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分类号密级河南农业大学兽医硕士学位论文论文题目：河南省家兔、牛肠道寄生虫流行病学调查及兔源贾第虫分子特征研究英文题目：EpidemiologicalInvestigationofIntestinalParasitesofRabbitandCattleinHenanProvinceandMolecularCharacteristicsofRabbitGiardiaIsolates学位申请人：刘杰导师：菅复春副教授学位类别：兽医硕士领域：预防兽医研究方向：人兽共患原虫生物学论文提交学位授予日期：2013年06月日期：2013年06 致谢研究生学习两年，在导师菅复春副教授的悉心指导下，从课题的选择、试验设计、具体执行，到论文的撰写和修改，无一不凝聚着导师的心血。两年中，导师在学习上给予了细心的指导，生活上给予了无微不至的关怀，这份师恩我将终生难忘；导师渊博的学识、严谨求实的治学作风、谦虚真实的待人方式以及精诚的敬业精神将使我受益终生。在学业即将结束之际，在此向恩师表示最崇高的敬意！衷心感谢课题组的宁长申教授、张龙现教授、张素梅副教授、王荣军老师、董海聚老师、王海燕老师、赵青玉老师和刘红英老师、齐萌博士、Karim博士两年来在学习和生活上给予的关怀和帮助，在此致以诚挚的谢意！特别感谢美国疾病控制和预防中心（亚特兰大）国家人兽共患病中心寄生虫病研究室的肖立华教授给予的热情指导和大力帮助。在此次流行病学调查采样中，得到河南省兔业学会会长河南科技大学薛帮群教授、河南省兔业协会副会长韩建国老师、河南省兔业协会专家团团长河南农业大学李明教授和魏战勇副教授的大力支持与帮助，在此深表感谢！感谢我的师兄王建领、岳耀辉、卫九健、彭永帅、刘振伟等；师姐史柯、杜海丽、张菲菲等；同学李廷文、张晓东、闫果、王金鸿、李俊强、孙芳芳、吕亚丽、刘鲜霞等在我学习生活中给予的关心和帮助，还有许多朋友，也许我们彼此只是匆匆过客，但是你们给予我的帮助，我们共同的经历的岁月，我都将终生铭记，在此向你们表示深深的祝福！最后，要深深地感谢我的父母、姐姐以及其他亲人对我的大力支持，正是在他们默默无闻的关心和鼓励下，我才能更专心的学习和更努力的工作，感谢他们为我的求学之路作出的巨大牺牲和奉献！ 目录摘要······································································1第一章文献综述·······························································31贾第虫分类······························································32贾第虫形态和生活史······················································53贾第虫流行病学研究······················································64贾第虫病诊断方法························································95贾第虫的药物防治························································96结语···································································10第二章河南省家兔、牛肠道寄生虫流行病学调查1材料与方法·····························································112结果与分析·····························································123讨论···································································18第三章河南省兔源贾第虫基于TPI基因的分类及种系发育分析1材料与方法·····························································202结果与分析·····························································233讨论···································································28结论和创新点·································································31参考文献·····································································32英文摘要·····································································39 河南农业大学2013届硕士生毕业论文摘要寄生虫病是养殖业中常见的一种慢性、隐蔽性、消耗性疾病，尤其是在草食动物中，因其相应的耐受性强，患病动物往往不表现明显的临床症状，因此，没能引起人们的重视。但其潜在的经济损失很大。贾第虫病是由贾第虫引起的一种人兽共患性原虫病，主要寄生于宿主小肠、十二指肠、胆囊等部位，可引起腹痛、腹泻和慢性吸收障碍等症状，是人类和哺乳动物肠道感染的常见寄生虫之一，主要通过人和动物、水、食物等之间的接触传播，给人类和养殖业带来巨大损失。为了解河南省兔和肉牛寄生虫感染情况和流行特征，笔者从2012年6月到2012年11月，对河南省17个地区30个养兔场和3个牛场的寄生虫感染情况进行了调查，并应用基于TPI基因的巢氏PCR方法对感染的兔贾第虫进行了种类鉴定和种系发育研究。1．为了解河南省部分地区兔和牛寄生虫感染情况和流行特征，应用饱和蔗糖漂浮法和卢戈氏碘液染色法对河南省郑州、荥阳、开封、兰考、商丘、济源、洛阳、周口、西华、许昌、鄢陵、安阳、滑县、内黄、濮阳、民权、灵宝17个地区30个养兔场和3个牛场的寄生虫感染情况进行了调查。本次共采集1371份兔粪便样品和460份牛粪样，检出兔寄生虫阳性粪样1008份，总感染率为73.52%。共查到5种肠道寄生虫，1种体外寄生虫，分别为：球虫、贾第虫、圆线虫、拴尾线虫、阿米巴和螨虫。其中以球虫感染率最高，为47.32%，贾第虫感染率为1.09%，圆线虫感染率为24.28%，拴尾线虫感染率为2.91%，阿米巴原虫感染率为7%，螨虫感染率为3.42%；460份牛粪便样品共检出寄生虫阳性粪样328份，总感染率为71.3%。共查到7种肠道寄生虫，1种体外寄生虫。分别为：阿米巴、线虫、球虫、鞭虫、双腔吸虫、莫尼茨绦虫、安氏隐孢子虫和牛毛虱。其中以阿米巴感染率最高，为57.17%，线虫感染率为34.34%，球虫感染率为18.04%、鞭虫感染率为4.78%，双腔吸虫感染率为3.91%，莫尼茨绦虫感染率为1.73%，安氏隐孢子虫感染率为0.21%，牛毛虱感染率为19.13%；发现15份兔粪样为贾第虫阳性，总感染率为1.09%。结果表明，贾第虫感染率与兔日龄呈负相关，其感染率的高低饲养模式也有很大关系。2．为掌握兔源贾第虫的遗传特征，对获得的15份兔贾第虫阳性样品进行基于TPI的巢氏PCR特异性扩增，15份样品全部扩增出特异性产物，产物序列长度约为530bp。对扩增出的15个兔源贾第虫分离株的序列进行测序，并在NCBI核酸序列数据库进行同源序列搜索，应用ClustalX2.1、DNAStar等生物学软件对序列进行比对、同源性分析及构建分子进化树。结果表明，15个兔源分离株均属于贾第虫集聚体B。其中，有8株贾第虫分离株属于WB10基因型，有5株分离株属于B4基因型，有2株分离株属于B7基因型。贾第虫病是危害人类健康的10种主要寄生虫病之一，集聚体B为人兽共患基因型，本研究结果表明我省兔贾第虫的流行具有重要的公共卫生意义。本研究为河南兔和牛寄生虫病的防控提供参考。关键词：兔；牛；寄生虫；贾第虫；TPI基因；种系发育分析1 河南农业大学2013届硕士生毕业论文第一章文献综述近年来，我国的畜牧产业发展迅速，在农业和国民经济中占有越来越重要的地位。河南是我国的养殖大省，近些年来已从养殖大省走向畜牧强省之路，在畜牧业高速发展的同时也存在着许多的问题，如中小型养殖户较多、养殖生产程序不规范、病毒性疾病和细菌性疾病流行严重等等，使得人们无暇顾及动物寄生虫病的潜在威胁和慢性消耗，动物寄生虫病对畜牧生产造成巨大的经济损失。动物寄生虫种类数量庞大，我国已报道的有2100多种，最近几年不断报道有新的种类出现，所以实际种类会更多。动物寄生虫病多表现为慢性、消耗性疾病，寄生于机体后往往不会引起明显症状，机体感染寄生虫后会造成生长发育受阻、腹泻、营养不良、贫血等症状，降低饲料报酬，造成巨大的经济损失，某些寄生虫病发生急性剧烈症状时与急性病毒病或细菌病症状相似，为确诊和治疗带来障碍，耐过动物会成为长期带虫者，成为传染源。在规模化猪场中，寄生虫感染可使饲料转化率降低20%左右，造成的经济损失每头猪约为40元，由此计算年出栏万头的猪场经济损失为40万元，由寄生虫造成的间接损失将更高。这样的情况在家兔养殖、牛羊养殖、家禽养[1]殖中也普遍存在。另外，部分寄生虫可以通过动物感染人类，对人类健康造成严重威胁，据世界卫生组织公布，可以感染人类的寄生虫种类有69种。寄生虫对人类的危害主要表现在两方面，一是其作为病原直接引起宿主寄生虫病，另外它可作为许多细菌和病毒的传播媒介感染人类，世界卫生组织和联合国开发计划署联合倡议的要求重点防治的6种热带病中，有5种是寄生虫病，分别为疟疾、血吸虫病、丝虫病、利什曼病和锥虫病。据估计，全球约三分之一的人口生活在疟[2]疾流行地区，每年死于疟疾的人数约100~200万。另外，肠道原虫和蠕虫也严重威胁着人类健康，主要种类有阿米巴病、蓝氏贾第鞭毛虫病、隐孢子病、弓形虫病、蛔虫病、鞭虫病、钩虫病、蛲虫病等，还有一些地方性肠道蠕虫病，如猪带绦虫、牛带绦虫等，其中多种原虫可携带致病病[3]毒，如艾滋病毒等，对公共卫生安全造成严重的威胁。蓝氏贾第鞭毛虫(GiardialambliaStile,1915)又被称为十二指肠贾第鞭毛虫(G..duodenalis)或肠贾第虫，简称贾第虫，是一种重要的机会性致病原虫，可感染人和多种哺乳动物、鸟类、两栖类[4]动物等，其引起的贾第虫病(Giardiasis)是人兽共患性疾病。自20世纪70年代以来，在世界各[5]地发生了本病的流行或暴发，贾第虫病已被列为危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。贾第虫主要可引起动物的消化系统疾病，常见症状为腹泻、腹痛或吸收不良，导致机体抵抗力下降甚至死亡。在感染人类方面，贾第虫主要寄生于人体小肠、主要在十二指肠、胆囊等部位，[6]为人体肠道感染的常见寄生虫之一，对儿童主要引起营养不良、身体智力发育滞缓等症状。贾[7]弟虫病是美国最常见的寄生虫病，美国在92~97年做的一个检测表明，每年有250万发病病例。[8]近年来有许多贾第虫与艾滋病患者合并感染的报导，而且在同性恋中也可相互传播。另外，由[9]于贾第虫病在旅游者中较常见，故又有“旅游者腹泻”之称，贾第虫是一种机会性原虫，当机体免疫力水平高时，贾第虫对机体的威胁不明显或并不表现明显症状，但是当机体免疫力下降或患2 河南农业大学2013届硕士生毕业论文有免疫抑制性疾病时，感染贾第虫的可能性就大大增加，如果出现继发感染，则死亡率也就随之升高了。[10]贾第虫是在1681年由荷兰学者VanLeeuwenhoek在自己的腹泻粪便中首次发现的，之后在世界各地对贾第虫病的报道纷纷出现。我国的蒋则孝等在1988~1991年对全国人体寄生虫感染[11]情况的调查中也发现了贾第虫感染。许多发达国家和发展中国家的贾第虫感染情况也十分普遍[12,13]。在我国养家兔和肉牛养殖中，贾第虫病的防治尚未引起重视，罗小华、余淼等在兔常见寄[14,15]生虫防治中只提到球虫、螨虫、绦虫，未提及隐孢子虫、贾第虫等人兽共患的虫种。史柯等[16]在2010年对河南省兔肠道寄生虫感染情况的调查显示，兔贾第虫感染率为5.27%；关于贾第虫[17-19]感染的报导也多见于奶牛，在肉牛养殖业未得到足够重视。国外学者对肉牛贾第虫研究相对[20]较多，在美国，Fayer等报导马里兰州一农场肉牛贾第虫感染率高达37.3％。Gow等报道，加拿大肉牛贾第虫感染率为22.6％。Haschek等于2004年和2005年冬季对奥地利230头无腹泻症[21]状的肉牛进行调查，发现贾第虫感染率为6.1％。人类对贾第虫的认识在不断深入，其对世界养殖业和人类健康的威胁也将日益受到重视。1贾第虫分类1.1传统分类早期，按形态学系统分类法，贾第虫属于肉足鞭毛门(Sarcomastigophora)、鞭毛虫亚门(Mastigophora)、动鞭毛纲(Zoomastigophorea)、双滴虫目(Diplomonadida)、六鞭毛虫科(Hexamitidae)，后来，遗传学和形态学等综合分析，贾弟虫属于后滴虫门(Metamonada)、多鞭毛虫亚门(Tfchozoa)、双滴纲(Trepomonadea)、挛虫亚纲(Diplozoa)、贾弟虫目(Giardiida)、贾弟虫属(Giardiidae)。根据不同的感染动物，到目前为止已命名的贾第虫种约有41个，但是在哺乳动物体内发现的不同的集聚体和基因型在形态学上的差异并不显著，有许多种都不确定是有效种，所以至今尚无令人满意的[22-24]统一标准。到目前为止，较公认的有6个有效种：Giardialamblia(=G.intestinalis,=G.duodenalis)主要感染人和大多数哺乳动物；G.muris是在其它哺乳动物中发现的；G.ardeae和G.psittaci主要感[25-27]染鸟类；G.agilis主要感染两栖生物；G.microti主要感染田鼠等小型啮齿动物。