HPV16的感染率为54.1%，是宫颈癌中最常见的感染型别。尖锐湿疣的治疗至今仍没有一种令人满意的疗法，目前世界各国纷纷采取的预防控制方法是疫苗应用，并逐渐成为共识。然而,疫苗的型别不同，HPV的防护作用也会不同，一1 种特定型别的HPV疫苗只能对该型的HPV感染产生保护作用，对其他型别的HPV感染没［2］有保护作用。而且，HPV疫苗覆盖的亚型与接种人群的亚型能否相吻合，对疫苗干预的效果起着决定性的作用，这就需要提供不同地域、不同种族人群HPV基因亚型研究资料。但不同地区存在标本取材方法和分型检测方法的不同，因此提倡应用标准化的检测技术，严格控制质量，同时尽可能进行大样本的统计研究，将对HPV疫苗的一级预防起到至关重［3］要的作用。因此本研究拟通过对宁夏地区2013年12月-2015年12月确诊为尖锐湿疣的200例患者，采用流式荧光杂交法对其CA疣体表面脱落细胞或疣体组织进行27个HPV基因亚型的检测（包括低危型10种：6、11、40、42、43、44、55、61、81、83；高危型17种：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82），探讨我区CA患者人群的HPV基因分型，优势亚型？地域性差异？性别差异？高危型HPV在各种高危人群中的分布规律如何？HPV基因型别是否与CA复发相关？这些问题的解决对于制定我区CA的防治的策略十分重要，对于我区生殖器肿瘤的预防、筛查、早期诊断以及基因治疗、预后评价有重要的意义。2 资料与方法1.研究对象本研究收集200例2013年12月-2015年12月就诊于我院门诊、吴忠市医院皮肤科门诊以及大武口第五医院皮肤科门诊的户籍为宁夏地区、自愿接受HPV分型检测，确诊为CA的患者。纳入标准:第一次发病，且就诊前均没有治疗病史的患者。排除标准:处于哺乳期和妊娠期的妇女、有糖尿病、结核、肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、其他性传播疾病的患者，以及因为自身特殊原因不能停止使用免疫调节剂、抑制剂的患者。剔除标准：依从性差的患者。男52例，女148例，共200例，年龄16-71岁，平均年龄（34.5±9.8）岁。2.研究方法2.1仪器：基因扩增仪型号：EppendorfMastercylcerGradiengt；分析仪：多功能流式点阵仪luminex200。（2）试剂：采用上海透景生命科技股份有限公司提供份人乳头瘤病毒分型检测试剂盒，本试剂盒采用通用引物多重PCR扩增，流式荧光杂交分型的检测方法，同时检测出27种HPVDNA。试剂盒共设置了2类探针，28颗分类微球。与HPVDNA杂交的探针包被在其中27个分类微球上，对应型别特异性探针的信号为阳性将被判定为该型别的HPV阳性。质控微球是与人β球蛋白(β-globin)基因杂交的探针，它的结果反应取样、抽提、PCR以及杂交整个过程是否符合规定要求。（3）标本采集及保存方法：所有病人均用棉拭子擦拭疣体数次后放入上海透景生命科技股份有限公司的细胞保存液，样本常温放置1周，2-8℃保存1个月，-20℃及以下保存6个月，样本冻融5次有效，超过5次未验证，尽量避免反复冻融。（4）实验步骤：操作及结果判读均严格按照人乳头瘤病毒分型检测试剂盒说明书进行，具体步骤如下：标本的处理及DNA的提取：进行DNA提取之前，将所有标本置13,000rpm离心5分钟，保留沉淀物。解冻-20℃保存的标本需在室温条件下进行。然后准备三个离心管，分别加入阴性对照、临界阳性和强阳性对照各5ul。分别向标本沉淀物及上述对照品管中加入50ulDNA提取液，振荡混匀；沸水浴或干浴10分钟，样本上清液可直接用于PCR检测。PCR扩增：将PCR相关试剂从冰箱取出，室温下完全融解，根据样品数量准备相应数量的PCR反应管，配制PCR反应体系，包括预混液0.0ul引物混合液5.0ul核酸模板5.0ul聚合酶0.8ul，每个反应体系总体积为20.8ul。将样品15nl/管逐3 一加入相应的PCR反应管中，盖紧盖子后以2000rpm转速离心10秒钟。