免疫荧光操作步骤及注意事项

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1、免疫荧光操作步骤及注意事项一.直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。实验步骤1.滴加0.01mol/L，pH7.4的P

2、BS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不时振荡。4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。5.立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+

3、++--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。注意事项1.对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1：20-100之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃

4、30min效果好的多。3.为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。（1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4.一般标本在高压*灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。二.间接免疫荧光法测抗原基本原理染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体（待检标本）

5、加到已知抗原（待检标本）标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体（通常为荧光标记的对应二抗）。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记的二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定被检测抗原。试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸盐缓冲液1份配制。荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS15

6、00ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。实验步骤1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于未知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。2.滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释抗体，覆盖未知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。3.取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记二抗5.

7、将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。6.重复操作3。7.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。8.荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。注意事项1.荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。2.每次试验时，需设置以下两种对照：（1）阴性对照：阴性血清+荧光标记物（需有使用人员自行建立标准）（2）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。3.未知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润