其中十二指肠贾第虫(Giardialamblia)是唯一可感染人类的种，可引起人的胃肠炎，同时也可感染其他大部分哺乳动物，长期以来对它的分类都很难确定。系统分类学上，十二指肠贾第虫属于肉足鞭毛门、鞭毛亚门、双滴虫目、贾第虫属、属“源真核生物”，但最近也有研究发现贾第虫细胞内没有核仁但具有核仁的功能，可能是因为其适应寄生生活导致的核仁退化，并不是原始的特征。1.2分子分类光学显微镜诊断法或免疫学诊断法可用于鉴别贾第虫，但是不能够鉴定其基因型。仅凭形态学观察鉴别是很难准确定种的，所以，可以利用分子生物学技术测定贾第虫的特定基因片断的序列，比较不同种贾第虫基因片断的序列差异来区分种类和基因型。常用的分类的基因有：小亚单位rRNA基因、磷酸丙糖异构酶(Triosephosphateisomerase，简称tim)、谷氨酸脱氢酶基因、α-3 河南农业大学2013届硕士生毕业论文贾第素基因、β-贾第素基因、V-ATP酶A亚单位基因等。基于PCR技术可用于贾第虫的基因分型，[28]贾第虫基因分型工具是基于人、家畜等的TPI基因的序列特征建立的。表1贾第虫种类和集聚体Table1GiardiaSPPandassemblage种类主要宿主TypeThemainhostGiardiaagilis两栖动物Giardiaardeae鸟类Giardiamicroti鼠类Giardiamuris其它哺乳动物Giardiapsittaci鸟类Giardialamblia人类、大多数哺乳动物AssemblageA集聚体A人类、大多数哺乳动物AssemblageB集聚体B人类、大多数哺乳动物AssemblageC集聚体C犬AssemblageD集聚体D犬AssemblageE集聚体E偶蹄家畜AssemblageF集聚体F猫AssemblageG集聚体G鼠类AssemblageH集聚体H海洋脊椎动物2005年，Makoto等对人源和牛源贾第虫β-giardin和谷氨酸脱氢酶(GDH)进行PCR扩增，应[29]用系统进化分析法分析，结果显示，分别属于集聚体A和集聚体E。最近的分子学研究表明G..intestinalis存在8个不同的遗传学基因型集聚体（A-H），但形态学没有明显差异，这些集聚体很多都有不同的宿主。只有集聚体A和B是人兽共患型，可以感染人和多种动物，犬主要感染集聚体C和D，牛等偶蹄家畜主要感染集聚体E，猫主要感染集聚体F，鼠主要感染集聚体G。但另外也有报道显示牛基因型为人兽共患基因型。在加拿大、美国、意大利、澳大利亚等国对牛贾第虫基因型的研究表明，有7个分离株被确认是集聚体A，一个分离株被确认为集聚体B，为人[30]兽共患基因型，其余的为集聚体E。另外，在日本进行的牛源贾第虫调查显示只有集聚体E。刘爱芹等基于TPI基因对我国黑龙江省的牛源贾第虫基因型分析发现了集聚体A、B和E，而且[31]有一份是集聚体A和E混合感染。Sulaiman等在2003年对人、狗、老鼠、兔子等动物的贾第[32]虫感染样品进行研究，发现兔子粪便中的分离株为集聚体B。也有资料显示集聚体E只感染偶[33]蹄家畜如牛、羊、等。近年来的一些研究在哺乳动物粪便中检出人源贾第虫基因型，所以现在普遍认为十二指肠贾第虫应该是一类贾第虫的复合体，有些虽然在形态上相同基因型却不同，但4 河南农业大学2013届硕士生毕业论文大多数的人和家畜贾第虫分离株基因型可明显的区分。不同的十二指肠贾第鞭毛虫的分离株在致病性和其它生物学性状上表现不一，不同分离株之间的分子鉴别也表明其具有宿主特异性。根据贾第虫的基因变异，目前将其分为了7种集聚体(集聚体A-G)，各集聚体之间的形态学差异不明显，具体分为人兽共患型和非人兽共患型。人兽共患型：1.集聚体AI，主要宿主为人和其他哺乳动物；2.集聚体AII，主要宿主为人；3.集聚体BIII，主要宿主为人和其他哺乳动物；4.集聚体BⅣ，主要宿主为人；非人兽共患型：5.集聚体C/D，主要宿主为犬；6.集聚体E，主要宿主为偶蹄家畜；7.集聚体F，主要宿主为猫；8.集聚体G，主要[34][35]宿主为家鼠。2010年，Erica等在海洋脊椎动物中又发现了一种新的集聚体，命名为集聚体H（见表1）。由于十二指肠贾第虫没有绝对的宿主特异性，不同的的集聚体和基因型在形态学上也没有明显的差异，所以目前尚无令人满意的统一的分类标准。目前的研究表明，兔可感染集聚体B，但目前国内外对兔贾第虫的研究相对较少。牛主要感[36,37]染集聚体E，许多资料显示牛也可感染集聚体A和B。2贾第虫形态和生活史2.1形态贾第虫有滋养体和包囊两个发育阶段，滋养体以渗透方式从体表吸收营养物质，包囊为其传播阶段。贾第虫的致病机制还不完全清楚，一般认为患者发病情况与虫株毒力、入侵数量、机体免疫力和共生内环境等多种影响因素有关。2.1.1滋养体：形状类似纵切、倒置的半个梨形，虫体长9~21μm，宽5~15μm，厚2~4μm，前端钝圆，后端渐尖，从侧面可看到背部隆起，腹面前半部向内凹陷形成腹吸盘，借此吸附于肠粘膜上，吸盘背侧有一对卵圆形的泡状细胞核，最近的研究表明核内并无核仁结构。共有4对鞭毛，根据所在部位分别定名为前侧边毛、后侧鞭毛、腹鞭毛和尾鞭毛，均由两核间靠前端的毛基体发出，前鞭毛向前伸出体外，其余3对向体两侧、腹侧和尾部伸出体外。在两核间有1对纵贯全虫的轴柱，相互平行，沿中线由前向后连接尾鞭毛，将虫体平均分为两半，在其中部吸盘后有1对呈纺锤状的中体(又名中间体或副基体)。虫体借助鞭毛摆动，作翻滚运动。腹鞭毛摆动产生的液流可为吸盘提供吸附的动力。滋养体期没有胞口，也没有食物泡，以渗透方式从体表吸收营养物质。电镜观察滋养体背面隆起，表面呈橘皮样凹凸。虫体前端腹面有一个圆盘样的腹吸盘，腹吸盘中心区表面也呈橘皮样，吸盘其它地方均光滑；腹吸盘呈不对称螺旋形结构，类似“6”字形，是由单层微管组成的。滋养体周缘具有突出的并向腹面卷曲伪足样周翼，在腹吸盘后缘向腹面包绕形成腹沟。鞭毛源自基体，基体发出细胞质组成的轴丝，延长到体外形成鞭毛。中体为一对微[38]管状结构。虫体背面有囊泡。2.1.2包囊：呈椭圆形，大小约8.5~12.5μm×6~7μm，囊壁厚度约为0.16~0.29μm。未成熟包囊有2个核，成熟包囊有4个核，偏于一端。碘液染色后虫体呈黄绿色，囊壁与虫体之间有明显间隙，5 河南农业大学2013届硕士生毕业论文可以看到鞭毛结构。扫描电镜观察囊壁一侧顶端有边缘整齐的凸起，类似小孔样结构。将包囊壁切开后可观察到囊壁是由十余层板状膜结构组成，包囊壁表面有细纹理。虫体胞质内有核糖体。虫体一端有泡状细胞核，基体位于细胞核前极之间，呈柱状体，由基体发出鞭毛。2.2生活史贾第虫的生活史较简单。滋养体早期主要寄生在小肠，尤其以十二指肠最多，中后期在胆囊、肝脏、胰脏等均可发现。滋养体以吸盘附着在肠黏膜上皮细胞，以渗透方式获取营养，以纵二分裂法进行繁殖。部分滋养体从肠壁脱落，随食进入回肠下段或结肠腔后，则形成包囊，随粪便排出体外。包囊在外界的抵抗力较强，为贾第虫的传播阶段。人和动物接触被贾第虫污染的食物和饮水后经口摄入包囊，包囊经胃酸作用后，在十二指肠内，四核虫体脱囊，胞质分裂成两个滋养体。一般滋养体都在急性期腹泻者粪便中发现，在慢性期成形便中则以包囊为主。人粪便中包囊数量较大，一昼夜排包囊量最多可达数亿甚至百亿个。有人统计，一次腹泻粪便里，滋养体数量可超过140亿个，一次正常粪便里可有包囊3亿个。3贾第虫流行病学研究3.1流行概况贾第虫病呈全球分布，据WHO估计，世界上本虫感染率约为1%~20%，在温带和热带较多，也与当地的经济卫生条件密切相关。在经济、卫生、饮水条件差的地区，发病率可高达10%~20%甚至更高。在许多发达国家如美国、加拿大、俄罗斯等，都发生过贾第虫病的暴发，大量事实证明，贾第虫的感染与年龄有密切关系，一般来说低龄群体更容易感染该病。Kucheria等人在2002年对俄罗斯Perm镇儿童医院的742名儿童进行的调查显示，平均感染率为26.4%，其中7~14岁儿童感[39]染率达到30.6%。Kramar在对伏尔加格勒市连续5年的调查中发现，贾第虫的感染率平均在6.3[40]％左右，其中学龄前儿童占31.9%。在美国，贾第虫病的病例数1992年为12793例，到1996年上升为27778例，其中纽约州占到3673例，估计全国每年有250万贾第虫病患者，在2003年至2005年的调查显示，感染人数也维持在20100左右，患者多为1-9岁的孩子和30-39岁的成年[41]人。OdoiA等在加拿大调查居民贾第虫感染率为4%~10%，且感染率与各地家畜饲养密度有关[42]。在许多发展中国家，由于经济、卫生、预防等条件与发达国家的差距，贾第虫病的感染率也更严重一些，在发展中国家里，约有2.5亿人感染贾第虫，Cheng-Ng等对委内瑞拉圣弗朗西斯科市的11月龄-6岁的儿童进行粪便检查，结果贾第虫感染率达45.1%，其中4-6岁儿童感染率高达[43][44]75%。2002年在印度Chenai市的199名城市居民感染率为22.6%。在1988~1991年，我国对全国30个省市区726个县区超过147万人进行粪检，结果显示全国贾第虫感染率2.52%，其中以新疆地区感染率最高，为9.26%，全国感染人数约为2850万。贾第虫病也是动物最容易感染的寄生虫病之一。大量报道显示，牛、马、犬、羊等家养动物[45]贾第虫感染率很高。Xiao等对美国某牛场进行调查，结果表明贾第虫感染率高达95%，Wade6 河南农业大学2013届硕士生毕业论文[46]等人检测到纽约州109头奶牛贾第虫感染率为8.9%，其中小于6月龄奶牛感染率达到20.1%。在澳大利亚的一项研究显示，新生犊牛从出生至断奶，89%在第4~7周感染贾第虫，说明牛与牛[47]的直接接触可能是主要的传播方式。Trout等对美国14个奶牛场1～2岁成年牛的共571份粪[48]便样品进行检查，各奶牛场感染率为11%～75%，平均感染率为36%，贾第虫对牛，尤其是犊牛的危害是非常严重的，每年造成大量的经济损失。另外，C.Epe等报道在欧洲，犬和猫的贾第虫感染率也很高，他们曾联合377家兽医门诊对[49]8000多只狗和4000多只猫的粪便样品进行检测，结果感染率分别为24.8%和20.3%；何宏轩等对我国吉林省犬贾第虫感染情况进行调查，感染率为25.20%，并且发现贾第虫的感染率与犬蛔[50]虫的感染呈正相关；Itoh等在2001年对日本犬贾第虫感染情况进行调查，感染率为14.6%，家[51]养犬的感染率为18.5%，户外散养犬为4.8%；Mochizuki等在东京对95只犬的调查结果为贾第[52]虫阳性率48.2%。国内外学者对犬贾第虫做了大量研究，建立了动物模型，对公共卫生具有重[53,54]要意义。朱丹、李梦婕等报道我国郏县大尾寒羊和鲁山县尧山白山羊贾第虫感染率分别为1.9%和[55,56]1.6%，且与其它种类寄生虫混合感染严重。Olson等报道加拿大某农场羊贾第虫感染率为38%，[57]马贾第虫感染率为20%，与隐孢子虫混合感染较普遍。RebeccaTraub等对美国纽约州的8匹马[58]贾第虫分离株进行TPI基因扩增，发现马的贾第虫也存在一定的人兽共患风险，Trout等在美[59]国的一只白尾鹿中也发现了贾第虫，这些调查资料说明贾第虫的易感宿主很多，在动物界中感染率非常高。[60]近年来在海洋脊椎动物中也发现有贾第虫感染，Hanks等在美国阿拉斯加州北极生物研究所对38头弓头鲸、49头北大西洋露脊鲸、18头白鲸、31只环纹海豹、22只髭海豹5种海洋哺乳动物的粪便研究中发现，环斑海豹隐孢子虫感染率为22.6%，贾第虫感染率64.5%，北大西洋露脊鲸隐孢子虫感染率为24.5%，贾第虫感染率71.4%，感染率最低的弓头鲸隐孢子虫贾第虫感染率也分别达到5.1%和33.3%；Ming-QiDeng等在太平洋海豹、象海豹和加州海狮的粪样中也检测[61]到隐孢子虫和贾第虫。这显示在海洋生物中贾第虫感染率也很高，对研究贾第虫的进化与传播具有重要意义。另外，在许多野生动物体内，也有许多关于贾第虫感染的报道，Kuhn等在美国新墨西哥州河流中的野鸭中也发现贾第虫，感染率为28%；Mcdonnell等报道，在澳大利亚发现的一种鹦鹉体内的贾第虫可引起猫的腹泻症状；Franssen，Santin等在荷兰的白鹤、北美的狼以及恒河短尾猴中[62-65]都发现了贾第虫。有关兔贾第虫的报导国内外尚不多见，但是随着养兔产业的不断发展，兔寄生虫感染带来的公共安全潜在风险也越来越受到人们的重视。1998年Chilvers等报道贾第虫感染可引起兔明显的[66]临床症状甚至死亡；Porter等报道在一次贾第虫病爆发事件中，家养的贾第虫阳性宠物兔为污[67]染源，报道指明，兔贾第虫的感染存在一定的人兽共患风险；席建伟等对河南省规模化兔场进[68]行调查显示贾第虫感染率为7.8%,且3~7月龄兔感染率最高，为11.3%；阎歌等从家兔粪便中分离出贾第虫包囊，并以乳鼠为介体建立了贾第虫的纯培养，为研究人畜之间贾第虫的关系提供7 河南农业大学2013届硕士生毕业论文[69]了材料。肖少玉等用人源贾第虫对家兔进行人工感染，灌注4次的家兔体内均检查到滋养体，[70]滋养体集中在小肠上中段(0.6-1.5m)，该段肠壁红肿且有大量炎性反应渗出物。3.2传播途径贾第虫主要通过“粪-口”途径传播，主要有水源传播、食物传播、接触传播、性传播等方式。3.2.1水源传播贾第虫病是一种水源性疾病，饮水污染是贾第虫病暴发流行的主要原因。由于河狸等大量动物都是贾第虫的保虫宿主，通过粪便污染原水水体，如果对原水水体处理不当就可造成贾第虫病的暴发流行。包囊为贾第虫感染阶段，在以过滤设备净化饮用水的的自来水厂中，包囊易改变其形状穿过滤膜孔而造成污染。曾有报导有一批去前苏联的美国旅游者回国后有20%感染了贾第虫，经调查是饮用了当地的自来水而感染。HsuBM在对台湾一个供水系统的水样进行研究时发现，所采的26份水样品中贾第虫检出率达46.2%，在饮用水处理厂采的13份经过处理的净化水中仍[71]有10份检出贾第虫；2002年，Egorov等对俄罗斯7个城市的水源和城市饮用水进行检测，均[72]发现有贾第虫或隐孢子虫包囊，这说明常规的消毒或滤网并不能有效净化水中的有害包囊；Hachich等对巴西圣保罗州的10个水源地和28个监测点的278份水样品调查也同样检测出27%[73][74]的贾第虫阳性率；HoKC等在我国香港的水库和东江下游也检出贾第虫和隐孢子虫包囊；Carmena等报道，在西班牙北部的河水、水库水中检测到较高的贾第虫感染率，提示快速过滤和[75]只用氯消毒对杀灭寄生虫的效果并不理想，存在感染水源性疾病的风险。