将PCR反应管放入PCR仪，按如下两个退火温度的热循环进行扩增反应，95℃5分钟1个循环95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒5个循环95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒35个循环72℃3分钟1个循环杂交检测：根据PCR反应的管数，用剪刀剪取相应大小的微孔杂交板，将微球杂交液置于涡旋仪上振荡30秒，每个样本吸取PCR扩增产物3ul，并依次加入相应的杂交孔中，用透明封口膜覆盖封口，将杂交板置于金属恒温浴，进行变性和杂交：95℃5分钟变性48℃30分钟杂交48℃15分钟孵育48℃Forever。撕下封口膜，每孔快速加入链霉亲和素-藻红蛋白75ul。继续贴好封口膜，48℃下孵育15分钟。④结果判定：将微孔杂交板转移至多功能流式点阵仪上进行检测，如果有任何HPV型别特异性探针的信号大于150，即判为该探针对应的型阳性。3.统计学方法所有数据均应用SPSS17.0软件，采用卡方检验，以α=0.05为检验水准。P＜0.05为差别有统计学意义。4 结果1.HPV各年龄段感染率拟诊断为尖锐湿疣的患者共609例，查出HPV阳性200例，感染率为32.84%。按年龄段将患者共分为以下5组，分别统计各组的HPV感染率。其中21-30组的感染率为13.46%，与16-20岁组的感染率无差别，但高于其它3组见表1。表1各年龄段HPV感染率项目检查例数感染（例%）16-20岁108（1.31%）21-30岁17782（13.46%）31-40岁18353（8.70%）*41-50岁19950（8.21%）*51-71岁407（1.14%）*合计609200（32.84%）*与21-30组比较P<0.052.HPV各亚型感染情况在200例尖锐湿疣感染者中，多重HPV感染共55例，占27.5%，单一HPV感染共145例，占72.5%。单一感染中，共出现23种基因亚型，其中低危型以6型为主要感染类型，高危型以16、52型为主要感染类型，见表2。在HPV多重感染中（同时感染两种或以上亚型），共出现4种多重感染类型，其中二重感染是主要类型，见表3。35例二重感染中，11型和6型出现的频率分别是7和9，6型和11型同时感染的有1例。表2145例HPV单一亚型感染情况低危型别感染高危型别感染(例%)6型31（15.5%）16型20（10%）11型12（6%）*52型18（9%）44型4（2%）*18型3（1.5%）#△81型3（1.5%）*68型8（4%）#△5 *与6型比较P<0.05；#与16型比较P<0.05；△与52型比较P<0.05；表355例HPV多重感染情况多重感染类型低危型高危型混合型合计(例%)二重感染3151735（17.5）三重感染04913（6.5）*四重感染0066（3）*五重感染0011（0.5）*合计3193355（27.5）*与二重感染比较P<0.013.HPV多重感染情况在高危型感染中，主要为16型和52型，构成比分别为14.5%和12.4%，在低危型感染中，主要为6型和11型，构成比分别为21.4%和8.3%，见表4。表4HPV多重感染情况HPV型别阳性例数构成比（%）高危型162114.5521812.458106.96885.53164.13353.45353.46642.81832.15932.13921.46 5621.43510.78210.75110.7低危型63121.411128.34442.88132.14021.44210.74310.76110.7因为多重感染，某些患者存在重复计数，故表中阳性例数只代表该型的出现频率4.男性和女性HPV感染情况在200例HPV感染者中，男性患者有52例，主要以低危型感染6型为主。女性患者有148例，主要感染类型既有高危型，也有低危型，高危型主要为16型、52型、58型，低危型主要为6型，见表5。表5男性和女性HPV感染情况HPV型别男性感染女性感染628（14%）21（10.5%）#△1113（6.5%）*8（4%）595（2.5%）*6（3%）583（1.5%）*20（10%）#△521（0.5%）*25（12.5%）#△163（1.5%）*29（14.5%）#△7 *与6型比较P<0.05；#△分别与11型、59型比较P<0.055.