dna的溶液配制方法

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时间:2018-01-23

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1、1.0.5mol/LEDTA配制组分浓度:0.5mol/lEDTA,PH=8配制量:500ml配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O,置于500ml烧杯中  (2)加入约400mlddH2O.用热磁力搅拌器充分搅拌  (3)用NaOH调节PH值到8,约用10克固体NaOH  (4)在溶液冷却后,再用NaOH调节至PH=8  (5)加ddH2O将溶液定容到500ml  (6)高温高压灭菌后,室温保存2.NaOH溶液的配制组分浓度:5mol/lNaOH配制量:100ml配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中(2)加入ddH2O定容到100ml3.100mmo

2、l/lTris-HCl的配制组分浓度:mmol/lTris-HCl,PH=6.4配制量:250ml配制方法(1)称取3.025克Tris于250ml烧杯中.  (2)加入约200mlddH2O充分搅拌溶解.  (3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3ml  (4)将溶液定容至250ml  (5)用棕色瓶分装于4度冰箱中  (6)如使用,用水浴加热溶解.4.氯仿-异戊醇的配制:配制方法(1)简单的体积混合,既要求比例为24:1即可  (2)储存于棕色玻璃瓶子中  (3)置于4度冰箱以便日后使用5.去污剂:CTAB:可将细胞膜裂解,使DNA释放到提取液中,同时也使组织匀浆中

3、的蛋白质变性.EDTA:能与DNase的辅助因子Mg2+结合,使DNase失去活性,不能降解从细胞中释放的DNA.6.还原剂巯基乙醇:它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.7.氯仿—异戊醇:它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去,将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开除去.8.RNase:它可去除核酸中的RNA,只留下DNA.9.硅珠悬浮液的配制(1)称取1.2g硅珠粉,溶解于10ml无菌水中.(2)放入4℃冰箱备用.(3)使用时先涡旋使其混合均匀10.    10×TE,500ml配制如下:将100mMTris-Hcl(PH=8.0)6.057g与10mMEDTA

4、(PH=8.0)1.8612g溶于400ddH2O中,调PH=8.0,定容到500ml。11.    1×TEBuffer组成浓度:10mMTris-HCl  1mMEDTAPH=8.0配制量:500ml配制方法:量取下列溶液于500ml烧杯中    1MTris-HCl  BufferPH=8.0  5ml    0.5MEDTA    PH=8.0  1ml    向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌;室温保存.12.    聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGEPAGE操作流程及注意事项:1、涂胶1)将有耳玻片(耳朝下)泡于反硅化剂中,新

5、液25分钟,旧液30分钟.2)涂无耳正面玻片硅化剂.均匀点四滴,轻而匀的沿一个方向涂三次,静10分钟.3)到时间取出.打开通风橱风干30分钟.2、封胶1)将两玻片对贴于橡胶框中,放平,用力拧死,夹住橡胶管.2)溶废琼脂胶,分两次:第一次50秒,第二次10-20秒,防止沸出.3)用小细长枪头通透加胶枪头,便于加样通畅,少起气泡.4)吸2500-3000ul液胶加速沿玻片边缘快速顺下滴,将两面玻片充分封死,防止漏胶.以水平底线面水平高于底为佳,静止凝胶15分钟.(有时可先在封口加一点TBE以润滑玻片,利于胶流下)3、灌胶1)用长细枪头透开加胶枪头2)从中间加入,每次不要全部打完,留

6、一点在枪头内.防止断流而导致胶中含有气泡.3)插梳子时两端平整,梳子紧贴玻板,梳齿头部不可有气泡.4)拔梳子时先加一倍TBE液将梳子泡透,然后平行用力拔出.5)在插梳子15分钟内跟踪观察,适当下按,保证孔的深度.6)等待2小时,以便胶充分凝固.4、吹孔1)向中间槽加入1倍粗制TBE,要淹没过内玻片约1厘米.2)拔梳子,小心平稳,均匀平衡.3)调1000p枪到300-600ul,进行吹孔,将小孔内沉淀物吹打干净,加样中再视时吹5、加样1)用细长专用枪加入DNA0.5ul.2)一手托另一臂的肘,以保证加样手不抖.3)一定垂直加到孔中去,不脱尾,不吸水,不靠壁,干净利落.4)加完一次

7、.在放于桌旁的吸纸上,将细枪头上余液吸干.5)首、中、尾各留1到2个孔,两面胶孔的Marker不完全一样,以便区分.6)加Marker0.15ul一般取0.3ul每孔注如一半,可用两个孔.6、跑胶1)向两侧槽中加入粗制TBE,至U管线处.2)打开电源,稳压到120V3)电泳2h左右4)当样品跑到底部2cm处,关闭电源.7、撬玻片1)刀片不伸入过深.刀片平行于玻片,稍用力.2)将没有硅化剂的无耳玻片放于水盘中,还有梳子.3)清理琼脂胶,放于烧杯中.4)胶玻片放于盘中,银染.13.    2、T

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