3.2.2食物传播由于食物操作者或管理者本身为带虫者，由其污染食物再通过食物传染给其他人，或者用污水灌溉农田，造成蔬菜污染，人畜由于生食蔬菜瓜果而造成感染。有人对巴西某托儿所的生食蔬菜进行调查，发现在用水冲洗前后的蔬菜中均能检测到贾第虫，说明简单的冲洗并不能保证清除[76]掉蔬菜表面的贾第虫。Cifuentes等在墨西哥的调查显示，用于灌溉农田的污水每升含贾第虫包[77]囊达300个，经常在市场上购买蔬菜的人贾第虫感染率比经常从商店购买蔬菜的人高。在厄立特里亚的阿斯马拉市，当地居民有生吃蔬菜的习惯，对75名菜农进行粪检结果显示贾第虫感染率[78]高达45%，使用污水灌溉农田是导致其高感染率的主要原因。此外，在贝壳、牡蛎等水产体内也有贾第虫的感染，所以生食这些水产品有感染贾第虫的风险。3.2.3接触传播在学校、托儿所、家庭成员之间的“人-人”接触传播是贾第虫传播的另一形式。在贫穷、人口拥挤、饮水卫生条件差的地区，排泄物不能有效处理，贾第虫感染率普遍很高。在同一家庭中，家庭成员之间的相互传播也较普遍，在印度北部的低收入家庭中，贾第虫感染率为6%，且同一家庭中多个成员都被感染的情况较多，在我国新疆、四川、福建、广东等地区的调查发现贾第虫[79]感染有家庭聚集性。3.2.4性传播和其它传播方式近年来有许多贾第虫在同性恋者中传播的报导，同性恋之间经常导致间接“粪-口”传播；蚊蝇、蟑螂等昆虫也可能会成为传播媒介，近年来有研究表明在苍蝇体内发现的贾第虫包囊80%以[80]上有感染性。8 河南农业大学2013届硕士生毕业论文贾第虫病感染的季节性不太明显，一年四季均可感染，但因夏季雨水较多，所以6~8月为发病的高峰期。贾第虫对任何年龄的人群都易感，尤其是儿童、老年人、免疫抑制病患者、旅游者、同性恋等。4贾第虫病诊断方法贾第虫感染多为隐性，确诊只能靠实验室诊断，或用免疫学技术检测抗原或抗体，或用分子生物学技术检测种属特异性基因片段。目前贾第虫病的实验室诊断方法主要是直接涂片镜检，观察到虫体，主要优点为成本低，结果直观，并可同时检测其它虫体等。主要缺点为对样品的收集和处理要求严格，需有经验丰富的技术人员。由于包囊排出具有间歇性，所以该法漏诊率高，一般为30%~50%左右，适用于有腹泻[81]症状且包囊排出量较大的病例。随着研究不断深入，建立了多种免疫学检测方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、对流免疫电泳(CIE)、斑点免疫结合试验、直接和间接荧光抗体测定法(DFA和IFA)、间接血凝试验(IHA)、免疫荧光标记单克隆抗体法等，主要优点为特异性强、灵敏度和稳定性好、操作简便、可批量生产、同时检测多份样品等，缺点为在检测水样、环境、食品中的贾第虫监测时有不足。IFA灵敏度高，操作简便，可用于特异性抗原的检测。DFA可检测到不同环境保存的粪样中的包囊，特别是用于检测保存时间过长且已发生形变的包囊。ELISA适于贾第虫病的辅助诊断、流行病学调查等。随着免疫诊断技术的不断发展完善，将使贾第虫病的临床诊断检测更加准确便捷。目前分子生物学诊断方法以其快速敏感和特异性强等优点受到医学工作者的青睐，常用的方法有标记探针法和PCR诊断法。PCR检测技术已开始应用于粪便、水样、环境、食品中贾第虫的检测。PCR技术可用于各种样品的检测，而且可用于区分寄生虫的类型、鉴定虫种、溯源等，[82]对控制传染源和疾病流行有重要的实用价值。丁慧萍等建立了检测贾第虫的PCR方法，并证实[83]其对贾第虫的检测具有很强的敏感性。Rimhanen-Finne等用PCR方法检测地表水，具有良好的实际应用价值。目前新研制出PCR诊断试剂盒，操作更加简便，降低了检测费用。用生物素标记的贾第虫滋养体全基因组DNA、用放射性物质标记的DNA片段制成的DNA探针，具有较高的[84]敏感性和特异性。5贾第虫的药物防治目前临床治疗贾第虫病主要用甲硝唑，常用剂量250~750mg，每日3次，口服2~5周。但因该病多为慢性病，病程较长，用药量大，长期使用甲硝唑会产生一系列不良反应，常见的症状有胃肠道不适，消化道出血，损害神经系统、血液系统，心肌炎，甚至致癌、胎儿畸形等，限制了[85,86]甲硝唑在临床中的应用。另外，甲硝唑的药物机理是通过抑制原虫的氧化还原反应使氮链断裂，从而起到杀虫作用，但贾第虫包囊是重要的传播阶段，由于包囊壁的保护作用，甲硝唑对包9 河南农业大学2013届硕士生毕业论文[87]囊的杀伤作用不明显，所以近年来研发了许多抗贾第虫的新药。卢思奇等体外实验及吴玲清等[88]的实验结果表明，苦参、白头翁对贾第虫有一定治疗作用；苯并咪唑类药物可抑制微观蛋白的[89]聚合作用，对细胞骨架有损伤作用，陈家玲等的实验结果表明，阿苯达唑对贾第虫病也有一定的治疗效果；另有研究表明，青蒿素的衍生物双氢青蒿素对冲突细胞骨架和细胞超微结构均有损伤，对贾第虫有杀伤作用；有研究称双磷酸盐类药物也有一定抗贾第虫作用，但目前尚未见报道。贾第虫病主要的传染源是患者和无症状带虫者，及时发现和治疗带虫者可对本病起到很好的预防作用。日常生活中应采取以下措施做好预防工作：(1)做好粪便管理和处理，保护水源和环境不受污染；(2)生活用水厂要采用有效措施保证消毒效果；(3)加强对人民的卫生教育；(3)定期做好检查以及时发现包囊携带者；(5)旅游中要特别注意饮水卫生，要饮煮沸10分钟的水或经碘化物处理的水。6结语贾第虫是一种重要的机会性致病原虫，由其引起的贾第虫病呈世界性分布，在经济落后、饮水条件差的地区发病率较高。目前对贾第虫的研究尚处于发展完善阶段，国内外学者对贾第虫做了大量的研究，在大量的流行病学调查和分子生物学分析等方面，为人兽共患的机制提供了一定依据。但是贾第虫病的流行病学比较复杂，不同地区的流行情况也有很大差异，目前，贾第虫的分类、分子研究、传播机制等方面的研究仍不完善，因此，还需要做大量的调查研究来继续完善和阐明，对预防贾第虫病的流行具有重要意义。10 河南农业大学2013届硕士生毕业论文第二章河南省家兔、牛寄生虫流行病学调查河南省是农业大省，也是畜牧大省，2011年畜牧产值首破2000亿元，占全国畜牧业产值的8.5%，连续两年全国第一。河南省养兔历史悠久，世界公认最早的兔是河南的卢氏兔，距今约4000万年历史，养牛业在我国也占有重要地位。但是，我省畜牧业也存在着一些的问题，如中小型养殖户较多，缺乏龙头企业、病毒病和细菌病流行严重、寄生虫感染较普遍等等，由其是寄生虫病，由于它是一种慢性、消耗性疾病，所以人们对寄生虫的防治往往不够重视，给养殖业造成巨大的经济损失。据记载，全世界每年用于预防家禽球虫病的花费就达到3亿美元。在许多发达国家，每年都因畜禽寄生虫病耗费大量的财力人力，在我国，由寄生虫病造成的损失更加严重，更重要的是，这种损失往往得不到人们的重视，被视为“正常”情况。此外，有许多寄生虫不仅可以感染动物，而且具有一定的人畜共患风险，可在人与动物之间传播，对人类健康具有一定的潜在威胁。随着研究的深入，寄生虫病越来越受到人们的重视，但是还远远不够，为系统掌握河南省家兔和牛寄生虫的感染情况，作者于2012年6月至2012年11月对河南省部分地区的养兔场和牛场的寄生虫感染情况进行了调查研究，为我国家兔和牛寄生虫的感染情况提供一定依据。1材料与方法1.1样品采集根据不同地区分布、场址、规模等因素综合考虑选取河南省郑州附近（侯寨、古荥、荥阳）和豫东（开封、兰考、商丘、民权）、豫西（济源、洛阳、灵宝）、豫南（周口、西华、许昌、鄢陵）、豫北（安阳、滑县、内黄、濮阳）等地区开展调查，各个地区不同规模的养殖场、不同年龄段、品种的兔和牛尽量均衡采样。各个养殖场按养殖数量的10%左右随机采集新鲜粪便样品，每份10-20g，分别装入洁净的塑料袋内；用手术刀片刮取疑似患病动物耳根部、颈部皮肤，碎屑装入洁净的塑料袋内，记录品种、年龄、编号、健康状况、地点及平时药物预防、饲养管理等信息，带回实验室加重铬酸钾置4℃冰箱保存，于24h内检查。1.2样品检测所有采集的新鲜粪便样品经卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖溶液制片以后，用光学显微镜观察，未见虫卵或卵囊的为阴性，见虫卵或卵囊者为阳性。体外寄生虫直接加5%甘油制片观察。1.3统计学分析统计学分析采用χ2检验。1.4材料1.4.1主要仪器与耗材LD205-2低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂生产）、TDL-403台式离心机（上海飞鸽机11 河南农业大学2013届硕士生毕业论文械厂生产）、光学显微镜CX21（Olympus公司生产）、HC-TP11-5架盘药物天平（上海精科仪器厂生产）、电热鼓风干燥箱101-ABS（北京永光明医疗仪器厂生产）、4℃冰箱、数码相机、试管架、玻璃漏斗、烧杯、试管、铁架台、吸管、定时钟、80目铜筛、吊环、一次性筷子、玻璃棒、盖玻片、载玻片、标签纸等。1.4.2主要试剂1.4.2.12.5%重铬酸钾溶液的制备：重铬酸钾2.5g蒸馏水100mL1.4.2.2卢戈氏碘液的制备：碘2g碘化钾4g蒸馏水100mL1.4.2.3饱和蔗糖溶液的制备：蒸馏水320mL蔗糖500g1.5检查方法每份粪便样品取5g左右，放入100mL小烧杯中，加蒸馏水约30mL，浸泡15min后用一次-1性筷子搅拌混匀。经80目铜筛过滤至50mL的离心管中，3000r·min离心6~8min，弃上清液，沉淀备查。体外寄生虫直接加5%甘油制片，在显微镜下进行形态学观察。1.5.1卢戈氏碘液染色法取载玻片分别对应粪便样品进行编号，然后在载玻片上滴加卢戈氏碘液，用一次性筷子蘸取适量过滤离心后的粪便样品涂于载玻片上并与卢戈氏碘液混匀，最后盖上盖玻片镜检。1.5.2饱和蔗糖漂浮法-1向1.4.1中的离心管中倒入饱和蔗糖溶液，用一次性筷子搅匀，3000r·min离心6~8min，再用吊环蘸取表层液膜1~2次，涂于载玻片上，盖上盖玻片镜检。2结果与分析2.1家兔寄生虫总体感染情况本次调查共采集了1371份家兔粪便样品，检出寄生虫阳性粪样1008份，总感染率为73.52%。共查到5种肠道寄生虫，1种体外寄生虫，分别为：球虫、贾第虫、圆线虫、拴尾线虫、阿米巴和螨虫。其中以球虫感染率最高，为47.32%，贾第虫感染率为1.09%，圆线虫感染率为24.28%，拴尾线虫感染率为2.91%，阿米巴原虫感染率为7%，螨虫感染率为3.42%（详见表2-1）。12 河南农业大学2013届硕士生毕业论文表2-1不同地区家兔寄生虫感染情况Table2-1Infectionstatusofparasitinrabbitindifferentestate寄生种类采样地养殖模式品种/采样阳性感染Thekindsofparasites点数数率(%)球虫圆线虫栓尾线阿米贾第虫隐孢子虫螨虫LocatirearingBreed/ChecPositivPositiveCoccidiStrongyl虫巴GiardiaCryptospAcaridonmodekednumberenumbrate(%)aidaPassaluAmebaoridiumerras郑州A家庭养殖獭兔/483470.83%34101000郑州B规模化肉兔/513364.70%31400900开封A规模化长毛兔/806176.25%1943000024开封B规模化獭兔/644671.88%311100003开封C家庭养殖肉兔/888697.73%635804000开封D家庭养殖肉兔/706795.71%3930017000周口A家庭养殖獭兔/1414100%%14102000周口B规模化长毛兔/562239.28%15404001许昌A家庭养殖獭兔/221777.27%14600000许昌B家庭养殖长毛兔/22940.91%6400000许昌C家庭养殖长毛兔/493877.55%27702600商丘A规模化獭兔/754154.67%38406000商丘B家庭养殖长毛兔/261661.54%16000000商丘C家庭养殖长毛兔/352571.43%23021000濮阳规模化獭兔/965860.42%9334120013安阳A家庭养殖獭兔/322885.50%20404002安阳B家庭养殖獭兔/242395.83%13415001安阳C规模化肉兔/888596.59%653713003安阳D家庭养殖獭兔/302583.33%52300000安阳E规模化獭兔/484695.83%1821018000安阳F家庭养殖肉兔/403382.50%151803000安阳G家庭养殖獭兔/161275.00%51000000安阳H家庭养殖长毛兔/241979.17%81201000洛阳A规模化獭兔/564783.92%301740000洛阳B家庭养殖獭兔/302686.66%16570000洛阳C家庭养殖长毛兔/473574.46%33003000洛阳D家庭养殖獭兔/161487.50%16570000洛阳E家庭养殖獭兔/161487.50%1327000013 河南农业大学2013届硕士生毕业论文洛阳F家庭养殖长毛兔/8450%4310000济源规模化肉兔/10055%5000000合计1371100873.52%477333409615047阳性率47.32%24.28%2.91%7%1.09%03.42%2.1.1部分兔寄生虫虫卵或卵囊图片2.2不同年龄段兔寄生虫感染情况家兔寄生虫感染率与兔的年龄有很大关系，整体趋势是随着年龄的增加大，寄生虫感染率逐渐减小，除2~3月龄段感染率比小于1月龄段的高之外，本次采集的样品寄生虫感染率呈现随年龄增长而降低的趋势，以2~3月龄兔感染率最高，为84.51%，大于12月龄兔感染率最低，为51.57%，结果说明不同年龄段兔的寄生虫感染率存在差异，统计学差异达极显著水平(P<0.01)（详见表2-2）。