银川、银南和银北地区HPV感染情况在200例HPV感染者中，71例为银北地区，主要以高危型16型感染为主。49例为银川本市，80例为银南地区，主要以低危型6型感染为主，见表6。表6银川、银南和银北地区HPV感染情况HPV型别银川银南银北622427△118*18#3△167*8#24529*7#19583*5#18*与6型比较P<0.05；#与6型比较P<0.05；△分别与16型比较P<0.058 讨论HPV是一种高度嗜黏膜和皮肤的病毒，有极高的组织特异性，尖锐湿疣是由HPV感染使人体皮肤黏膜发生鳞状上皮增生的性传播疾病。CA是目前复发率最高的性传播疾病之一，研究发现自身免疫力低下、同性恋、吸烟、多个性伴侣和过早出现第一次性行为的患者更容易复发，没有性生活的女性发生生殖道HPV感染机率非常低，基因型别与性别是否与尖锐湿疣的复发相关，还需要进一步的研究证实。CA具有较强的传染性，常以亚临床感染形式存在，常可导致人类生殖系统发生疣变及恶变，其中宫颈癌是最严重且最常见的疾[4]病，位于妇女癌症死亡的第二位，仅次于乳腺癌。大多数女性生殖道HPV感染者病损常在8-13个月内自然清除，尤其是在首次发现的2年内清除率最高，每10个HPV感染女性[5]有9位女性可以完全清除HPV感染，只有少数感染持续存在最终进展为宫颈癌。HPV感++染可激发机体的特异性免疫，主要包括以CD4T和CD8T为主的细胞免疫，和与抗HPV16的中和性抗体相关的体液免疫。免疫状态与CA的发病和复发有着密切关系，尤其是机体的细胞免疫对CA的发生、转归有着极其重要的作用。研究发现，从HPV基因与宫颈组织基因相互整合，使宫颈黏膜从慢性炎症、低度不典型增生、高度不典型增生到癌变大约需年10-20年的时间，提示大多数的HPV感染患者，有足够的时间激发机体的细胞免疫和体[6]液免疫防御机制对抗病毒。如果在这期间能及早对女性HPV感染者，尤其是HPV高危患者进行基因型别的分型检测，及早发现和控制感染潜伏期，并给予感染者防治性的指导，将会大大降低宫颈癌的发病率，提高妇女的生活质量。男性中也普遍存在HPV感染，最高的报告为76%的男性感染HPV，大部分报告认为至少20%以上的男性存在HPV感染。所以早期对男性感染人群采取必要的干预措施，相比于女性更简单易行，并且能帮助降低女性宫颈癌的发生率，也有利于女性HPV患者开展康复治疗。目前各地大型流行病学调查研究显示,HPV感染的基因型别分布随地理区域的不同而不同，对特定区域尖锐湿疣患者HPV感染情况进行调查,并研究其基因分型可对该地区生殖器肿瘤的预防、筛查、早期诊断[7]以及基因治疗、预后评价进行有效的评估判断,具有极其重要的临床意义。[8][9]本研究中统计的宁夏地区HPV总的感染率为32.84%，这与福州、湘潭、浙江金华9 [10]等各地报道的HPV感染率有所不同，这可能与各地所采用的HPV基因分型检测方法不同有关（我国目前还没有一个HPV亚型分析方法的统一标准），也可能与不同地区人群的性质有差异以及当地医务人员所掌握的检查指征尺度不同有关。本研究采用流式荧光杂交法共检出24种HPV基因亚型，其中高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82等16种型别，低危型包括6、11、40、42、43、44、61、81等8种型别。其中HPV单一亚型感染占72.5%，多重感染占27.5%，说明宁夏地区HPV感染以单一亚型为主。低危型别中以6型为主要感染类型，与11型等型别比较均有统计学差异。亚洲HPV感染中高危型以HPV52和58型检出率较高，我国进行的多项研究也表明HPV52型和58型感染较常见。本研究结果显示宁夏地区高危型别感染以HPV16、52为主，基本符合我国高危型感染特点。关于HPV-16型1995年IARC明确宫颈癌和肛门生殖器肿[11]瘤(如肛门癌、阴茎癌和外阴癌等)与其有直接的关系，因此对本地检出HPV16阳性的患者因积极治疗，长期随访，避免发展为各种恶性肿瘤。此外本研究还将宁夏地区分为银川、银南和银北地区进行HPV分型特点的研究，在200例HPV感染者中，71例为银北地区，主要以高危型16型感染为主。