镍柱纯化原理及方法

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1、镍柱亲和层析亲和层析的原理：利用分子间存在特异性的相互作用，它们之间都能够进行专一而又可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。常见具有专一性亲和力的生物分子对：酶：基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗原，病毒，细胞细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞文献将被固定在色谱基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。一般载体采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等

2、。咪唑环：是1，3二氮杂戊环，英文名是Imidazole,如果在第一位或第三位上的氮原子上去掉那个氢原子所剩余的部份，就叫咪唑基。就是咪唑上去掉一个和氮原子直接相连的氢原子后剩下的部分5组氨酸的性质：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。金属离子：Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。镍

3、离子：有六个螯合价位，通常将镍柱分为了Ni-NTA和Ni-IDA。Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此Ni-IDAAgarose结合作用力要比Ni-NTAAgarose强，在同样条件下Ni-IDAAgarose的载量要比Ni-NTA高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTA更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。因此需要根据不同的纯化条件选择纯化所需的镍柱，以达到纯化的最佳效果。基质：①不溶性的多孔网状结构，渗透性好；②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；③抗微生物和酶的

4、侵蚀；④最好为粒径均一的球形粒子；⑤具有亲水性，无非特异性吸附；⑥含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。5例：琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。Sepharose4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。配基：是可以可逆结合特定分子或特定基团的分子，能够通过亲和色谱的方式进行纯化。配基的选择受到两种因素的影响：（1）：配基与目标物的结合必须具有特异性和可逆。（2）：必须具有化学修饰基团，使它吸附在基质上，并且不损害它的活性。间隔臂：目标蛋白质的结合位点位于分子中较

5、深的部位，如果将配基直接偶联到基质上，受到空间位阻的影响，配基不能到达目标蛋白的结合位点，因此与目标蛋白的结合能力低。于是在配基与基质之间插入一个间隔臂可以使结合更加容易。间隔臂使结合最大化的同时要避免非特异性结合。间隔臂的长度是关键，太短，无效;太长，发生非特异性结合。一般规则：偶联的分子量小于1000时使用间隔臂；当大分子量，则不一定要。二硫键：蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间形成，包内蛋白离开细胞后，二硫键常以氧化状态存在。此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使成为线状多肽

6、链。上样方式：（1）直接上样（2）间接上样洗脱方式：（1）pH值洗脱：pH的改变可以改变带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程度，使它们结合位点的亲和性降低。（降低pH的方法）（2)离子强度洗脱：(3)竞争性洗脱：（咪唑）再生：(1)先用强变性剂6M盐酸胍冲洗柱子(2)用水冲洗干净(3)0.2%SDS冲洗柱子(4)用水冲洗干净(5)50%乙醇冲洗柱子(6)用水冲洗干净(7)用100mMEDTA(50mMTris100mMEDTAPH8.0)冲洗柱子(8)用水冲洗干净(9)用100mM硫酸镍孵育柱子(10)20%乙醇中4℃保存5上清缓冲液及配方上清纯化缓

7、冲液配方LysisBuffer50mMTris-HCl；150mMNaCl；20mMImidazole；pH8.0；ElutionBuffer150mMTris-HCl；150mMNaCl；50mMImidazole；pH8.0；ElutionBuffer250mMTris-HCl；150mMNaCl；100mMImidazole；pH8.0；ElutionBuffer350mMTris-HCl；150mMNaCl；300mMImidazole；pH8.0；包涵体缓冲液及配方包涵体纯化缓冲液配方IBLysisBuffer120mMTris；150mM

8、NaCl；2mMEDTA；2mMDTT；1%TritonX-100；PH8.0；IBLysisBuffer2