表2-2不同年龄段兔寄生虫的感染情况Table2-2Infectionstatusofparasitinrabbitindifferentage年龄阳性数/样品数感染率AgeSamplenumber/postiveInfectionrate<1月龄44/6666.7%2-3月龄393/46584.51%4-6月龄269/33879.58%7-12月龄138/18475%>12月龄164/31851.57%2.3不同品种和饲养模式下兔寄生虫感染情况本次共采集规模化养殖厂兔样品666份，感染率为66.67%，家庭养殖场兔样品705份，感染14 河南农业大学2013届硕士生毕业论文率为90.78%，差异达极显著水平(P<0.01)。30个调查点的獭兔、长毛兔和肉兔寄生虫感染率分别为93.01%、74.59%和64.77%，獭兔的寄生虫感染率与其它两种兔的感染率统计学差异达极显著水平(P<0.01)。2.4家兔寄生虫混合感染情况本次采集的1371份兔粪便样品中，寄生虫阳性份数1008份，感染率为73.52%，混合感染率为32.10%；同时感染多种寄生虫的样品中，感染两种寄生虫的样品数最多，为295份，感染率为21.51%；感染三种寄生虫的样品数为46份，感染率为3.35%；感染四种寄生虫的样品数为7份，感染率为0.51%；2种寄生虫混合感染的病例主要为球虫和圆线虫或球虫和阿米巴混合感染（详见表2-3）。表2-3家兔寄生虫混合感染情况Table2-3Infectionstatusofparasitinrabbitinmixedinfection寄生虫感染种类混合感染情况ParasitespeciesMixedinfection两种三种四种阳性样品份数295467感染率(%）21.513.350.512.5牛寄生虫总体感染情况本次共采集了460份牛粪便样品，共检出寄生虫阳性粪样328份，总感染率为71.3%。共查到7种肠道寄生虫，1种体外寄生虫，分别为：阿米巴、线虫、球虫、鞭虫、双腔吸虫、莫尼茨绦虫、安氏隐孢子虫和牛毛虱。其中以阿米巴感染率最高，为57.17%，线虫感染率为34.34%，球虫感染率为18.04%，鞭虫感染率为4.78%，双腔吸虫感染率为3.91%，莫尼茨绦虫感染率为1.73%，安氏隐孢子虫感染率为0.21%，牛毛虱感染率为19.13%；3个地区中以民权地区的牛寄生虫感染率最高，感染率为88.66%，灵宝地区和郑州地区的感染率差异不显著，感染率分别为62.67%和63.09%，民权地区与其他两个地区间寄生虫感染率存在差异，统计学差异达极显著水平(P<0.01)（详见表2-4）。表2-4不同地区牛寄生虫感染情况Table2-4Parasiteinfectionstatusinbeefsindifferentedistrict寄生种类采样地采样阳性感染Thekindsofparasites点数数率(%)线虫球虫鞭虫阿米巴莫尼茨双腔隐孢牛毛虱LocaetiChecPositPositive绦虫吸虫子虫onkediverate(%)StrongyCoccidiwhipwamebamoniezidicrocCryptoDamalinumnumlidaaormaoelidsporidinia15 河南农业大学2013届硕士生毕业论文berberumbovis郑州16810663.09%62286581010灵宝1428962.67%41319774900民权15013388.66%5524712830024合计46032871.3%1588322263818188阳性率34.34%18.04%4.78%57.17%7%3.91%0.21%19.13%2.6牛寄生虫混合感染情况在460份牛粪样中，寄生虫阳性样品328份，感染率为71.3%，混合感染率为53.26%，多为球虫、线虫、阿米巴混合感染；其中，同时感染两种寄生虫的样品数为96份，感染率为20.86%；感染三种寄生虫的样品数最多，为135份，感染率为29.34%；感染四种寄生虫的样品数为14份，感染率为3.04%(详见表2-5)。表2-5牛寄生虫混合感染情况统计表Table2-5Infectionstatusofparasitincattleinmixedinfection寄生虫感染种类混合感染情况ParasitespeciesMixedinfection两种三种四种阳性样品份数9613514感染率(%）20.8629.343.042.6.1牛部分寄生虫虫卵或卵囊图片16 河南农业大学2013届硕士生毕业论文2.7感染强度判定调查发现的1008份兔阳性样品根据计数判定标准，寄生虫总感染率达“+”的为132份，所占阳性份数比例为12.17%；“++”为196份，占18.08%；“+++”为431份，占42.75%；“++++”为249份，占24.70%。328份牛阳性样品中，寄生虫总感染率达“+”的为87份，所占阳性份数比例为26.52%；“++”为126份，占38.41%；“+++”为130份，占39.63%；“++++”为117份，占35.67%，见图2-1。3讨论3.1寄生虫总体感染情况近几年来河南已从养殖大省走向畜牧强省之路，随着对农业结构的调整，畜牧业已成为农业板块的重中之重，但是目前，在养殖生产中，人们对畜禽寄生虫病的防治还不够重视，寄生虫病作为养殖业中常见的一种慢性、消耗性疾病，每年都给养殖业造成巨大的经济损失，许多寄生虫不仅可以感染动物，而且具有一定的人畜共患风险，可在人与动物之间传播，对人类健康具有一定的潜在威胁。本次对河南省3个地区的牛寄生虫调查共发现8种寄生虫，其中肠道寄生虫7种，体外寄生虫1种，感染率分别为阿米巴57.17%，线虫34.34%，球虫18.04%，鞭虫4.78%，双腔吸虫3.91%，莫尼茨绦虫1.73%，隐孢子虫0.21%，牛毛虱19.13%。在460份牛粪样中，寄生虫阳性样品328份，感染率为71.3%，其中以阿米巴感染率最高，为57.17%；3个地区中以民权地区的牛寄生虫感染率最高，感染率为88.66%，与其他两个地区间寄生虫感染率存在差异，统计学差异达极显著水平(P<0.01)；混合感染率为53.26%，多为球虫、线虫、阿米巴混合感染，感染三种寄生虫的样品数最多，为135份，感染率为29.34%。据报道，在一些寄生虫感染严重的地区，某些养殖场的[90,91][92]寄生虫感染率可达到100%，赵金凤等对河南省郏县红牛寄生虫感染情况的调查结果显示寄生虫总感染率为66.5%，球虫、圈线虫、鞭虫和绦虫感染率分别为61.5%、2.3%、6.9%和7.8%；[93]卢庆斌等在对河南省南乐县的肉牛肠道寄生虫调查中报道，球虫、圆线虫、鞭虫和隐孢子虫的17 河南农业大学2013届硕士生毕业论文感染率分别为、51.1%、15.5%、15.8%和4.4%。本次调查的肉牛寄生虫感染较严重，球虫、鞭虫感染率低于以往报道，线虫感染率较高，有的养牛场在圈内舍养，动物的粪尿清理不及时，牛直接在粪尿上趴卧，大大增加了寄生虫的感染机会。提示在养殖生产中需要注意加强管理，科学制定驱虫措施，做好环境卫生。本次调查的1371份家兔粪便样品中，寄生虫阳性粪样1008份，总感染率为73.52%。共查到5种肠道寄生虫，1种体外寄生虫，分别为：球虫、贾第虫、圆线虫、拴尾线虫、阿米巴和螨虫。其中以球虫感染率最高，为47.32%%，贾第虫、圆线虫、拴尾线虫、阿米巴原虫、螨虫感染率分别为1.09%、24.28%、2.91%、7%和3.42%；混合感染率为32.10%，以球虫和圆线虫或球虫和阿米巴混合感染居多，感染率为21.51%；家兔寄生虫感染以2~3月龄兔感染率最高，为84.51%，整体趋势是随着年龄的增大，寄生虫感染率逐渐减小，不同年龄段兔的寄生虫感染率统计学差异达极显著水平(P<0.01)；规模化养殖厂兔样品感染率为66.67%，家庭养殖场兔样品感染率为[16]90.78%，统计学差异达极显著水平(P<0.01)；不同品种的兔寄生虫感染率也差异显著。史柯等报道河南地区家兔球虫感染率为64.1l%，隐孢子虫、贾第虫、圆线虫和栓尾线虫感染率分别为3.42%、5.27%、8.97%和1.39%；本次调查兔球虫感染率为47.32%，与以往报道相符。兔线虫感染高于以往报道，尤其是在豫北地区，一规模化兔场圆线虫感染率达到50%，分析可能与饲料选择及保存有关。3.2兔寄生虫感染率与年龄的关系[94]资料显示，幼龄兔寄生虫感染率较高，且危害严重。王欣对辽宁省北镇市家兔的调查显示，[95]40~49日龄兔球虫感染率最高，为100%，之后随年龄增大感染率逐渐降低；冯明伦报道40-60[96]日龄家兔感染率最高，之后随年龄增加感染率逐渐降低；崔平等调查发现，河北省45～60日龄的幼兔球虫感染率最高，为96.7%；90～120日龄的青年兔球虫感染率为75.1%；种母兔感染率[97]为55.7%；祖尼萨等报道，杨凌地区1～2月龄的兔球虫感染率最高，达99.4%，12～24月龄的成年兔感染率最低，为38.9%，且随年龄增长球虫感染率呈下降趋势。本次调查结果除2~3月龄段感染率比小于1月龄段的高之外，大于2~3月龄的兔随着年龄增长，寄生虫感染率逐渐降低，结果说明家兔寄生虫感染率与年龄有显著关系，统计学差异达极显著水平(P<0.01)。3.3兔寄生虫感染率与品种和饲养模式的关系[16]史柯等调查发现，兔肠道寄生虫感染与品种具有统计学差异(P<0.05)，以獭兔感染率最高，[98][99]达85.5%。蒋学军等报道，浙江文成县肉兔球虫感染率为69.6%，刘德昊等调查结果显示，四川省荥经县长毛兔球虫感染非常普遍，各年龄段的兔均可感染，总感染率为75.1%。此次调查发现，不同品种间兔球虫感染率统计学差异极显著(P<0.01)，獭兔和肉兔相比较长毛兔，饲养周期短，用药不严格，多在粗放条件下进行饲养，可能导致其感染率较高。兔球虫病多因球虫卵囊污染了饲料及饮水被兔食入所致。调查发现，无论规模化兔场还是养殖户，不管是否使用抗球虫药，均发现球虫感染，但不同的饲养模式，兔球虫感染率统计学差异极显著(P<0.01)，饲养管理规范、消毒严格的兔场球虫感染率相对较低，且球虫卵囊感染强度相对较小。动物寄生虫病防控技术的关键点是消灭病原，临床生产中，彻底清除环境中的寄生虫卵囊不现实，可通过改善环境卫生条件，降低环境中卵囊的数量，建议合理安排饲养密度，保持环境清18 河南农业大学2013届硕士生毕业论文洁干燥，及时清除粪便，定期消毒等措施减少寄生虫对环境的污染。按期进行动物粪便的肠道寄生虫检测，及时了解动物种群的带虫情况，对于减少盲目用药，降低生产成本，提高兔、牛等肉品的质量非常重要。目前生产中主要在饲料或饮水中加抗寄生虫药物来预防寄生虫病，但应科学、合理地使用抗寄生虫药物:首先不要盲目用药，同时注意穿梭用药、轮换用药及联合用药，以提高药效。还应加强对成年动物寄生虫病的防治，以净化养殖场，建立健康种群。19 河南农业大学2013届硕士生毕业论文第三章河南省兔源贾第虫基于TPI基因的分类及种系发育分析[4]贾第虫是一种重要的机会性致病原虫，可感染人和多种哺乳动物、鸟类、两栖类动物等，其引起的贾第虫病(Giardiasis)是人兽共患性疾病，可引起动物的消化系统疾病，常见症状为腹泻、腹痛或吸收不良，导致机体抵抗力下降甚至死亡。根据不同的感染动物，到目前为止已命名的贾第虫种约有41个，但是在哺乳动物体内发现的集聚体和基因型在形态学上的差异并不显著，有许[22-24]多种都不确定是有效种，所以至今尚无令人满意的统一标准。光学显微镜诊断法或免疫学诊断法可用于鉴别贾第虫，但是不能够鉴定其基因型。贾第虫的种类较多，仅凭形态学观察鉴别是很难准确定种的，所以，可以利用分子生物学技术测定贾第虫的特定基因片断的序列，比较不同种贾第虫基因片断的序列差异来区分种类和基因型。最近的分子学研究表明G..intestinalis存在8个不同的遗传学基因型集聚体（A-H），但形态学没有明显差异，这些集聚体很多都有不同的宿主。只有集聚体A和B是人兽共患型，可以感染人和多种动物，犬主要感染集聚体C和D，牛等偶蹄家畜主要感染集聚体E，猫主要感染集聚体F，鼠主要感染集聚体G，海洋脊椎动物主要感染集聚体H。近年来的一些研究在哺乳动物粪便中检出人源贾第虫基因型，所以现在普遍认为十二指肠贾第虫应该是一类贾第虫的复合体，有些虽然在形态上相同基因型却不同，但大多数的人和家畜贾第虫分离株基因型可明显的区分。基于PCR技术可用于贾第虫的基因分型，贾第虫基因分型工具[28]是基于人、家畜等的TPI基因的序列特征建立的。笔者于2012.6~2012.11月对河南省部分地区家兔寄生虫流行情况进行了调查，镜检得到15[20]份兔贾第虫阳性样品，采用Sulaiman等建立的基于TPI基因扩增贾第虫的巢氏PCR方法对样品进行扩增，以期系统了解河南省兔源贾第虫分子生物学特性。1材料与方法1.1样品来源从2012年6月到2012年11月，对河南省17个地区30个养兔场的寄生虫感染情况进行了调查，共采集1371份兔粪便样品，经卢戈氏碘液染色后镜检，共查到15份兔粪样贾第虫阳性样品，经重铬酸钾溶液保存于4℃冰箱备用。这15份样品分别标识为G1-G15，样品详细信息见表3-1。表3-1家兔贾第虫阳性样品信息Table3-1TheInformationofGiardiapositiveinRabbitssamples地点养殖模式品种LocationRearingmodeBreedG1-G9郑州规模化肉兔G10-G15许昌家庭养殖长毛兔20 河南农业大学2013届硕士生毕业论文1.1.1主要仪器及耗材主要仪器：SP-DJ系列水平超净工作台、电热恒温水浴锅、微波炉、稳压稳流电泳仪、SVC-3000VA高精度全自动交流稳压器、P×2ThermalCyclerPCR仪、UV-2000紫外分析仪、AB204-N型电子天平、TGL-168B台式离心机、高压灭菌锅等。耗材：StoolDNAKit全粪便DNA提取试剂盒（由美国OMEGABio-Tek公司生产），型号：D4015-02、琼脂糖、量筒、烧杯、锥形瓶、PCR管、PE手套等。1.2样品清洗-1取贾第虫阳性样品1mL左右，放入2mL离心管中，加水混匀，5000r·min离心1.5min，弃上清，沉淀物加水混匀，再离心，如此反复3-5次，去除重铬酸钾，以上清液基本无色为准。1.3兔源贾第虫包囊DNA提取1、称80~100mg放于2mL离心管中，加200mg玻璃珠，冰育2分钟。