49例为银川本市，80例为银南地区，主要以低危型6[12]型感染为主，同一地区不同地方的HPV感染亦不同，何建方等调查发现,HPV16是HPV[13]高危型感染中最常见的型别；喻芳明等调查发现，HPV16、58、18、33为义乌地区主要高危型别。由此说明HPV的感染存在明显的地域差异。因此，明确一个地区HPV基因感染的分布特点，对该地区宫颈癌及其他相关肿瘤的预防和治疗具有极其重要的临床意义。[14]有文献研究中显示，HPV构成比以21-30岁年龄段最高，与本研究结果基本符合。但本研究结果提示21-30岁年龄段与16-20岁年龄段的HPV感染率无明显统计学差异，考虑与本研究中16-20岁组样本数量太少有关。但从该研究中我们还是能够得出患者的年龄与HPV的阳性检出率有关。宁夏地区HPV感染的高发年龄以21-30岁为主，其可能的原因与该年龄段的人群性生活相对频繁，作息不规律，保护意识较弱，家庭尚未稳定等有关。因此应加大对该年龄段人群的HPV型别筛查力度及相关知识的普及，对宫颈癌等生殖道恶性肿瘤疾病做到早期防治。在多重感染病例中，本研究共发现了4种感染类型，包括从二重感染到五重感染，其10 中二重感染是多重感染的主要类型，其感染率为17.5%，与其它类型感染比较有统计学差异。在HPV多重感染中，共检测出23种HPV基因型，其中在高危型感染中，主要为16型和52型，构成比分别为14.5%和12.4%，与单一亚型感染的结果相符合。在低危型感染中，主要为6型和11型，构成比分别为21.4%和8.28%，同一患者的相同部位可同时出现HPV的多重感染，其可能的原因为各型别间无相互免疫。目前研究中还没有得出有关HPV[15]多重感染与宫颈病变的具体关系，但相关文献报道提示HPV多重感染者出现持续感染的[16]可能性更大。本研究中男性患者有52例，主要以低危型6型感染为主。女性患者有148例，主要感染类型既有高危型，也有低危型，高危型主要为16型、52型、58型，低危型主要为6型。表明宁夏地区男女HPV感染型别不同，女性更容易感染HPV高危型别，可能与该地女性比男性免疫状态差有关。所以更应该重视女性HPV感染者，一旦发现有高危型别感染，应积极治疗，长期随访，预防宫颈癌等恶性肿瘤疾病的发生。本研究初步反映了宁夏地区人群感染HPV的分子流行病学特点，这对该区尖锐湿疣及生殖器肿瘤的预防、筛查、早期诊断以及基因治疗、预后评价等有重要的研究价值及临床意义。目前用于HPV分型检测方法有原位杂交法、聚合酶链反应技术、限制性片段长度多态性分析、斑点印记法、杂交捕获技术、SP染色检测HPV早期蛋白E6等多种方法联合［17使用。国内也有学者将荧光偏振技术及限制性内切酶长度多态性方法用于HPV的分型18］。但这些检测技术存在操作流程复杂，敏感性低等缺点。本研究采用流式荧光杂交分型检测的方法，同时检测27种HPVDNA，拓宽了可检测型别的范围，操作流程简单，灵敏度相对高，是目前国内最先进的HPV型别检测技术。临床上现常用于治疗尖锐湿疣的方法有（1）传统药物治疗：包括口服和外用，如免疫增强剂、抗病毒药物、抗代谢药物和中药等；（2）物理疗法：主要包括光动力疗法、激光治疗、微波治疗、冷冻治疗和电灼法等，其中5-氨基酮戊酸光动力疗法（5-aminolaevulinicacidphotodynamictherapy,ALA-PDT）是目前临床上治疗尖锐湿疣最常用的方法，尤其是发［19］生于尿道等特殊部位的疣体，疗效好，复发率低，安全性高，且患者所受疼痛少；（3）手术治疗：对一些巨大疣体可采用手术切除的方法，后期联合上述药物或物理疗法加强治11 疗。因为CA易复发，无论是上述哪种治疗方法，均不能达到根治CA的效果。目前，随着免疫学、分子生物学及病理学等多学科的迅速发展，以及应用动物模型对HPV疫苗的研究，进一步推动了HPV疫苗在治疗CA，尤其是宫颈癌方面的研究。市场上现有分别针对［20］于HPV16和HPV18的两种预防性疫苗，用来预防尖锐湿疣、部分低级瘤变以及病毒感染。预防性疫苗主要是通过诱导机体产生中和抗体，有效预防与癌症相关型HPV的传播，而降低宫颈癌的发生。目前最完善的预防性疫苗是是由病毒主要衣壳蛋白L1组成的病毒样颗粒［21］（virus-likeparticle,VLP），其具有很好的免疫原性及耐受性。但是由于HPV在感染后数年或数十年才会引起组织癌变，它的防治效果如何，目前还不确定，只有在几十年后才能看到效果。