细胞免疫荧光实验步骤.doc

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1、细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1.在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；3.0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4.PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；5.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；第二天：6.加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀

2、释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。7.复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST5min×4次洗去多余的DAPI；8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。细胞免疫荧光步骤 1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右 2.给药处理24h。 3.PBS洗三遍。 4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三

3、遍，每次5min，摇床。（避光） 5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。 6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。 7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。 8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光） 9.回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。 10.0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。（避光） 11. PBS洗三遍，每次5min，摇

4、床。 12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。 All steps forIF1)    Remove culture medium and fix cells (a common fixative is 4% formaldehyde in PBS, for 15 minutes) 2)    Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical) 3)    Permeabilize the cells (a common permeabilizatio

5、n reagent is 0.2% Triton X-100 in PBS for 30 minutes) 4)    Wash well in PBS 5)    (optional:  Block for non-specific dye binding using the Image-iT FX Image Enhancer Solution, I36933) 6)    Block for non-specific antibody binding 30-60 minutes (a common blocking solution wo

6、uld be 3-6% bovine serum albumin / 5% normal goat serum / PBS, or commercial blocking reagents like our BlockAid, product B10710) 7)    Incubate in primary antibody for 30-60 minutes, in blocking solution or overnight at 4 degrees (antibody concentrations vary, but usually b

7、etween 0.5-10ug/mL) 8)    Wash well in PBS 9)    Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 3-6% bovine serum albumin / PBS  (a good starting antibody concentration is 5 ug/mL) 10) Wash well in PBS 11) Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306) 12) Mount in 

8、appropriate mounting medium (for fluorescent secondaries, a good antifade s