2、加300μLSP1Buffer，ProteinaseK(蛋白酶K)10μL，用最大功率在震动器上震荡5min，以震碎卵囊壁。3、在恒温水浴锅中70℃孵育10min，每5min震荡一次，充分混匀样品。4、冰上孵育2min。5、加100μLSP2Buffer，震荡30sec。6、冰上孵育5min。-17、13000~15000r·min离心5min。8、吸取上清液至1.5mL离心管中，不可碰到沉淀和杂质。9、加200μLHTRReagent（HTRReagent用前震荡混匀）。10、室温孵育2min。-111、13000~15000r·min离心2min。12、吸取250μL上清液，加到新的2.0mL离心管中。13、加250μLBLBuffer，250μL无水乙醇，震荡10sec。14、将第13步的全部样本移入到一个HiBindDNA柱中，将其安装在一个2mL的集合管中，-113000~15000r·min离心1min，弃掉集合管和废液。15、将HiBindDNA柱置于新的2mL集合管中，用500μLHBBuffer清洗HiBindDNA柱，-113000~15000r·min离心1min，弃掉集合管和废液。-116、将HiBindDNA柱子置于新的集合管中，添加750μLDNAWashBuffer，13000~15000r·min离心1min。弃去液体，将柱子安装到新的集合管中。-117、室温下，13000~15000r·min离心HiBindDNA柱2min，以使柱子干燥。18、将HiBindDNA柱子置于新的1.5mL的离心管中，加入200μLElutionBuffer-1(10mMTrisbuffer,pH8.5，加入前需70℃预热），室温孵育2min；13000~15000r·min离心1min，收集DNA。21 河南农业大学2013届硕士生毕业论文1.3.3DNA提取注意事项（1）在操作过程中一定封闭好离心管口，避免泄露造成损失或污染；（2）第1步操作时，应最大功率涡旋震荡，将玻璃珠完全悬浮起；（3）不同样品一定要注意更换枪头，避免DNA污染；（4）HTRReagent使用之前必须充分的混匀；（5）每次更换Eppendorf管时，一定要做好标记，避免不能辨识样品；（6）DNAWashBuffer作为一种浓缩剂，必须要用无水乙醇稀释，如果稀释的DNAWashBuffer被冷藏，使用前必须恢复到室温。1.4PCR扩增相关试剂：1.4.1引物[20]实验所用TPI基因引物是参照Sulaiman等的方法，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，详见表3-2。表3-2基于TPI基因的引物合成表Table3-2BasedonTPIgeneprimersynthesistables第一对引物上游引物AL3543[5`-AAATIATGCCTGCTCGTCG-3`]下游引物AL3546[5`-CAAACCTTITCCGCAAACC-3`]第二对引物上游引物AL3544[5`-CCCTTCATCGGIGGTAACTT-3`]下游引物AL3545[5`-GTGGCCACCACICCCGTGCC-3`]1.4.2PCR产物的检测取5μL扩增产物和2μL上样缓冲液（loadingbuffer），充分混匀，然后加入1%琼脂糖凝胶孔中，Marker加样量为5μL，试剂均购自Takara公司。加样完成后在100V电压下电泳20分钟，然后用紫外灯观察特异条带，在电泳凝胶成像系统仪中拍照，1.4.3测序实验产物的测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，为保证序列的准确，测序采用正反双向引物各从相反方向测定。1.5贾第虫TPI基因扩增1.5.1反应体系本次实验所用的PCR扩增试剂为Takara公司生产的，反应体系为25μL。rTaq扩增酶，组成成分-12+为rTaq（5U·μL）2500U；10×PCRBuffer（含mg）1000μL，dNTP，BSA等。22 河南农业大学2013届硕士生毕业论文第一套第二套试剂体积试剂体积Buffer2.5μLBuffer2.5μLdNTP2μLdNTP2μL上游引物0.25μL上游引物0.25μL下游引物0.25μL下游引物0.25μLBSA1μLBSA1μLrTaq酶0.15μLrTaq酶0.15μLDNA3.0μL第一次PCR产物3μL灭菌双蒸水15.85μL灭菌双蒸水15.85μL1.5.2反应条件及步骤两次PCR反应条件一样，退火温度均为50℃。在选定退火温度时发现，退火温度不同产物特异性也不同，当退火温度为50℃时，电泳出的条带最亮。进行PCR反应前，将所加试剂充分混匀，漩涡震荡10sec后离心30sec，然后将样品放入PTC-200型PCR仪中，按程序设定反应条件，PCR结束后将产物放于4℃冰箱保存。2结果与分析2.1贾第虫TPI扩增结果经凝胶电泳分析，结果显示兔贾第虫的TPI基因长度约为530bp。（见图3-1）。23 河南农业大学2013届硕士生毕业论文图3-1TPI基因的PCR产物M：DL-2000Marker；P:阳性对照；贾第虫样品分别为G1、G2、G3、G4、G5；N：阴性对照.Fig3-1ThePCRproductsofGiardiaTPIgene.Note:M:DL-2000Marker;Rabbitsamples:G1、G2、G3、G4、G5；andpositivecontrol,negativecontrol.2.2贾第虫分子种系发育分析近些年来，分子生物学技术不断发展，其具有快速敏感和特异性强等优点，在虫种分类中占据越来越重要的地位。可以通过测定贾第虫的特定基因片断的序列，比较不同种贾第虫基因片断的序列差异来区分种类和基因型。序列分析为基因分析的“黄金标准”，它可以提供最完整可靠的数据，检测特殊基因的所有碱基，目前，贾第虫共有8种不同的集聚体存在，即基因型A-H，关于兔[20,100]贾第虫分子研究的报导国内外尚不多见，寄生于兔的贾第虫基因型主要为B型，国内对于兔贾第虫的基因分型尚属空白，因此采用正确的分子生物学方法鉴定兔贾第虫，可进一步深入对其生物学特性的研究，对预防和控制兔贾第虫病具有一定的指导意义。将PCR产物进行测序，具体见第三部分1.43，测序结果在GenBank中用BLAST搜索，查看与目的序列相近的结果，以证实所测序列的正确性。应用ClustalX1.81软件，将所测序列与GenBank中的参考序列进行比对，应用DNASTAR中的软件对拼接比对好的序列进行处理，用MegAlign5.0进行序列间的同源性分析，最后用MEGA5软件进行建树，应用N-J(NeighborJoint)邻接法和M-L(maximumlikelihood)最大似然法构建TPI基因种系发育进化树。2.2.1参考序列从GenBank下载的贾第虫TPI基因参考序列，序列号如下：NO.1AY368162.1WB1NO.2AY368163.1WB2NO.3AY368164.1WB3NO.4AY368165.1WB4NO.5AY368166.1WB5NO.6AY368167.1WB6NO.7AY368168.1WB7NO.8AY368169.1WB8NO.9AY368170.1WB924 河南农业大学2013届硕士生毕业论文NO.10AY368171.1WB10NO.11EF654682.1E1NO.12EF654683.1E2NO.13EF654693.1A1NO.14EF654694.1A2NO.15JX000564.1B4NO.16JQ863259.1B72.2.2序列同源性分析图3-2：兔源贾第虫基于TPI基因扩增的核苷酸序列与所选参考序列同源性比较结果Fig3-2:HomologicanalysisofTPIgenesequencesofthederivedfromrabbitswiththosereferencesfromGenBank注：其中G1-G15为本次分离株25 河南农业大学2013届硕士生毕业论文图3-3:兔源贾第虫基于TPI基因序列与其他种类的贾第虫根据邻接法（NJ）建立的系统发育关系进化树。Fig3-3:PhylogeneticrelationshipsamongGiardiaisolatedfromrabbitsandsomereferencesequencesfromGenBankinferredbyneighbour-joininganalysisotherGiardiainferredneighbor-joining(NJ)analysisofGiardiaofHenanTPInucleotidesequences.注：黑点标注的G1-G15为本次兔源贾第虫分离株，其它3株为各自所属的基因型26 河南农业大学2013届硕士生毕业论文图3-4:兔源贾第虫基于TPI基因序列与其他种类的贾第虫根据最大似然法（ML）建立的系统发育关系进化树。Fig3-4:PhylogeneticrelationshipsamongGiardiaisolatedfromrabbitsandsomereferencesequencesfromGenBankinferredbyneighbour-joininganalysisotherGiardiainferredmaximum-likelihood(ML)analysisofGiardiaofHenanTPInucleotidesequences.注：黑点标注的G1-G15为本次兔源贾第虫分离株，其它3株为各自所属的基因型27 河南农业大学2013届硕士生毕业论文[20]参照Sulaiman等的方法，本次实验用巢氏PCR方法共扩增出15个兔源贾第虫粪便样品的TPI基因，产物长度约为530bp。经测序后，与GenBank中BLAST搜索，查看与目的序列相近的结果和外缘序列，进行序列分析及同源性分析，应用N-J邻接法和M-L最大似然法构建贾第虫TPI基因种系发育进化树，进行分子遗传特征分析，图3-2显示的是本次试验获得的贾第虫分离株(G1-G15)与参考序列的同源性分析，图3-3和图3-4分别是应用N-J邻接法和M-L最大似然法构建的TPI基因种系发育进化树，两种建树方法显示的结果没有明显差别。从进化树中可以看出，本次采集的兔贾第虫分离株属于蓝氏贾第虫，所有序列共形成3个主要分支，外群集聚体A、集聚体E和所检测的样品(G1-G15)处在不同的分支上，G1-G15都处在集聚体B分支上。其中，贾第虫分离株G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G14与参考序列AY368171在同一个进化枝上，并且同源性为100%，序列AY368171基因型为WB10，由此可判断贾第虫分离株G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G14的基因型为WB10；分离株G8、G9、G10、G11、G15与参考序列JX000564在同一个进化枝上，且同源性为100%，序列JX000564基因型为B4，由此可判断分离株G8、G9、G10、G11、G15的基因型为B4；分离株G12、G13与序列JQ863259在同一个进化枝上，且同源性为100%，序列JQ863259的基因型为B7，故判断分离株G12、G13的基因型为B7。通过分析发现，本次试验获得的河南省兔源贾第虫与蓝氏贾第虫亲缘接近，为同一个种，且[20,100][20]都为集聚体B，与国外报道相一致，这进一步验证了Sulaiman等方法的特异性，也反映了河南省家兔贾第虫的感染现状，也可能说明在家兔感染贾第虫的亚型中，集聚体B为优势亚型，至于在家兔中有没有其它的亚型存在，还需要做更多样品的调查。在本次试验中，样品G1-G9采自郑州附近的规模化兔场，品种为肉兔，G10-G15采自许昌附近的家庭养殖场，品种为长毛兔。其中，分离自郑州规模化肉兔场的9份阳性样品G1-G9感染有两种基因型，分别为B4和WB10；分离自许昌附近家庭养殖场的长毛兔阳性样品G10-G15共感染有三种基因型，分别为B4、B7、WB10。3讨论3.1贾第虫种系发育研究的意义早期，对贾第虫病的诊断方法主要是显微镜检查，直接观察到虫体即可确诊，虽然很直观，[81]但是存在着漏检率高、不能鉴定虫种等缺点，不同贾第虫虫种/基因型在形态学上相差不大，仅靠显微镜检查不能鉴定虫种和基因型，采用其他方法鉴定(如动物试验等)，不仅周期长、花费高，而且不能准确判断病原来源，随着研究不断深入，建立了多种免疫学检测方法，如ELISA等等，灵敏度和稳定性有了很大的提高但是也存在一些不足，目前分子生物学诊断方法以其快速敏感和特异性强等优点受到医学工作者的青睐，常用的方法有标记探针法和PCR诊断法。PCR检测技术已开始应用于粪便、水样、环境、食品中贾第虫的检测。PCR技术可用于各种样品的检测，而且可用于区分寄生虫的类型、鉴定虫种、溯源等，对控制传染源和疾病流行有重要的实用价值。根据遗传学和形态学等综合分析，到目前为止，较公认的有6个贾第虫有效种，其中十二指28 河南农业大学2013届硕士生毕业论文肠贾第虫(Giardialamblia)是唯一可感染人类的种，可引起人的胃肠炎，同时也可感染其他大部分哺乳动物，长期以来对它的分类都很难确定。利用分子生物学技术能够使人们从分子遗传层面研究贾第虫的遗传进化，对虫种之间的鉴定和种内遗传变异的研究有很大的优势，基因序列资料可以用来建立种系发育关系。3.2基于TPI基因研究兔源贾第虫种系发育关系[101]Baruch等在1996年对北美不同宿主的贾第虫分离株的TPI基因序列进行分析，将其分为[102]了三种基因型，即WB、JH和GS型。此后，陈小宁等2001年对河北承德地区的216个居民寄生虫感染进行调查，并将分离到的3株贾第虫进行TPI基因的扩增和测序，结果显示此3株均[103,104]属于JH型。Lu等在2002年，对我国、柬埔寨、澳大利亚和美国的9株贾第虫TPI基因进行扩增测序，对序列分析显示，来自柬埔寨的一株和澳大利亚的两株贾第虫分离株属于WB型，中国的有两株属于JH型，另外两株和美国的两株同属于GS型；同年，Lu等对来自这些国家的豚鼠、绵羊等宿主的16株贾第虫TPI基因进行扩增测序，并进行建树，显示这16株虫株分为WB和GS两种基因型，这些研究表明，不同地区和宿主对贾第虫的遗传特性几乎没有影响，TPI基因可以作为研究贾第虫群体遗传结构的遗传标志。