关于治疗型疫苗，已有研究发现HPVE6/E7的多肽疫苗可使HPV相关的癌前病变消退。由于E6和E7是HPV致癌的主要蛋白，因此也可利用RNA干扰(siRNA)技术针对这两种蛋白进行治疗。已经证明在宫颈癌细胞系以及小鼠肿瘤模型中，将E6和E7的启动子及转录片段作为靶点的小干扰RNA(siRNA)可以抑制肿瘤生长，并改变细胞内p53［22］和p16的表达。但是目前还没有关于RNAi技术在尖锐湿疣治疗方面的临床动态。目前国内外将CA的研究重点放在HPV疫苗上，但是研究显示HPV疫苗的使用仍然存在一些问题，比如：（1）经济方面：发展中国家的经济问题相比于发达国家，更为突出，疫苗价格昂贵，超过了普通人群的购买能力；（2）人群意识：疫苗不能预防所有HPV类型的感染，且疫苗的保护时间是有限的，不是终身的，接种HPV疫苗后的部分人群认为他们将终身免于HPV的感染，因而会进行更高危的性活动，平时忽视妇科常规体检。所以这类人群必须按时于妇科随诊；（3）疫苗的有效性及安全性，有待于更长时间的追踪观察。除了上述问题，可能还存在其它我们尚未发现的HPV使用方面的弊端或缺点，我们期待随着科技的发展，能研制出更加适合人类使用的HPV疫苗。12 结论1、宁夏地区尖锐湿疣患者HPV感染主要为单一感染，主要感染类型为6、16、52型。2、其好发年龄为21-30岁之间，男性以6型感染为主，女性以6、16、52、58型感染为主。3、多重感染以高低危型同时感染为主。4、银北以高危型16型感染为主，银川、银南以低危型6型感染为主。13 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综述HPV感染及疫苗的相关研究进展人乳头瘤病毒(humanpapillomaviruse，HPV)感染引起的尖锐湿疣(condyloma[1]acuminatum，CA)波及肛门、生殖器附近的鳞状上皮组织，使其发生增殖性损伤，并出[2]现疣状增生的当前发病率最高的性传播疾病(STD)之一。宫颈癌是当今妇女最常见的恶性肿瘤之一，全世界范围内，宫颈癌在所有女性患有的癌症中，其发病率位于第三位，死亡[3]率位于第四位，发展中国家的宫颈癌超过85%。宫颈癌的发病呈年轻化趋势，发病率逐年上升，我国宫颈癌的新发病例约每年13.5万，每年大约有3万妇女因宫颈癌而死亡。宫颈癌严重影响着妇女的生活质量。流行病学以及病毒学资料已证实子宫颈癌、子宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasia,CIN）发生、发展的必要条件是人乳头状瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）[4]单一、持续的感染。高达99.7%的宫颈癌患者中检出有HPV高危型的感染。目前发现的[5][6]HPV基因型别超过200种，在子宫颈癌中发现的型别超过30种。其中最常见的基因亚型为6，11，16，18。HPV依据其致癌程度分为低危型、高危型。低危型主要有6，11，40，42，43，44，54，60，71，72，80，可导致尖锐湿疣等良性病变。高危型主要有16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82。与肛门、生殖器、[7-8]泌尿系、头颈部及肺部的某些癌症，尤其与宫颈癌的发生密切相关。女性宫颈疾病的发[9]生，发展，转归与不同HPV基因型的感染与有着不同程度的关系，因此要选择特异性的HPV检测方法，这对于女性生殖道肿瘤的早期发现和预防、诊断某些HPV感染引起的相关疾病，有重要的意义。也因为CA的难治性、易复发的特点，至今仍没有一种令人满意的疗法，目前世界各国纷纷采取的预防控制方法是疫苗应用，并逐渐成为共识。本文就HPV疫苗的研究进展和最新检测方法做一综述。1HPV的流行病学特性1.1HPV的结构HPV属于DNA病毒，外壳包含72个衣多体，具有20个多面体并相互对称，分子量5X10616 道尔顿，直径约45-55nm，表面无包膜。基因组约7800-7900个碱基对(bp)。根据其功能，基因组可分为3个编码区：(1)早期区：包括El、E2、E4、E5、E6、E7，这6个基因与HPV的基因复制、转录和细胞转化密切相关。