免疫荧光步骤.doc

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1、一．细胞免疫荧光步骤：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。2.4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。3.0.2％TritonX－100通透10分钟，PBS洗三遍。4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗

2、三遍。6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，盖上盖玻片，显微镜下拍照。二．大鼠颈动脉组织做免疫荧光。具体步骤是：1.生理盐水心脏灌注清洗。取颈动脉，预冷的4%甲醛固定过夜后，30%蔗糖PBS沉底。2.OCT包埋，放-20°c，短期内冰冻切片6um，-80°c保存3.取出切片立即0.01MPBS洗5minx3次（下同)5.0.2%PBST(TritonX－100)室温通透8min，PBS洗3次6.5%正常驴血清+0.02%

3、PBST室温封闭30min(二抗是驴来源)7.吸掉血清，直接加一抗0.02%PBST液(1:500)，4°c过夜8.室温复温15min，PBS洗9.加二抗，37°c恒温箱孵育50min10.直接加DAPI孵育10min11.摇床PBS洗10minx3次12.甘油封片，共聚焦拍照。