本次试验参照Sulaiman等的方法，用巢氏PCR方法共扩增出15个兔源贾第虫粪便样品的TPI基因，经测序后，与GenBank中BLAST搜索，查看与目的序列相近的结果和外缘序列，进行序列分析及同源性分析，并构建种系发育进化树。从进化树中可以看出，本次采集的兔贾第虫分离株属于蓝氏贾第虫，都处在集聚体B分支上。其中，有8株贾第虫分离株与WB10基因型完全相同，有5株分离株与B4基因型相同；有2株分离株与B7基因型相同。通过分析发现，河南省兔源贾第虫与蓝氏贾第虫亲缘接近，为同一个种，贾第虫的遗传特性较稳定，贾第虫的感染亚型与地域、品种和养殖模式没有太大的相关性。[105]实验参考的序列AY368171源自Sulaiman等报道的来自美国威斯康星州的污水中的分离[106]株，参考序列JQ863259源自NaLi等采自上海、南京、武汉和青岛的城市下水道系统中的污[107]水中的分离株，参考序列JX000564是Ye等人在贵阳黔灵公园的猴子粪便样品中分离到的。这些调查中发现的贾第虫都属于人兽共患基因型，都为集聚体A或B，在我国上海等地的污水调查中，贾第虫的阳性率都超过了60%，最高的是上海，阳性率达到97.2%，这种潜在的危害性在人们日常生活中常常被忽视，人们对这些被污染的地下水或被感染的动物如果不做到有效的防护，在很大程度上将增大被感染的机会。目前研究表明，在十二指肠贾第虫的八个集聚体中只有集聚体A和集聚体B可以感染人，本[20,100]次研究的15株河南省兔源贾第虫经分析后，都属于集聚体B，与国外以往报道一致，1998[66]年Chilvers等报道贾第虫感染可引起兔明显的临床症状甚至死亡；Porter等报道在一次贾第虫[67]病爆发事件中，贾第虫阳性宠物兔为污染源。家兔与人类的接触是十分密切的，无论作为肉用、毛用、皮用，还是作为宠物、观赏用，如果不重视贾第虫这种潜在的威胁，将对人类的健康造成威胁，虽然目前我国还没有“兔-人”之间贾第虫互相感染的病例报道，但它作为对人类健康潜在的威胁，应该引起足够的重视。本研究首29 河南农业大学2013届硕士生毕业论文次对河南省兔源贾第虫分子流行病学和基因型情况进行研究，但由于获得的分离株数量有限，要更深入了解贾第虫的流情况和基因型分布以及人感染聚集体B是否与家兔传播有关等，还需要对人源和兔源贾第虫分子流行病学做更进一步研究。30 河南农业大学2013届硕士生毕业论文结论和创新点1结论1河南省家兔和肉牛寄生虫感染率较高，且与年龄、品种、饲养模式等因素关系密切；2河南省家兔贾第虫感染率1.09%，属于篮氏贾第鞭毛虫，且为集聚体B，为人兽共患集聚体。2创新点本研究首次对河南兔源贾第虫进行分子遗传研究，鉴定出河南省兔源贾第虫分离株为集聚体B，为人兽共患基因型。31 河南农业大学2013届硕士生毕业论文参考文献[1]吕开健,吕开俊,张青,等.规模化猪场寄生虫疾病的防控[J].畜禽业，2010,253:18-19.[2]于晓慧,严若峰.浅谈人畜共患寄生虫病[J].畜牧兽医科技信息,2011,(9):1-3.[3]马广鹏,张龙现,齐萌.巨大经济损失及其公共卫生防控漏洞—对动物寄生虫病危害性的重新审视[J].中国动物保健,2009,11(7):32-37.[4]LihuaXiao.Giardiainfectioninfarmanimals[J].ParasitolToday.1994,11(10):436-438.[5]LihuaXiao,RonaldFayer.MolecularcharacterisationofspeciesandgenotypesofCryptosporidiumandGiardiaandassessmentofzoonotictransmission[J].InternationalJournalforParasitology,2008,38(11):1239-1255.[6]张月清,王正仪,卢恩,等.一个患兰氏贾第鞭毛虫病的家庭[J].中华医学志,1984,64:251.[7]FurnessBW,BeachMJ,RobertsJM.Giardiasissurveillance-UnitedStates,1992–1997[J].SurveillanceSummaries.2000,49(7):1-13.[8]ElmendorfHG,DawsonSC,McCafferyJM.ThecytoskeletonofGiardialamblia[J].IntJParasitol,2003,33(1):3228.[9]SandhuH,MahajanRC,GangulyNK.FlowcytometricassessmentoftheeffectofdrugsonGiardialambliatrophozoitesinvitro[J].MolCellBiochem,2004,265:151-160.[10]吴观陵.人体寄生虫学[M].北京:人民卫生出版社.2004.104-110.[11]蒋则孝,许隆祺,余森海,等.中国贾第虫感染流行病学现况[J].中国公共卫生,1997,13(7):407-408.[12]O’HandleyRM,OlsonME,FraserD,etal.PrevaleneceandgenotypiccharacterisationofGiardiaindairycalvesfromWesternAustrallaandWesternCanada[J].Vetparasltol,2000,90(3):193-200.[13]RalstonBJ,McAllisterTA,OlsonME.PrevaleneceandinfectionPatternofnaturallyacquiredgiardiasisandcryptosporidiosisinrangebeefcalvesandtheirdams[J].VetParasltol,2003,114(2):113-122.[14]罗小华.兔主要寄生虫病及防治措施[J].福建畜牧兽医,2012,4(34):22-25.[15]余淼,尹永志,郭春华.肉兔常见寄生虫病的防治[J].中国畜牧兽医,2011,5(38):190-192.[16]史柯,任绪朋,王强,等．河南省部分地区兔肠道寄生虫感染情况调查[J].畜牧与兽医,2010,42(5):8-70.[17]OlsonME,O’HandleyRM,RalstonBJ,etal.UpdateonCryptosporidiumandGiardiainfectionsincattle[J].TrendsParasitol,2004,20(4):185-191.[18]LihuaXiao,HerdRP.InfectionpatternofCryptosporidiumandGiardiaincalves[J].VetParasitol,1994,55(3):257-262.[19]O’HandleyRM,CockwillC,McAllisterTA,etal.Durationofnaturallyacquiredgiardiosisandcryptosporidiosisindairycalvesandtheirassociationwithdiarrhea[J].JAmVetMedAssoc,1999,214(3):391-396.32 河南农业大学2013届硕士生毕业论文[20]SulaimanIM,FayerR,BernC,etal.TriosephosphateisomerasegenecharacterizationandpotentialzoonotictransmissionofGiardiaduodenalis[J].EmergInfectDis,2003,9:1444-1452.[21]HerreraLC,KleinD,LapanG,etal.CharacterizationofvirulencefactorsinEscherichiacoliisolatedfromdiarrheicandhealthycalvesinAustriasheddingvariousenteropathogenicagents[J].VeterinarniMedicina,2009,54(1):1-11.[22]CampbellSR,KeulenH,ErlandsenSL,etal.Giardiasp:comparisonofelectrophoretickaryotypes[J].ExpParasitol,1990,71(4):470-482.[23]KeulenH,GutellR,GatesM,etal.UniquephylogeneticpositionofDiplomonadidabasedonthecompletesmallsubunitribosomalRNAsequenceofGiardiaardeae,Giardiamuris,GiardiaduodenalisandHexamitasp[J].FASEBJ,1993,7:223-231.[24]OlsonME,HandleyRM,RalstonBJ,etal.UpdateonCryptosporidiumandGardiainfectionsincattle[J].TrendsParasitol,2004,20(4):185-191.[25]BruscaRC,BruscaGJ.Invertebrates[J].SinauerAssociates,2003,2:23-25.[26]AdamRD.BiologyofGiardia[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2001,447-475.[27]DavidRM,SchulzK,WaynePM.TreeofLifeWebProject[J].ZOOTAXA.2007,1668:19-40.[28]SulaimanIM,FayerR,BernC,etal.TriosephosphateisomerasegenecharacterizationandpotentialzoonotictransmissionofmultispeciesGiardiaduodenalis[J].EmergInfectDis,2003,9:1444-1452.[29]MatsubayashiM,KimataI,AbeN.IdentificationofGenotypesofGiardiaintestinalisIsolatesfromaHumanandCalfinJapan[J].TheJournalofVeterinaryMedicalScience,2005,67(3):337-340.[30]MendoncaC,AlmeidaA,CastroA,etal.MolecularcharacterizationofCryptosporidiumandGiardiaisolatesfromcattlefromPortugal[J].VetParasitol,2007,147(1-2):47-50.[31]AiqinLiu,XiaoyunZhang,LongxianZhang,etal.OccurrenceofbovinegiardiasisandendemicgeneticcharacterizationofGiardiaduodenalisisolatesinHeilongjiangProvince,intheNortheastofChina[J].ParasitolRes,2012,111:655-661.[32]SulaimanIM,FayerR,BernC,etal.TriosephosphateisomerasegenecharacterizationandpotentialzoonotictransmissionofGiardiaduodenalis[J].EmergInfectDis.2003,9(11):1444-1452.[33]AdamRD.BiologyofGiardialamblia[J].ClinMicrobiolRev,2001,14(3):447-475.[34]LihuaXiao,FayerR.MolecularcharacterizationofspeciesandgenotypesofCryptosporidiumandGiardiaandassessmentofzoonotictransmission[J].IntJParasitol,2008,38:1240-1253.[35]EricaLN,DavidMW,MitchellLS.TheidentificationofanewGiardiaduodenalisassemblageinmarinevertebratesandapreliminaryanalysisofG.duodenalispopulationbiologyinmarinesystems[J].InternationalJournalforParasitology,2010,9(40):1063-1074.[36]TroutJM,SantinM,GreinerEC.PrevalenceandgenotypesofGiardiaduodenalisin1-2yearold33 河南农业大学2013届硕士生毕业论文dairycattle[J].VetParasitol,2006,140(3-4):217-222.[37]TroutJM,SantinM,FayerR,etal.PrevalenceofGiardiaduodenalisgenotypesinadultdairycattle[J].VetParasitol,2007,147(3-4):205-209.[38]杜之鸣,李向印,张玉英,等.贾第虫滋养体的扫描电镜观察[J].寄生虫学与寄生虫病杂志,1985,3(2):20-23.