(2)晚期区：包括LI、L2，L1是特异性极高的糖蛋白，L2是高度可变核蛋白。(3)上游调节区(Upstreamregulatoryregion,URR)也被称为长控制区(Longontrolregion,LCR)，其位置在LI基因和E6基因之间，中间包括多个基因[9]结合位点，均与病毒的复制、转录相关。其中，晚期区中的病毒颗粒由衣壳蛋白构成，[10]不含病毒DNA，因此没有致病性、感染性，其病毒颗粒可诱导机体产生保护性抗体。1.2HPV的致病机制[11]HPV主要通过性接触传播，也可通过其它途径，比如母婴传播或消化道感染。HPV在人类感染中主要表现为皮肤及粘膜的蔓延，具有较高的组织感染特异性。上皮细胞的过渡分化最终导致了HPV的感染与复制。皮肤基底层细胞受到HPV的侵袭，病毒颗粒进行复制，基底细胞随着时间的推移向表层推进分化，病毒颗粒随之运动，最终形成了成熟的病毒体。然而，病毒颗粒会随着上皮细胞的脱落而脱落，尽管病毒表面的蛋白具有较强的免疫源性，但是在早期并不能诱发机体产生免疫应答反应。这是尖锐湿疣易反复、不易根[12][13]治的原因之一。HPV表面的E6和E7蛋白，与恶性细胞肿瘤的发生密切相关。司马妮[14]研究表面若抑制E6、E7蛋白的合成，高危型HPV在宫颈癌的表达可有效逆转。Kang等发现，HPV16表达的E6、E7可以下调干扰素的表达、促进白介素18的表达，而白介素18是HPV病毒得以连续复制的基础，干扰素的表达降低致免疫监视功能降低，一系列变化最终导致宫颈癌的发生。1.3HPV的感染特点HPV的感染是一个动态过程，但它可以被自发清除。既往研究提示，宫颈癌的好发人群集中在长期受高危型HPV病毒感染，在性生活活跃的人群中虽易被感染但时间较短并自行修复，这与机体自身抵抗反应有关。针对HPV感染的病程，加拿大、哥伦比亚学者研究发现，HPV16（相关基因型31，33，35，52，58）型与其它分型比较，具有较高的感染率、较低的清除率。1.4HPV的地域分布17 近年来，研究提示根据HPV分型的不同，不同地区之间存在显著差别，且致病力也不同。IARC对于HPV阳性的宫颈癌患者进行的多地区、多中心研究发现，其中HPV16具有57.4%的感染率，18型居于第二。52型及58型在亚洲国家中发病率较高，上海城市居民中[11,15]确诊为宫颈癌的患者，占据42.5%的标本存在52、58型感染。北京中日友好医院调查[16]的HPV感染率较高的分型是16、18、68、58、33型。我国是地域面积广阔的国家，每个地区都有不同的生活环境、习性。下面就近些年中国各个地区HPV感染的流行病学特征进行概括阐述，包括东北、华北、西北、华中、西南、华南、华东等地区。[17]在东北地区，有一项针对沈阳妇女罹患宫颈癌的流行病学调査研究发现，HPV感染率分别为：正常宫颈(21.8%)、宫颈炎(35.7%)、不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞(AtypicalSquamousCellsofUnderteraiinedSignificance,ASC-US)(54.6%)、CIN(64.1%)、宫颈癌(83.4%)。[18]在华北地区，对于妇女筛查HPV感染情况显示，感染率为9.9%，CINI患者的感染率39.9%，CINII患者的感染率88.6%。在宫颈病变患者中HPV亚型由高到低分别是HPV16(26.5%)、58(8.8%)、33(7.8%)、HPV56(5.3%)。[19]在西北地区，针对少数民族聚集地调查显示，HPV总感染率为19.7%，发现HPV16、[20]58、18、52、31型是最主要的感染亚型。在甘肃，最常见的HPV亚型为HPV16、18、58。[21]在华中地区，对于湖南地区1146名妇女筛查显示，HPV总感染率为44.45%，HPV16、58、52位居单一亚型感染中的前三位。一项对陕西HPV人群感染的流行病学调查研[22]究发现，HPV总感染率为14.8%，HPV16、58、52、33、18等型别为主要的感染亚型。