肺炎双球菌转化

《肺炎双球菌转化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、细菌转化[适应对象]生物工程专业[实验学时]6学时一、实验目的把外源DNA或体外重组的DNA或是某种质粒引入受体细胞中去，使受体菌具有新的遗传性，并从中选择出转化子。二、实验原理本实验是以大肠杆菌质粒PBR325作为外源DNA，将它从大肠杆菌HB101中抽提出来，此PBR325质粒上代有3个抗性标记，即Apr、Tcr、Cmr。以大肠杆菌C600作为受体菌，大肠杆菌C600对Amp、Tc、Cm是敏感的，若将PBR325质粒转化到C600中后即能在选择性平板LB+Ap、Tc、Cm上长出转化子来。本实验抽提质粒PBR325采用碱变性抽提法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体

2、DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离的目的。三、仪器设备及实验材料（一）仪器设备：无菌离心管，PA瓶、三角瓶、试管、培养皿等。（二）实验材料：1、菌种：大肠杆菌HB101（PBR325）；大肠杆菌C600（受体）2、培养基：LB液体；LB固体3、抗菌素：氨苄青霉素（Amp）；氨霉素（cm）；四环素（Tc）。4、试剂（1）溶液（I）：200mM葡萄糖25毫升250mMEDTA4毫升1MTris－HCL(Ph8.0)25毫升加Dh2O至200毫升（2）溶液（II）：10MNaOH4毫升20%SDS10毫升加dh2O至200毫升4（3）溶液（Ⅲ）：3MNaAc(P

3、h4.8)溶液（4）ph4.8Tris－HCL饱和的苯酚（5）酚/氯仿（1：1）（6）TE溶液10mMTris－HCL(Ph4.8)1mMEDTA（7）冷乙醇（无水或95%）（8）0.1MCaCL2（9）0.1MMgCL2四、相关知识点重组DNA质粒转化不同细菌有不同的转化效率。转化率的高低与受体菌感受态有关，只有具备感受态的细菌才能摄取外来的DAN分子。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生的，一般出在长期生长对数期的后期。五、实验步骤（一）抽提质粒PBR3251、将斜面K12HB101挑取一环于5毫升LB溶液中（含Tc15微克/毫升，Amp100微克/毫升,Cm1

4、00微克/毫升）于37℃过夜。2、将长好的菌液倒入7毫升无菌离心管中，以8000rpm离心10分钟。3、弃上清，打匀沉淀，加500微升溶液I在冰上放30分钟。4、再加入1000微升的溶液Ⅱ（现配制）在温室下放置5－8分钟（反复轻轻转动几次）。5、再加入750微升的溶液Ⅲ，在冰上放20－30分钟（轻轻转动几次）。6、以15000rpm离心10分钟。7、转上清液于另一支无菌管中。8、用等体的饱和苯酚抽提一次（即：混匀、摇动后以12000rpm离心10分钟）。9、上清液转入另一支离心管，加等体积的苯酚/氯仿（1：1）以12000rpm离心10分钟，再抽提一次。10、上清液

5、转入另一支离心管加2倍体积的冷的乙醇于－20℃沉淀3—4小时。411、将离心管取出，12000rpm离心10分钟。12、弃上清，沉淀冷冻的抽干加50微升的TE溶液溶解。（二）感受态细菌的制备1、接种受体菌C600于LB中37℃过夜。2、按1%的量转接于100毫升LB溶液中，37℃摇2—3小时。3、将菌液转至二支离心管中（50毫升/管）冰浴10分钟。4、4℃离心，8000rpm离心10分钟，弃上清，打匀沉淀。5、每支离心管加入10毫升冷MgCl2再离心一次。6、弃上清，菌体加入10毫升CaCL2（冷的）冰浴30分钟，8000rpm离心10分钟.7、弃上清，菌体2毫升C

6、aCL2（冷），同时加20%甘油混匀。8、分装成若干支小试管（0.2—0.3毫升）于－70℃保存备用。（三）转化1、取制备好的试管（感受态细菌）一支，加入20微升质粒DNAPBR325，混匀冰浴30分钟。2、42℃热冲击2分钟。3、加入1毫升LB溶液37℃水浴1小时左右。4、接种于5毫升含有一定浓度Apm、Tc、Cm的LB溶液中于37℃过夜。Amp：100微克/毫升Tc：15微克/毫升Cm：100微克/毫升5、挑取转化子。六、实验报告要求实验报告中包含学生姓名、班级、实验时间、实验地点、实验项目名称、实验原理、实验操作流程、实验结果及分析、讨论、思考题。七、思考题（

7、一）详细阐述影响DNA转化的因素？（二）采用碱变性抽提质粒PBR325的优缺点有哪些？八、实验成绩评定办法通过考查学生的实际4动手能力，结合实验报告书写情况进行评定实验成绩，学生实际动手能力、实验报告书情况写各占该实验成绩的50%。实验报告书写情况主要评分点如下：原理描述、实验流程、实验结果及分析、实验效果等。4