[39]KucheriaTV,MakarovaTA,KocherginaEA,etal.TreatmentofGiardiainchildrenundercurrentconditions:efficacyandchoiceofspecificdrug[J].MedParazitol(Mosk),2002,(3):33-35.[40]KramarLV,ReznikovEV,KramarOG.PrevalenceofgiardiasisinVolgogradcitypopulation[J].MedParazitol(Mosk),2003,(4):38-39.[41]JonathanS,Yoder,MichaelJ,etal.Giardiasissurveillance-UnitedStates,2003-2005[J].SurveillanceSummaries,2007,56(7):11-18.[42]OdoiA,MartinSW,MichelP,etal.InvestigationofclustersofgiardiasisusingGISandaspatialscanstatistic[J].IntJHealthGeogr,2004,3(1):11.[43]ChengNR,CastellanoJA,DiazSO,etal.PrevalenceofgiardiasisindaycarecentersinSanFranciscomunicipality,stateofZulia,Venezuela[J].InvestClin,2002,43(4):231-237.[44]FernandezMC,VergheseS,BhuvaneswariR,etal.AcomparativestudyoftheintestinalparasitesprevalentamongchildrenlivinginruralandurbansettingsinandaroundChennai[J].CommunDisintel,2002,34(1):35-39.[45]LihuaXiao,FayerR.MolecularcharacterisationofspeciesandgenotypesofCryptosporidiumandGiardiaandassessmentofzoonotictransmission[J].InternationalJournalforParasitology,2008,11(38):1239-1255.[46]WadeSE,MohammedHO,SchaafSL.PrevalenceofGiardiasp.CryptosporidiumparvumandCryptosporidiumandersoni(syn.C.muris)[correctionofCryptosporidiumparvumandCryptosporidiummuris(C.andersoni)]in109dairyherdsinfivecountiesofsoutheasternNewYork[J].VeterinaryParasitology,2000,93(1):1-11.[47]BecherKA,RobertsonID,FraserDM,eta1.MolecularepidemiolngyofGiardiaandCryp-tosporidiuminfectionsindairycalvesoriginatingfromthreesourcesinWestemAustralia[J].VetParasitol,2004,123(1-2):l-9.[48]TroutJM,SantínM,GreinerEC,etal.PrevalenceandgenotypesofGiardiaduodenalisin1-2yearolddairycattle[J].VetParasitol,2006,140(3-4):217-222.[49]EpeC,RebkterG，SchniederT,eta1.PrevalenceofGiardiainfectionindogsandcatsinEurope[J].Veterinaryparasitology,2010,(173):32-38.[50]何宏轩,张西臣,喻建军,等.吉林省犬贾第虫感染情况的调查[J].黑龙江畜牧兽医,2001,(11):19.[51]ItohN,MuraokaN,AokiM,eta1.PrevalenceofGiardialambliainfectioninhouseholddogs[J].34 河南农业大学2013届硕士生毕业论文TheJournaloftheJapaneseAssociationforInfectiousDiseases,2001,75(8):671-677.[52]MochizukiM,HashimotoM,IshidaT.RecentepidemiologicalstatusofcanineviralentericinfectionsandGiardiainfectioninJapan[J].TheJournalofVeterinaryMedicalScience,2001,63(5):573-575.[53]喻建军,张西臣,李建华.犬贾第虫包囊排出规律的研究[J].畜牧与兽医,2001,33(1)：8-9.[54]何宏轩,张西臣,喻建军.犬贾第虫病的诊治[J].中国兽医科技,2000,30(12):44-45.[55]朱丹,卫九健,齐萌,等.河南郏县大尾寒羊肠道寄生虫感染情况调查[J].中国草食动物,2012,(1):69-71.[56]李梦婕,朱丹,齐萌,等.尧山白山羊肠道寄生虫感染情况调查[J].中国畜牧兽医,2012,(3):164-167.[57]OlsonME,ThorlaksonCL,DeselliersL,etal.GiardiaandCryptosporidiuminCanadianfarmanimals[J].VeterinaryParasitology,1997,4(68):375-381.[58]RebeccaT,SusanW,CarolynR,etal.MolecularcharacterizationofpotentiallyzoonoticisolatesofGiardiaduodenalisinhorses[J].VeterinaryParasitology,2005,3(130):317-321.[59]TroutJM,SantinM,FayerR.IdentificationofAssemblageAGiardiainWhite-TailedDeer[J].JournalofParasitology,2003,6(89):1254-1255.[60]HughesJM,RickardLM,PanuskaC,etal.PrevalenceofCryptosporidiumspp.andGiardiaspp.infivemarinemammalSpecies[J].JournalofParasitology,2005,5(91):1225-1228.[61]MingQD,Peterson,CliverD.FirstfindingsofCryptosporidiumandGiardiainCaliforniaSeaLions(ZalophusCalifornianus)[J].JournalofParasitology,2000,3(86):490-494.[62]JamesM,TroutPhD,PhD,etal.GiardiaandCryptosporidiumspeciesandGenotypesincoyotes[J].JournalofZooandWildlifeMedicine,2006,37(2):141-144.[63]Franssen,HooimeijerJ,BlankensteinB,etal.GiardiasisinawhitestorkinTheNetherlands[J].JournalofWildlifeDiseases,2000,4(36):764-766.[64]KuhnRC,ChannahMR,OshimaKH.OccurrenceofCryptosporidiumandGiardiainWildDucksalongtheRioGrandeRiverValleyinSouthernNewMexico[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2002,1(68):161-165.[65]McdonnellPA,ScottKG,TeohDA,etal.Giardiaduodenalistrophozoitesisolatedfromaparrot(Cacatuagalerita)colonizethesmallintestinaltractsofdomestickittensandlambs[J].VeterinaryParasitology,2003,1(111):31-46.[66]ChilversBL,CowanPE,WaddingtonDC,etal.TheprevalenceofinfectionofGiardiaspp.andCryptosporidiumspp．Inwildanimals0nfarmland,southeasternNorthIsland,NewZealand[J]．IntJEnvironHealthRes,1998,8(1):59-64.[67]PorterJD,GaffneyC,HeymannD,etal.Food-homeOutbreakofGiardiaLamblia[J].AmJPublicHealth,1990,80(10):1259-1260.35 河南农业大学2013届硕士生毕业论文[68]席建伟,张开放,齐萌,等.河南省规模化兔场兔贾第虫感染情况调查[J].畜牧与兽医,2011,43(5):78-79.[69]ThompsonRC,MeloniBP,LymberyAJ,eta1.Humanandcathavegenetically-identicalformofGiardia:evidenceofazoonoticrelationship[J].MedJAust,1988,148:207-209.[70]肖少玉,谭苹,张国华,等.家兔人工感染人源贾第虫的实验研究[J].公共卫生与预防兽医学,2007,4(18):80-81.[71]HsuBM,HuangC,HsuCL.AnalysisforGiardiacystsandCryptosporidiumoocystsinwatersamplesfromsmallwatersysternsinTaiwan[J].ParasitolRes,2001,87(2):163-168.[72]EgorovA,PaulauskisJ,PetrovaL,etal.ContaminationofwatersupplieswithCryptosporidiumparvumandGiardialambliaanddiarrhealillnessinselectedRussiancities[J].IntJHygEnvironHealth,2002,205(4):281-289.[73]HachichEM,SatoMI,GalvaniAT,etal.GiardiaandCryptosporidiuminsourcewatersofSaoPauloState,Brazil[J].WaterSciTechnol,2004,50(1):239-245.[74]HoKC,ChowYL,YauJT.ChemicalandmicrobiologicalqualitiesofTheEastRiver(Dongiiang)water,withparticularreferencetodrinkingwatersupplyinHongKong[J].Chemosphere,2003,52(9):1441-1450.[75]Carmena,Aguinagalde,ZigorragaC,etal.PresenceofGiardiacystsandCryptosporidiumoocystsindrinkingwatersuppliesinnorthernSpain[J].JournalofAppliedMicrobiology,2007,3(102):619-629.[76]CoelhoLM,OliveiraSM,MilmanMH,etal.DetectionoftransmissibleformsofenteroparasitesinwaterandvegetablesconsumedatschoolsinSorocaba,SaoPaulostate,Brazil[J].RevSocBrasMedTrop,2001,34(5):479-482.[77]CifuentesE,GomezM,BlumenthalU,etal.RiskfactorsforGiardiaintestinalisinfectioninagriculturalvillagespracticingwastewaterirrigationinMexico[J].AmJTropMedHyg,2000,62(3):388-392.[78]SrikanthR,NaikD.PrevalenceofgiardiasisduetowastewaterreuseforagricultureinthesuburbsofAsmaraCity,Eritrea[J].IntJEnvironHealthRes,2004,14(1):43-52.[79]BansalD,SehgalR,BhattiHS,Intestinalparasitesandintrafamilialincidenceinalowsocio-economicareaofChandigarh(NorthIndia)[J].EuropePubMedCentral,2004,6(1):28-31.[80]SzostakowskaB,KruminisLW,RacewiczM,etal.CryptosporidiumparvumandCiardialambliarecoveredfromfliesonacattlefarmandinalandfil1[J].ApplEnvironMicrobiol,2004,70(6):3742-3744.