在西南地区，对成都地区144例宫颈鳞状细胞癌(CervicalSquamousCellCarcinoma,see)和63例高度麟状上皮病变(HighgradesquamousintraepithelialLesion,HSIL)的妇女调查研[23]究发现，HSIL和SCC的HPV感染率分别为61.9%和80.6%。在HSIL中最主要的感染亚型为HPV16(34.9%)>58(17.5%)、52(3.2%)、18(1.6%)；在宫颈癌中最主要的感染亚型为HPV16(34.9%)、58(8.3%)、18(4.9%)、52(2.8%)。[24]在华南地区,对广州6493例女性HPV的调查发现，HPV阳性检出率为29.99%，排18 [25]名前三位的亚型是HPV52(25.22%)、58(14.20%)、16(13.56%)。广州地区调查显示，HPV感染率为7.2%，最主要的感染亚型为HPV52(27.5%)>16(14.5%)、58(10.8%)、68(8.3%)、33(6.8%)。[26]在华东地区，福建地区研究显示，HPV的总感染率为22.5%，CINI的感染率为70.5%，宫颈癌的感染率为94.3%。在HPV阳性妇女中，最常见的亚型为HPV52(23.1%)、16(21.3%)、18(11.6%)。2HPV感染与机体免疫状态的研究进展HPV感染在年轻女性中非常常见，大多数在短期内可以自然消退，少部分人持续携带[27]，在HPV感染过程中，随着鳞状上皮、瘤变至宫颈癌的演变，机体的免疫状态处于动态[28]变化过程。HPV的感染能够诱发发机体的细胞免疫和体液免疫。2.1HPV感染的免疫学研究发现，患者体内正常细胞免疫功能受限，免疫监视、清除功能减低，导致了肿瘤的转移，机体的免疫功能尤其是T淋巴细胞与肿瘤的发生、发展密切相[29][30-31]关。T淋巴细胞亚群在宫颈癌免疫监视中起重要的调控作用。在免疫过程中，T细胞的功能、结构、分化都会发生变化，最终至HPV持续感染。++CD4、CD8亚群是T淋巴细胞在胸腺发育过程中产生的。T淋巴细胞在免疫应答中有重要作用，主要通过以下方式发生作用：1、识别肿瘤细胞分泌的多种可溶性抗原，进而发挥抗肿瘤的作用；2、参与毒T淋巴细胞、巨噬细胞及抗体的生成及活化；3、T细胞亚群[32]具有抗肿瘤效应。+CD8淋巴细胞分为杀伤性T细胞、抑制性T细胞，其免疫机制主要有2条途径。①分泌型杀伤：颗粒细胞释放肿瘤坏死因子、淋巴毒素等；非分泌型杀伤：细胞毒性T淋巴细胞表面分子蛋白结合肿瘤细胞表面分子蛋白结合，从而启动肿瘤细胞的死亡信号转导途[33]。++CD4淋巴细胞和CD8淋巴细胞在抗肿瘤反应中发挥着重要作用，相互协调，共同参[34]与体液免疫应答反应。HPV主要感染宫颈移行带。研究显示，正常宫颈移行带含有丰富的粒细胞、巨噬细胞、++[35]++CD4、CD8T淋巴细胞。宫颈癌患者CD4细胞减少，CD8细胞升高，机体的免疫过19 程发生变化。在HPV感染引起皮肤表现消失时，CD4和CD8产生的多种细胞因子参与[36]了此过程。已有研究表明，在多种肿瘤患者中T淋巴细胞亚群状态异常和比例失调的现[37-39]象较为明显。细胞免疫对HPV的感染起着决定性作用。研究显示，在机体免疫功能正常时，T细胞及其亚群的数目稳定，CD4细胞占外周血T+淋巴细胞总数的60%-65%，CD8细胞占30%-35%，CD4/CD8比值的恒定是细胞免疫平衡[40]++T的关键。在正常组织向宫颈癌演变过程中，CD4T淋巴细胞的逐渐减少，CD8淋巴细胞增多，细胞免疫、体液免疫受到影响，打破了宫颈内环境的平衡，最终至宫颈癌的发生演变。2.2体液免疫研究发现HPV病毒的持续时间与血清抗体的产生相关，即持续感染HPV某种型别，该型别的血清抗体也持续阳性。另外，HPV16的中和性抗体与宫颈内瘤变呈正相关，该抗体针对同型病毒的二次感染、减少病毒载量发挥重要作用，进而减缓宫颈病变发展。因此，有效评估患者体内抗原特异性细胞免疫功能，对于判断机体免疫功能状态、病情发展、治疗疗程、预后疗效极为重要。3HPV疫苗近年来，许多国家对HPV疫苗的研发进行研究，有效预防了病毒的感染，满足患者需要，根据免疫学功能不同，HPV疫苗分为预防性和治疗性两种。3.1预防性HPV疫苗预防性疫苗可激发机体免疫反应，使机体产生保护性抗体，预防HPV的感染传播，减少宫颈癌的发生。全球内生产HPV疫苗的厂家有2家，默沙东公司的Gardasil、葛兰素史克公司的Cervarix。Gardasil是四价疫苗,包含HPV16、18、6、11的VLPs。Cervarix是双价疫苗，包含HPV16和18的VLPs。两种疫苗中均含有辅剂，辅剂作用在于保持疫苗在储存过程[41]中的稳定性。病毒样颗粒疫苗是临床上较为推广的一种，对预防HPV侵袭、持续感染、宫颈上皮内[42]瘤变具有显著的有效性，具有敏感的免疫原性及较高的耐受性。机体受感染后，感染部20 [43]位的免疫球蛋白增加的数量是关键。Nardelli-Haefliger等对女性月经周期宫颈分泌免疫球蛋白的量进行检测，发现免疫球蛋白浓度降低了9倍左右在排卵期前后，但服用口服避孕药的妇女免疫球蛋白无明显量的变化。[44][45]Biemelt等已经证明L1转基因植物可合成VLPs。此外，Warzecha等发现给动物喂养转基因植物后，可以诱发机体产生免疫应答反应。3.2治疗性HPV疫苗治疗性HPV疫苗是在机体受HPV感染后，机体诱发体液免疫及细胞免疫，保护正常细胞，消除体内受感染细胞甚至肿瘤细胞，预防宫颈癌的发生。目前关于治疗性疫苗的研发，临床尚缺少大样本的研究，处于研发阶段。HPV表面的E6、E7蛋白与细胞的分化及[46]肿瘤的发生密切相关，IE抗原作为主要治疗性疫苗。近年来，HPVE2疫苗的研发也受[47]到重视。包括、DNA疫苗、载体疫苗、蛋白疫苗、肽类疫苗、细胞疫苗等。4HPV疫苗的前景[48]目前，关于HPV的预防性及治疗性疫苗的研发日益增进，但是，在HPV疫苗使用过程中存在以下问题：①在经济发达地区，因低经济预算的阻扰降低了疫苗的研发进程，这意味着疫苗的产生还具有未知的上升空间。而这个问题在发展中国家影响更多，发展中国家人群对疫苗的的购买力远远不足，因此，政府对疫苗的支持、研发需要提供资金基础。②对于目前尚未发现的HPV感染分型，我们所研发的疫苗仅仅针对已发现的分型，那么对于未发现的分型感染，疫苗的免疫功能有限，并非如部分人所想，疫苗可以终生免疫，因而忽略妇科检查，这是严重误区。③疫苗是否产生效果，要严格注入剂量，现阶段研发的预防性疫苗主要针对目标是儿童、青少年，但是由于家长缺乏对HPV的认识，认为只要注意生活习惯便会避免宫颈癌的发生，这便影响了疫苗的推广，无形中增加了宫颈病变的几率。④由于社会、家庭、学校等多环境的影响，青少年对于性传播疾病知识匮乏，由于缺乏大量本研究，临床医生对HPV的安全有效性保持中立状态。[49]对于HPV的治疗，目前只有少数感染人群使用疫苗治疗，我们期待政府加大对疫苗经济的投入，合理宣传性传播知识，研发出特异性较高的疫苗，最终有效避免或减少HPV的感染。21 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致谢三年的研究生生活即将结束，在此论文完成之际首先向我最敬爱的导师喻楠教授表示衷心地感谢，感谢她三年来对我在临床及科研实践中的培养和帮助，感谢她对我研究生学习、生活期间的教导和关怀。三年来导师兢兢业业的工作精神、求真务实的治学态度、严谨慎密的科研思路、乐观积极向上的生活态度和正直谦和的做人风格都使我终生受益。在导师的严格要求和悉心培养下，我学会了如何去处事待人、如何求知进步。经过导师辛勤的培养，我的临床理论更加丰富了，临床技能进一步提高了，科研能力也得到了锻炼，这点滴进步都凝聚着她的一片心血。感谢宁夏医科大学总医院皮肤科的各位老师、护士的指导和帮助。感谢宁夏医科大学研究生院各位老师的支持和关心。感谢宁夏医科大学实验中心的老师对我课题的指导和帮助。向所有临床轮转期间给子我帮助和指导的宁夏医科大学总医院的老师、护士、同事们表示感谢。最后感谢我的家人在我学习和生活中的无私奉献和默默支持。27 攻读学位期间发表的学术论文1.韩珈蓉，侯晶梅，董灵娣，喻楠.胰高血糖素瘤综合征伴坏死松解性游走性红斑1例[J].中国皮肤性病学杂志，待刊2.韩珈蓉，董灵娣，侯晶梅，喻楠.复发性疼痛性红斑伴抗核抗体阳性1例[J].中国皮肤性病学杂志，待刊28 个人简历一般情况：姓名：韩珈蓉性别：女年龄：27岁民族：汉族籍贯：宁夏学习经历：2008年~2013年就读宁夏医科大学攻读学士学位2013年~2016年就读宁夏医科大学攻读硕士学位29