[81]BurkeJA.Theclinicalandlaboratorydiagnosisofgiardiasis[J].CreCriRevClinLabSci,1977,7(4):373-391.[82]丁慧萍,卢思奇,戎煌,等.用PCR扩增tim基因检测十二指肠贾第鞭毛虫[J].寄生虫与医学36 河南农业大学2013届硕士生毕业论文昆虫学报,2002,9(2):65-69.[83]RimhanenFR,HormanA,RonkainenP,etal.AnIC-PCRMethodfordetectionofCryptosPoridiumandGiardiainnaturalsurfacewatersinFinland[J].JMicrobiolMethods,2002,50(3):299-303.[84]卢思奇,闫歌,王风芸,等.生物素标记贾第虫全基因组DNA探针的制备及其特异性敏感性测定[J].动物学研究,1994,15(1):85-90.[85]KiserJD,PaulsonCP,BrownC.Clinicalinquiries.What`sthemosteffectivetreatmentforgiardiasis[J].JFamPract,2008,52(4):270-272.[86]徐春玲.甲硝唑临床应用中的不良反应[J].中华医药指南,2008,6(16):500-589.[87]卢思奇,庞苏红,王风芸.苦参体外抗贾第虫药物作用的初步观察[J].首都医学院学报,1993,14:99-101.[88]吴玲清,卢思奇,王凤芸,等.苦参乙醇提取物体外抗贾第虫药物作用的观察[J].首都医学院学报,1994,15(4):261-264.[89]陈家玲,拾景美.贾第虫病的化学治疗[J].中华儿科杂志,1994,32(4):236-238.[90]黄保,戴小瑜,姚强.雷州黄牛寄生虫感染情况的调查报告[J].畜牧与饲料科学,2007(4):15-16.[91]周维,姚新华,李德军,等.黄牛寄生虫感染情况的调查报告[J].中国畜牧兽医,2006,33(10):23-25.[92]赵金凤,齐萌,董海聚,等.河南省郏县红牛肠道寄生虫感染情况调查[J].中国畜牧兽医,2011,38(3):176-178.[93]卢庆斌,高庚渠,菅复春。等.肉牛肠道寄生虫感染情况调查[J].中国畜牧兽医,2008,35(3):103-105.[94]王欣.北镇市家兔球虫病流行病学调查报告[J].现代畜牧兽医,2011(5):52-53.[95]冯明伦.铜粱县农户家兔球虫病流行病学调查[J].畜牧市场,2006(8):160-161.[96]崔平,方素芳,顾小龙,等.河北省部分地区兔球虫种类及感染率调查[J].西北农业学报,2010,19(7):21-24.[97]祖尼萨,童德文,于三科.杨凌地区家兔球虫种类与感染情况调查[J].西北农业学报,2010,19(8):12-15.[98]蒋学军,吴跃华,林松女.浙江省文成县兔球虫病流行病学调查[J].中国养兔杂志,2006(6):7-8.[99]刘德昊,杨光友,赖松家,等.荥经县长毛兔球虫病感染情况调查及防治对策[J].畜牧与兽医,2006,38(5):42-43．[100]LebbadM,MattssonJG,ChristenssonB,etal.Frommousetomoose:multilocusgenotypingofGiardiaisolatesfromvariousanimalspecies[J].Vet.Parasitol,2010,168(3-4):231-239.[101]BaruchAC.IsaacRJ,AdamRD.ThemolecularepidemiologyofGiardialamblia：ASequence-basedapproach[J].InfectDis,1996,174:233-236.37 河南农业大学2013届硕士生毕业论文[102]陈小宁,卢思奇,李继红,等.蓝氏贾第鞭毛虫河北株的分离及其基因型究[J].中国寄生虫病防治杂,2001,14(2):100-102.[103]SiqiLu,JianfanWen,JihongLi,eta1.DNAsequenceanalysisofthetriosephosphateisomerasegenefromisolatesofGiardialamblia[J].ChineseMedicalJournal,2002,l5(1):99-102.[104]SiqiLu,JihongLi,YapingZhang,eta1.Intraspeeifiediferenceofthetriosephosphateisomerase(tim)genefromGiardialomblia[J].ChineseMedicalJournal,2002,115(5):763-706.[105]SulaimanIM.,JianlinJiang,LihuaXiao,etal.DistributionofGiardiaduodenalisGenotypesandSubgenotypesinRawUrbanWastewaterinMilwaukee,Wisconsin[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,2004,(70):3776-3780.[106]NaLi,XiaoLihua,LinWang,etal.MolecularSurveillanceofCryptosporidiumspp,Giardiaduodenalis,andEnterocytozoonbieneusibyGenotypingandSubtypingParasitesinWastewater[J].NeglectedTropicalDiseases,2012,9(6):1-11.[107]JianbinYe,LihuaXiao,JingboMa,etal.AnthroponoticEntericParasitesinMonkeysinPublicPark,China[J].EmergingInfectiousDiseases,2012,18(10):1640-1643.38 河南农业大学2013届硕士生毕业论文EpidemiologicalInvestigationofIntestinalParasitesofRabbitandcattleinHenanProvinceandMolecularCharacteristicsofRabbitGiardiaIsolatesSupervisor:Associatepro.JianFuchunMasterCandidate:LiuJieABSTRACTParasiticdiseaseisasignificantchronic,debilitatingillnessinthebreeding.Theycancausediarrhea,dehydration,nausea,vomiting,malabsorption,evenlife-threatening,particularlyinimmunocompromisedanimals.Mostofthemarezoonotic,whichcanbetransmittedbetweenthehumansandtheanimalsmostbythefecal-oralroute.Therefore,theparasiticdiseasehasbeenaconcernasacertainpotentialthreattohumanhealth.Intheparasiticdiseasethatcancausediarrhea,Giardiaduodenalisisthecommoncause.Giardiasisisaprofuse,chronicdiseasewhichhasabroadrangeofhostsandcanbetransmittedbythefecal-oralroute,viaeitherdirectcontactoringestionofcontaminatedfoodorwater.Giardiaisoneoftheparasitewhichhasathreatenonpublichealthandanimals.InordertounderstandrabbitandbeefcattleinfectionconditionandepidemiologicalcharacteristicsofGiardiaduodenalisinHenanProvince,samplesoffreshstoolobtainedfrom30rabbitand3beeffarmersfrom17differentcitiesweredetectedforcystsofGiardiaduodenalisbymicroscopeafterLugol'siodinestainingandsaturatedsucrosesolutionfromJune2012toNovember2012.TodeterminegenotypeorsubtypeofpositiveGiardiaduodenalissamples,theauthorperformedasequenced-basedanalysisbasedonthetriosephosphateisomerase(TPI)gene.1.TostudytheprevelanceandcharacteroftheallintestinalparasitesonrabbitandcattleinHenanprovince,1371freshrabbitstoolsamplesfrom30rabbitfarmersand460speciesfrom3beefherdsfrom17differentcitieswerecollectedincluding,Zhengzhou,Xingyang,Kaifeng,Lankao,Shangqiu,Jiyuan,Luoyang,Zhoukou,Xihua,Xuchang,Yanling,Anyang,Huaxian,Neihuang,Puyang,Minquan,Lingbao.1008rabbitfecalspecimenswereparasitepositive,thetotalinfectionrateoftheintestinalparasitwas73.52%(1008/1371)thereweresixparasites,Coccidia，Giardia,Strongylid,PassalurusambiguusAmoeba,Mite.andwiththeCoccidiahighestinfectionrateof47.32%,Giardia,Strongylid,PassalurusambiguusAmoeba,Miteinfectionratewas1.09%,24.28%,2.91%,7%,3.42%respectively.328outof460cattlefecalspecimenswereparasitepositive,thetotalinfectionrateoftheintestinalparasitwas73.52%,thereweresevenparasites,Coccidia，Giardia,Strongylid,Whipworm,Dicrocoelid,MnieziaAmoeba,Cryptosporidiumandersioni,Damaliniabovis,andwiththeAmoebahighestinfectionrateof57.17%,Strongylid,Coccidia,Whipworm,Dicrocoelid,Mniezia,Cryptosporidiumandersioni,Damaliniabovis,Giardiainfectionratewas34.34%，18.04%,4.78%,3.91%,1.73%,0.21%,19.13%,1.09%respectively.Theresultshowedthat,showanegativerelationbetweeninfectionrateesandageofrabbits.39 河南农业大学2013届硕士生毕业论文2.InordertoknowthegeneticcharacteristicsofGiardiaisolates，15positivesampleswerePCRbasedonTPIlociwith530bpfragments.ThePCRproductsweresequenced,blastedononlinedatabaseNCBI,performedsequencealignmentwithClustalX2.1,andconstructtheevolutiontreewithDNASTAR,theresultshowed15isolateswereassemblageB,8samplesbelongedtoWB10genotype,5samplewereB4genotype,and2sampleswereB7genotype.Giardiaisanimportantparasiteof10specieswhichharmpeople'shealth,assemblageBisthezoonitcgenotype.ThestudyshowedGiardiaisolatedfromrabbithasanimportantpublichealthimplications.TheresultsprovidesomereferencesforparasitecontrolofcattleandrabbitsinHenanprovince.Keywords:Rabbit;Cattle;Parasite;Giardia;TPIgene;Pphylogeneticanalysis40
